High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Das übergeordnete Ziel dieses Klonierungs- und Transformationsverfahrens besteht darin, CRISPR-Vektoren effizient herzustellen und mutierte Tomatenwurzeln mit Gen-Knockout zu erzeugen, die in funktionellen genomischen Studien eingesetzt werden können. Diese Methode ist ein nützliches Werkzeug im Bereich der Pflanzengenomik, da sie eine große Anzahl von Knockout-Mutanten erzeugen kann, die für eine Vielzahl von Wurzelprozessen verwendet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der Klonierungsschritt in einem einzigen Arbeitsschritt durchgeführt werden kann, wodurch die gewünschten Materialien innerhalb weniger Wochen erhalten werden können.

Entwerfen Sie zunächst gRNA-Oligos, die den GN19-Abschnitt der Zielmotife enthalten, flankiert von den fünf- und dreifach 20 Nukleotiden langen Sequenzen, die für die DNA-Assembly erforderlich sind. Verdauen Sie ein bis fünf Mikrogramm des P201N-Caznin-Plasmids mit dem Restriktionsenzym Spe1 bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Nach der Säulenaufreinigung des Verdauungsansatzes gemäß den Herstelleranweisungen in 15 Mikrolitern 10 Millimolar Tris-HCl resuspendieren.

Quantifizieren Sie die Menge an DNA mittels UV-Spektrophotometrie. Führen Sie einen zweiten Verdau mit dem Restriktionsenzym Swa1 bei 25 Grad Celsius für zwei Stunden durch. Überprüfen Sie 100 bis 200 Nanogramm auf einem 0,8-prozentigen Agarosegel, um eine vollständige Verdauung zu bestätigen.

Ein korrekt verdauter Plasmid weist eine einzelne Bande bei 14.313 Basenpaaren auf. Um den Promotor von Medicago truncatula per PCR zu amplifizieren, verwenden Sie sechs Promotor- und Scaffold-DNAs aus dem pUCK-gRNA-Shuttleplasmid. Verwenden Sie die Primer Swa1 sowie Mtu6F und MTU6R sowie Scaffold F und Scaffold R in Spe1 mit einer hochfidelitäts-Polymerase.

Visualisieren Sie drei Mikroliter-Aliquots der PCR-Produkte in einem einprozentigen Agarosegel, um die Amplifikation zu bestätigen. Das MTU6-Amplicon beträgt 377 Basenpaare, und das Scaffold-Amplicon beträgt 106 Basenpaare. Reinigen Sie die verbleibenden PCR-Produkte mittels Säulenchromatographie gemäß den Herstelleranweisungen.

Quantifizieren Sie mithilfe der UV-Spektrophotometrie wie zuvor und lagern Sie bei minus 20 Grad Celsius. Suspendieren Sie anschließend den gesamten Inhalt des gRNA-Oligo-Röhrchens in Laborqualitätswasser auf 100 Mikromolar. Geben Sie ein Mikroliter der Oligos zu 500 Mikrolitern 1xNEB-Puffer 2,1 und mischen Sie gründlich.

Programmieren Sie einen Thermocycler mit beheiztem Deckel, der bei 50 Grad Celsius hält. Geben Sie 100 Nanogramm des linearisierten Vektors, 50 Nanogramm des MtU6-Promotors, 12 Nanogramm des Scaffolds und ein Mikroliter verdünntes gRNA-Oligo in Wasser auf ein Endvolumen von fünf Mikrolitern. Fügen Sie fünf Mikroliter 2X High-Fidelity-DNA-Assembly-Mastermix hinzu.

Gut mischen und kurz zentrifugieren. Die Reaktion 60 Minuten im Thermocycler bei 50 Grad Celsius inkubieren. Nach der einstündigen Inkubation bei 50 Grad Celsius die Reaktion auf Eis stellen und anschließend zwei Mikroliter verwenden, um kompetente E. coli-Zellen mit Standardmethoden zu transformieren.

Die Transformation auf LB-Agar, der mit 50 Milligramm pro Milliliter Kanamycin ergänzt wurde, ausplattieren und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Kolonien mittels PCR mit den Primern StUb3p 218R und 1Sce1R screenen. Ein Aliquot der verbleibenden DNA-Assemblierungsreaktion mit Wasser im Verhältnis 1:5 verdünnen und einen Mikroliter als positiven Kontrollwert für den Koloniescreen verwenden.

Schließen Sie außerdem ein Nanogramm des zirkulären P201N-Casnine-Plasmids als Kontrolle ohne Insert ein. Nach der PCR-Amplifikation unter Verwendung der im schriftlichen Teil des Protokolls angegebenen Parameter visualisieren Sie das PCR-Produkt in einem einprozentigen Agarosegel. Korrekte Insertionen weisen ein Band bei 725 Basenpaaren auf, während Vektoren ohne Insert ein Band bei 310 Basenpaaren aufweisen.

Züchten Sie positive Kolonien über Nacht bei 37 Grad Celsius in LB-Can50-Flüssigkulturen. Am nächsten Tag reinigen Sie die Plasmide mithilfe eines Plasmidreinigungs-Kits gemäß den Herstelleranweisungen. Nach der Sanger-Sequenzierung der gereinigten Plasmide mit dem Primer StuB3P218R vergleichen Sie die Chromatogramme mit den Sequenzen des MtU6-Promotors, des Zielbereichs und des Scaffolds, um sicherzustellen, dass während des Klonens keine Fehler eingeführt wurden.

Führen Sie einen diagnostischen Schnitt durch, indem Sie ein Mikrogramm Plasmid mit EcoR5 und Sti1 verdauen. Bei der Visualisierung an einem 0,8 %igen Agarosegel sollte dieses Bandmuster sichtbar sein. Transformieren Sie abschließend die Plasmide in den Agrobacterium rhizogenes-Stamm ARqua1, indem Sie ein Mikroliter der Plasmidpräparation zu 50 Mikrolitern elektrokompententer Zellen hinzufügen und mittels Elektroporation in einer 1-mm-Küvette behandeln.

Gebe etwa 500 Mikroliter SOC-Medium hinzu und schüttele bei 28 Grad Celsius zwei Stunden lang. Danach auf LB-Can50-Platten ausplattieren und zwei Tage bei 28 Grad Celsius kultivieren. Beginnen Sie diesen Abschnitt des Verfahrens, indem Sie Tomatensamen durch 20 Prozent Haushaltsbleiche unter ständigem Mischen 15 Minuten lang sterilisieren.

Überführen Sie die Samen anschließend in eine laminare Luftströmungskabine. Entfernen Sie die Bleichlösung und waschen Sie die Samen dreimal mit steriler Laborqualitätswasser. Impfen Sie 30 Samen in eine GA7-Schale aus, die halbe MS-Medien enthält.

Lassen Sie die Samen etwa zwei Tage im Dunkeln keimen. Sobald die Samen gekeimt sind, stellen Sie die GA7-Schachteln ins Licht. Am Tag vor der Transformation streichen Sie A.rhizogenes-Kulturen auf festem LB, das Can50 enthält, und lassen sie über Nacht bei 28 Grad Celsius wachsen. Am Tag der Transformation arbeiten Sie im laminar flow hood und geben 25 Mikroliter Acetosyringon zu 50 Millilitern eines halben MS hinzu, wobei sechs Milliliter in jedes Kulturrohr gefüllt werden.

Verwenden Sie eine gebogene 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um A.rhizogenes-Zellen von der Platte abzukratzen, und resuspendieren Sie sie in sechs Milliliter der halben MS-Flüssigkeit. Vortexen Sie das Gefäß, um die Zellen vollständig zu resuspendieren. Nach dem Resuspendieren der Zellen aus jedem Vektor nehmen Sie ein Milliliter der Zellen und messen die optische Dichte bei einer festen Wellenlänge von 600 Nanometern.

Geben Sie zwei Milliliter der halben MS-Flüssigkeit in eine Petrischale mit einem sterilen Filterpapier. Entfernen Sie die Keimblätter von den Sämlingen und legen Sie sie auf das angefeuchtete Filterpapier. Sobald alle Keimblätter gesammelt wurden, schneiden Sie das distalste Zentimeterstück von den Keimblättern ab, sodass Keimblattstücke mit zwei Schnittenden entstehen.

Fügen Sie die Ex-Pflanzen den A.rhizogenes-Lösungen hinzu und mischen Sie sie. Inkubieren Sie 20 Minuten lang mit gelegentlichem Umstülpen. Während der A.rhizogenes-Inkubation legen Sie für jeden Konstrukt-Transformanden ein Filterpapier in eine Petrischale.

Legen Sie außerdem eine halbe MS-Festkultur ohne Antibiotika im laminaren Flusswerk trocknen. Entnehmen Sie die Keimblätter mit sterilen Pinzetten aus der A.rhizogenes-Lösung und legen Sie sie auf trockenes Filterpapier. Decken Sie sie mit einem Petrischalen-Deckel ab, um sicherzustellen, dass die Gewebe während der Fortsetzung zur nächsten Transformation nicht austrocknen.

Als Nächstes die Keimblätter auf dem Filterpapier abtupfen und mit der abaxialen Seite nach oben auf ein halbes MS-Medium übertragen. Die Platten mit chirurgischem Klebeband umwickeln und zwei Tage lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mitkultivieren. Nach der Mitkultivierung die Keimblätter mit der abaxialen Seite nach oben in das supplementierte halbe MS-Medium überführen.

Mit chirurgischem Tape umwickeln. Die Kulturen unter fluoreszierendem Licht bei Raumtemperatur mit einer 16-stündigen Lichtperiode pflegen. Nach eineinhalb bis zwei Wochen mit sterilen Pinzetten und einem Skalpell Wurzeln, die mindestens zwei Zentimeter lang sind, von den Keimblättern abschneiden und auf Ticarcillin/Clavulansäure- und Kanamycin-supplementiertes halbes MS-Medium übertragen.

Überführen Sie zehn bis 15 Wurzeln auf eine einzelne Petrischale. Markieren Sie die Position der Wurzelspitzen mit einem Stift. Mit chirurgischem Klebeband umwickeln und im Kulturraum aufbewahren.

Nach einer Woche sind transformierte Wurzeln sichtbar, die auf dem Selektionsmedium wachsen. Gewinnen Sie eine Teilprobe der transformierten Wurzeln zur DNA-Extraktion, wobei die bevorzugte DNA-Extraktionsmethode angewendet wird. Behaarte Wurzeln sind 11 Tage nach der Transformation an den Keimblättern erkennbar.

Die Wurzeln werden etwa eine Woche lang auf einer Ticarcillin/Clavulansäure- und Kanamycin-supplementierten halben MS-Medien ausgewählt. Graue Balken zeigen die Position der Wurzelspitzen zum Zeitpunkt des Ausstrichs an. Dies ist ein Beispiel für das Klonen und Sequenzieren von PCR-Produkten zur Bestimmung von DNA-Mutationen mit zwei verschiedenen Genzielen in vier verschiedenen behaarten Wurzelereignissen.

Die graue Box bezeichnet die GN20 GG-Zielsequenz und Delta gibt den MutationsTyp an. Die Anzahl der Klone mit der angegebenen Mutation ist rechts dargestellt. Dies ist ein Beispiel für ein Polyacrylamidgel zur Bestimmung von DNA-Mutationen.

Große Deletionen und Heteroduplex-Banden weisen auf das Vorhandensein von DNA-Mutationen in den Zielsequenzen hin. Sechs von zwölf unabhängigen Ereignissen wurden als Mutationen bewertet, wie durch das Delta-Symbol angegeben. WT steht für die Wildtyp-Kontrolle und NT für die Kontrolle ohne Templat.

Wenn die Methode einmal beherrscht ist, können zehn bis hundert CRISPR-Vektoren innerhalb einer einzigen Woche hergestellt und Gruppierungen von Ausgangsmaterialien innerhalb weniger Wochen erhalten werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, jegliches verbleibende Agrobacterium zu entfernen und sein Wachstum zu hemmen. Ein Überwachsen durch Agrobacterium hemmt das Wachstum und tötet jegliches Wurzelmaterial ab.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man CRISPR-Vektoren mithilfe der DNA-Assembly erzeugt und wie man diese Vektoren unter Verwendung eines Modellsystems mit behaarten Wurzeln und Tomate testet.