High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Das übergeordnete Ziel dieses Klonierungs- und Transformationsverfahrens ist es, effizient CRISPR-Vektoren zu generieren und mutierte Tomatenwurzeln auszuschalten, die in funktionellen genomischen Studien verwendet werden können. Diese Methode ist ein nützliches Werkzeug im Bereich der Pflanzengenomik, da sie eine große Anzahl von Knockout-Mutanten erzeugen kann, die in einer Vielzahl von Wurzelprozessen verwendet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Klonierungsverfahren in einem einzigen Schritt durchgeführt werden kann, wodurch die Gruppenmaterialien in nur wenigen Wochen gewonnen werden können.

Zunächst wird das Design von RNA- oder gRNA-Oligos so gestaltet, dass sie den GN19-Teil der Zielmotive enthalten, flankiert von den fünf Prime- und drei Prime-20-Nukleotidsequenzen, die für die DNA-Assemblierung erforderlich sind. Verdauen Sie zwei Stunden lang ein bis fünf Mikrogramm P201N-Caznin-Plasmid mit dem Restriktionsenzym Spe1 bei 37 Grad Celsius. Nach der Säulenreinigung des Aufschlusses gemäß den Anweisungen des Herstellers wird in 15 Mikrolitern 10 millimolare Trs HCL erneut suspendiert.

Quantifizieren Sie die Menge an DNA durch UV-Spektrophotometrie. Führen Sie einen zweiten Verdau mit einem Restriktionsenzym Swa1 bei 25 Grad Celsius für zwei Stunden durch. Überprüfen Sie 100 bis 200 Nanogramm auf einem Nullkomma-Agarosegel von acht Prozent, um die vollständige Verdauung zu bestätigen.

Ein korrekt verdautes Plasmid hat eine einzelne Bande bei 14.313 Basenpaaren. Zur PCR-Amplifikation der Medicago-Truncatula werden sechs Promotor- und Gerüst-DNAs aus dem Puck-gRNA-Shuttle-Plasmid verwendet. Verwenden Sie die Grundierungen Swa1 und Mtu6F und MTU6R sowie das Gerüst F im Spe1-Gerüst R in einer Polymerase mit hoher Genauigkeit.

Visualisieren Sie drei Mikroliter-Aliquats von PCR-Produkten auf einem Ein-Prozent-Agarose-Gel, um die Amplifikation zu bestätigen. Das MTU6-Amplikon besteht aus 377 Basenpaaren und das Gerüst-Amplikon aus 106 Basenpaaren. Säulenreinigung der restlichen PCR-Produkte gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Wie bisher mittels UV-Spektrophotometrie quantifizieren und bei minus 20 Grad Celsius lagern. Als nächstes resuspendieren Sie das gesamte Röhrchen mit gRNA-Oligos auf 100 Mikromolar in Wasser in Laborqualität. Geben Sie einen Mikroliter der Oligos zu 500 Mikrolitern 1xNEB-Puffer zwei Komma eins und mischen Sie gut.

Programmieren Sie einen Thermocycler mit beheiztem Deckel für eine Temperatur von 50 Grad Celsius. Kombinieren Sie 100 Nanogramm des linearisierten Vektors, 50 Nanogramm des MtU6-Promotors, 12 Nanogramm Scaffold und einen Mikroliter verdünntes gRNA-Oligo in Wasser zu einem Endvolumen von fünf Mikrolitern. Fügen Sie fünf Mikroliter 2X High Fidelity DNA Assembly Mastermix hinzu.

Gut mischen und schleudern. Inkubieren Sie die Reaktion 60 Minuten lang im 50 Grad Celsius Thermocycler. Nach der Stunde bei 50 Grad Celsius die Reaktion auf Eis legen und dann zwei Mikroliter verwenden, um kompetente E.Coli-Zellen mit Standardtechniken zu transformieren.

Die Umwandlung auf LB-Agar mit 50 Milligramm pro Milliliter Kanamycin ergänzen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Screening der Kolonien mittels PCR mit den Primern StUb3p 218R und 1Sce1R. Ein Alequat der verbleibenden DNA-Assemblierungsreaktion wird mit Wasser eins bis fünf verdünnt und ein Mikroliter als Positivkontrolle für das Koloniescreening verwendet.

Fügen Sie auch ein Nanogramm zirkuläres P201N-Casnin-Plasmid als No-Insert-Kontrolle hinzu. Nach der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Parameter, die im schriftlichen Teil des Protokolls enthalten sind, visualisieren Sie das PCR-Produkt auf einem einprozentigen Agarosegel. Korrekte Einfügungen haben ein gebändertes 725er Basenpaar und Vektoren ohne Einsätze haben ein 310er Basenpaarband.

Züchten Sie positive Bienenvölker in LB Can50 Flüssigkulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag reinigen Sie die Plasmide mit einem Plasmid-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach der Sanger-Sequenzierung der gereinigten Plasmide mit dem StuB3P218R-Primer richten Sie die Chromatogramme an den MtU6-Promotor-, Target- und Gerüstsequenzen aus, um sicherzustellen, dass während der Klonierung keine Fehler aufgetreten sind.

Führen Sie einen diagnostischen Verdau durch, indem Sie ein Mikrogramm Plasmid mit EcoR5 und Sti1 verdauen. Wenn man es auf einem Nullpunkt-Acht-Agarose-Gel visualisiert, sollte dieses Streifenmuster zu sehen sein. Transformieren Sie schließlich die Plasmide in den Agrobacterium rhizogenes-Stamm ARqua1, indem Sie einen Mikroliter des Plasmidpräparats zu 50 Mikrolitern elektrokompetenter Zellen hinzufügen und in einer Ein-Millimiter-Küvette elektroporieren.

Fügen Sie etwa 500 Mikroliter SOC-Medien hinzu und schütteln Sie es zwei Stunden lang bei 28 Grad Celsius. Dann auf LB Can50 Platten anrichten und zwei Tage lang bei 28 Grad Celsius anbauen. Beginnen Sie diesen Abschnitt des Verfahrens, indem Sie Tomatensamen 15 Minuten lang in 20 Prozent Haushaltsbleiche unter ständigem Mischen sterilisieren.

Übertragen Sie dann die Samen in eine Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie das Bleichmittel und waschen Sie es dreimal in sterilem Wasser in Laborqualität. Füllen Sie 30 Samen in eine GA7-Box, die eine Hälfte MS Media enthält.

Lassen Sie es etwa zwei Tage im Dunkeln keimen. Sobald die Samen gekeimt sind, stellen Sie die GA7-Boxen ans Licht Am Tag vor der Transformation, streichen Sie A.rhizogenes-Kulturen auf festem LB, das Can50 enthält, aus und wachsen Sie über Nacht bei 28 Grad Celsius. Am Tag der Transformation in der Laminar-Flow-Haube 25 Mikroliter Acetosyringon zu 50 Millilitern einer halben MS hinzufügen und sechs Milliliter in jedes Kulturröhrchen gießen.

Verwenden Sie eine gebogene 200-Mikroliter-Spitze, um A.rhizogenes-Zellen von der Platte zu kratzen und in den sechs Millilitern einer halben MS-Flüssigkeit zu resuspendieren. Wirbeln Sie das Rohr ein, um die Zellen vollständig zu resuspendieren. Nachdem Sie die Zellen von jedem Vektor resuspendiert haben, nehmen Sie einen Milliliter Zellen und messen Sie die optische Dichte bei einer festen Wellenlänge von 600 Nanometern.

Geben Sie zwei Milliliter einer halben MS-Flüssigkeit in eine Petrischale mit einem sterilen Filterpapier. Schneiden Sie die Keimblätter aus den Sämlingen heraus und legen Sie sie auf das angefeuchtete Filterpapier. Wenn alle Keimblätter gesammelt sind, schneide das am weitesten entfernte Stück einen Zentimeter von den Keimblättern ab, so dass Keimblattstücke mit zwei abgeschnittenen Enden entstehen.

Die Ex-Pflanzen zu A.rhizogenes Lösungen geben und mischen. 20 Minuten lang inkubieren und gelegentlich umdrehen. Während der A.rhizogenes-Inkubation fügst du für jede Konstrukttransformation ein Stück Filterpapier in eine Petrischale hinzu.

Legen Sie außerdem eine Hälfte MS-Feststoffe ohne Antibiotika in die Laminar-Flow-Haube zum Trocknen. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um Keimblätter aus der A.rhizogenes-Lösung zu schöpfen und auf trockenes Filterpapier zu legen. Mit einem Petrischalendeckel abdecken, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht austrocknet, während es zur nächsten Transformation übergeht.

Tupfen Sie anschließend Keimblätter auf das Filterpapier und übertragen Sie die abaxiale Seite auf ein halbes MS-Medium. Wickeln Sie die Platten mit chirurgischem Klebeband ein und kultivieren Sie sie zwei Tage lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach der Co-Kultivierung Keimblätter mit der abaxialen Seite nach oben in ein ergänztes halbes MS-Medium überführen.

Mit chirurgischem Klebeband umwickeln. Bewahren Sie die Kulturen unter Leuchtstofflampen bei Raumtemperatur mit einer 16-stündigen Fotoperiode auf. Nach einem Komma fünf bis zwei Wochen verwenden Sie eine sterile Pinzette und ein Skalpell, um mindestens zwei Zentimeter lange Wurzeln aus den Keimblättern herauszuschneiden und übertragen Sie sie auf Ticarcillon/Clavulanatsäure und Kanamycin, die eine Hälfte des MS-Mediums ergänzten.

Zehn bis 15 Wurzeln auf einen einzigen Teller geben. Markieren Sie die Position der Wurzelspitzen mit einem Marker. Mit chirurgischem Klebeband umwickeln und im Kulturraum aufbewahren.

Nach einer Woche sieht man, dass die Transformationswurzeln auf den selektiven Medien wachsen. Ernten Sie eine Teilprobe transformierter Wurzeln für die DNA-Extraktion mit der bevorzugten DNA-Extraktionsmethode. 11 Tage nach der Transformation kann man sehen, wie behaarte Wurzeln aus Keimblättern hervortreten.

Die Wurzeln werden mit Ticarcillon/Clavulanatsäure und Kanamycin selektiert, die etwa eine Woche lang eine halbe MS-Medien supplementierten. Graue Balken kennzeichnen die Position der Wurzelspitzen zum Zeitpunkt der Beschichtung. Dies ist ein Beispiel für die Klonierung und Sequenzierung von PCR-Produkten zur Bestimmung von DNA-Mutationen mit zwei verschiedenen Genzielen in vier verschiedenen Haarwurzelereignissen.

Das graue Kästchen zeigt die GN20 GG-Zielsequenz an und Delta zeigt die Art der Mutation an. Die Anzahl der Klone mit der angegebenen Mutation ist rechts dargestellt. Dies ist ein Beispiel für ein Polyacrylamid-Gel zur Bestimmung von DNA-Mutationen.

Große Deletionen und Heterduplex-Banden weisen auf das Vorhandensein von DNA-Mutationen an den Zielsequenzen hin. Sechs von 12 unabhängigen Ereignissen wurden als Mutanten gewertet, wie durch das Delta-Symbol angezeigt. WT gibt das Wildtype-Steuerelement und NT das Steuerelement ohne Vorlage an.

Einmal gemeistert, können Dutzende bis Hunderte von CRISPR-Vektoren in einer einzigen Woche hergestellt werden, und Trendulate Group Materials können in wenigen Wochen erhalten werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, das Wachstum von Agrobacterium-Resten zu entfernen und zu hemmen. Das übermäßige Wachstum von Agrobacterium hemmt und tötet jegliches Wurzelmaterial.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man CRISPR-Vektoren mithilfe der DNA-Assemblierung generiert und wie man diese Vektoren mit einem haarigen Wurzelmodellsystem und einer Tomate testet.