Name: Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Lernen Sie die Induktion von experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen zur Untersuchung multiplier Sklerose. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Immunzellverteilung und Zytokinexpression in verschiedenen Geweben mittels Durchflusszytometrie und quantitativer PCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde gefördert durch das Graduiertenkolleg Translationale Forschung Innovation - Pharma (TRIP) der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (EKFS) und durch die Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" des Landes Hessen.

ETHIK STATEMENT: Unsere experimentellen Verfahren genehmigt werden von der Ethikkommission des Regierungspräsidiums Darmstadt (Deutschland) und den nationalen und europäischen Vorschriften bestätigen. Alle Anstrengungen wurden unternommen, das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der verwendeten Tiere zu verringern. 1. EAE Modell <ol><li> Die Induktion des EAE-Modell <ol><li> Verwenden 10- bis 13-Wochen alten weiblichen 129S4 / SvJae × C57BL / 6-Mäuse zur Induktion von EAE. </li><li> Geben die Mäuse eine subkutane Injektion in die oberen und unteren Rücken des enzephalitogenen MOG 35-55 (Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein) Peptid (200 ug), emulgiert in 200 &amp; mgr; l komplettes Freund`s Adjuvans (CFA) , das 400 &amp; mgr; g Mycobacterium tuberculosis. Anmerkung: Als negative, nicht-krankheitsauslösenden Scheinkontrolle, unvollständiges Freund&#39;sches Adjuvans Mycobacterium tuberculosis, in der gleichen Menge und dem gleichen Weg kann verwendet werden. </li><li> TherENach ​​und nochmals 24 Stunden später, geben die Mäuse eine intraperitoneale Injektion von Pertussis-Toxin (insgesamt 0,2 &amp; mgr; g, verdünnt in 200 &amp; mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung, PBS). Verwenden Sie unbehandelte Mäuse als Kontrollgruppe, in der Lage sein mit gesunden Tieren erkrankten zu vergleichen. Anmerkung: Es ist auch möglich, EAE zu induzieren mit 200-300 ug MOG 35-55 Peptid, 300-500 &amp; mgr; g Mycobacterium tuberculosis in CFA und 0,2-0,3 &amp; mgr; g Pertussis - Toxin in einem Volumen von 0,1-0,2 ml pro Injektion. </li><li> Ab einer Woche nach der Injektion examine Mäuse täglich auf klinische Symptome (siehe Schritt 1.2.1) Anmerkung: Der Tag des Krankheitsanfalls variiert in verschiedenen Experimenten, aber unter den in unserem Labor, dies ist etwa Tag 11 und somit hier Tag 14 wird definiert als 3 Tage nach dem Ausbruch der Krankheit. Alle Mäuse in der vorliegenden Studie entwickelten klinischen Symptome. </li></ol></li><li> Scoring der Mäuse <ol><li> Klassifizieren der klinischen Symptome von klinischen Scores wie folgt:0) keine Anzeichen, 0,5) distale Lähmung des Schwanzes, 1) vollständige Lähmung des Schwanzes, 1.5) schlaffer Schwanz und mild Schwäche der Hinterbeine, 2) schlaffer Schwanz und schwere Schwäche der Hinterbeine, 2.5) schlaffer Schwanz und Lähmung ein Hinterbein, 3) schlaffer Schwanz und Lähmung beider Hinterbeine, 3.5) Lähmung beider Hinterbeine und Schwäche eines Vorderschenkel (Mäuse diese Punktzahl zu erreichen wurden eingeschläfert, mit den lokalen ethischen Richtlinien im Einklang). </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Einzelzellen für die Durchflusszytometrie-Analyse Hinweis: Die Antikörpermischung besteht aus 1 ul CD45-Vioblue, 2 ul CD8-eFluor650, 0,5 ul CD11b-eFluor605, 0,5 ul F4 / 80-PE-Cy7, 1 &amp; mgr; l CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 &amp; mgr; l CD11c -AlexaFluor700, 1 ul CD19-APC-H7 und 1 ul Ly6G-APC-Cy7. Hinweis: Wenn Sie nehmen Blut, Lymphknoten, Milz und Rückenmark dann die Prozedur ist wie folgt: Die Mäuse sind tief mit einer Kombination aus isofl narkotisiertUrane (2% in Carbogen pro Minute) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht). Weiter, um den Brustkorb zu öffnen, um das Blut mit einem intrakardialer Stick entfernen und die Mäuse intrakardial mit kaltem PBS perfuse. Dann entfernen Sie Knoten die Lymphe von Milz und schließlich das Rückenmark. Wenn Sie die Mäuse nicht intrakardial perfuse müssen dann die Mäuse durch Luxation des Halses unter tiefer Narkose einschläfern. <ol><li> Isolation von Splenozyten <ol><li> Anästhesieren Mäusen mit einer Kombination von Isofluran (2% in Carbogen pro Minute) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht). </li><li> Wet Schnittbereich mit 80% Isopropanol eine Kontamination mit den Haaren zu vermeiden und den Thorax in Längsrichtung zu öffnen, ohne tiefere Gewebe Punktierung mit einer Schere. </li><li> Perfuse Mäuse intrakardial mit kaltem PBS pH 7,0 23. Hinweis: Die Milz im linken superior Bauch unter dem Brustkorb befindet. Wenn nur die Milz untersucht werden, dieses Organ kann vor Perfusion entfernt werden, um zu retain alle Zelltypen von Interesse. </li><li> Entfernen Sie die Milz und schneiden etwa 1/8 aus und wiegen. Lagern Sie die Probe in PBS auf Eis. </li><li> Quetschen das Milzgewebe durch ein 70 um Mesh Sieb (angeordnet über einem 50 ml Röhrchen), mit dem Kolben einer 2 ml Spritze. </li><li> Waschen Sie das Gitter mit 5 ml PBS. Zentrifuge bei 1.800 × g für 3 min. Das Pellet in 500 &amp; mgr; l Lyse-Lösung. Hinweis: In dieser Phase kann es notwendig sein, um eine Differentialzelle machen zählen, wenn später eine alternative FACS-Analyseverfahren verwendet wird, das verwendet keine Perlen (siehe Abschnitt 3). </li><li> Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) und fügen 500 ul PBS. Zentrifuge für 6 min bei 650 xg bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt mit 500 ul PBS. Überstand verwerfen, Zellpellet in 100 ul 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS, fügen Sie 2 ul Fc-Rezeptor-1 (FcRI-) Blocking-Puffer und Inkubation für 15 min bei RT im Dunkeln. </li><li> In 13 ul einetibody Mischung, Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln, 500 &amp; mgr; l PBS und Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT. Überstand verwerfen. Hinweis: Die Färbeverfahren des Herstellers empfiehlt einen einzigen Wasch, aber zusätzliche Reduzierung der Hintergrundfärbung kann durch gegebenenfalls Wiederholung der Waschschritt ein oder zwei weitere Male erreicht werden. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in 500 &amp; mgr; l PBS (oder möglicherweise zur Proteintrennung Laufpuffer, um potenziell Zell Verklumpen zu reduzieren) und überträgt es cytometry Rohr zum Strömungs. Halten Sie Zellen auf Eis. </li></ol></li><li> Isolierung von Lymphknotenzellen <ol><li> Anästhesieren Mäusen mit einer Kombination von Isofluran (2% in Carbogen pro Minute) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht). </li><li> Wet Schnittbereich mit 80% Isopropanol und öffnen Sie den Thorax längs einer Schere. Perfuse Mäuse intrakardial mit kaltem PBS pH 7,0 23. </li><li> Um den Leistenlymphknoten isolieren, entfernen Sie vorsichtig die Haut im Bereich der hallop und wählen Sie die Lymphknoten vorsichtig aus dem Fettgewebe mit einer Pinzette. Wiegen Sie den Leistenlymphknoten und speichern Sie die Probe in PBS auf Eis. Hinweis: Wir haben Leistenlymphknoten in unseren Studien , weil O`Connor et al. festgestellt , dass eine hohe Zahl von aktivierten Monozyten, Makrophagen, Neutrophile und T - Zellen alle in den Leistenlymphknoten nach EAE Induktions 24 vorhanden waren. </li><li> Drücken Sie den Lymphknoten durch einen 70 &amp; mgr; m-Mesh-Sieb (platziert über einen 50-ml-Röhrchen) mit dem Kolben einer 2-ml-Spritze. </li><li> Waschen Sie das Gitter mit 5 ml PBS. Zentrifuge bei 2.400 × g für 8 min. Zellpellet in 100 ul 0,2% BSA / PBS, fügen Sie 2 ul FcRI- Blocking-Puffer und Inkubation für 15 min bei RT im Dunkeln. </li><li> In 13 ul Antikörpermischung, Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln, 500 &amp; mgr; l PBS und Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT. </li><li> Überstand verwerfen, Zellpellet in 300 ul PBS (oder einen geeigneten Laufpuffer) und übertragenauf eine Durchflusszytometrie Röhre. </li></ol></li><li> Isolierung von Blutzellen <ol><li> In 50 ul 20 mM HEPES bis 50 &amp; mgr; l Blut (stabilisiert mit EDTA) und fügen 500 ul Lyselösung. Inkubieren für 10 min bei RT und fügen 500 ul PBS. Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT. Überstand verwerfen und wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> Zellpellet in 100 ul 0,2% BSA / PBS, fügen Sie 2 ul FcRI- Blocking-Puffer und Inkubation für 15 min bei RT im Dunkeln. </li><li> In 13 ul Antikörpermischung, Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln, 500 &amp; mgr; l PBS und Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT. Überstand verwerfen, Zellpellet in 300 ul PBS und übertragen es auf die Durchflusszytometrie Röhre. </li></ol></li><li> Isolation von Rückenmarkszellen <ol><li> Anästhesieren Mäusen mit einer Kombination von Isofluran (2% in Carbogen pro Minute) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht). </li><li> Wet Schnittbereich mit 80% Isopropanol und öffnen Sie den Thorax längsmit einer Schere. Perfuse Mäuse intrakardial mit kaltem PBS pH 7,0 23. </li><li> Befeuchten Sie den Schnittbereich auf der Rückseite und machen wieder einen Längsschnitt mit einem Skalpell und entfernen Sie die Haut. </li><li> Schneiden Sie den Lenden Teil der Wirbelsäule aus (die die Hinterbeine innervates) und spülen Sie es mit einer PBS-Spritze das Rückenmark zu extrahieren. Schneiden Sie ca. 1/3 der Lendenwirbel aus, wiegen diese und speichern Sie die Probe in PBS auf Eis. </li><li> Zentrifuge bei 250 × g für 2 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, 500 &amp; mgr; l Zellablösung Lösung und HBSS (1: 1). In 3 mg / ml Kollagenase A und 1 Einheit / ml DNase I, decollate die Zellen durch wiederholte nach oben und unten Pipettieren und Inkubation für 30 min unter Schütteln bei 37 ° C bei 400 Umdrehungen pro Minute. Hinweis: Wenn bevorzugt, kann die Zellsuspension durch Dichtegradientenzentrifugation von kontaminierenden Myelin und Zelldebris gelöscht werden, die die Empfindlichkeit der Durchflusszytometrie Messung verbessern kann, wodurch, Hintergrundautofluoreszenz ein Reduktionsd die Anzahl der Ereignisse, die zu erwerb (siehe Abschnitt 3.5). </li><li> Zentrifuge bei 250 × g für 2 min bei RT. Überstand verwerfen, das Pellet in 1 ml 10% fötales Kälberserum (FCS) / Dulbeccos minimal essentiellem Medium (DMEM) und decollate die Zellen erneut durch wiederholte auf und ab Pipettieren. </li><li> Zentrifuge bei 250 × g für 2 min bei RT. Wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml PBS und drücken den Kolben einer 2 ml-Spritze in das Rückenmark durch ein 70 um Mesh Sieb (angeordnet über einem 50 ml Röhrchen). </li><li> Waschen Sie das Gitter mit 4 ml PBS. Zentrifuge bei 1.800 × g für 3 min bei RT. Überstand verwerfen, Zellpellet in 100 ul 0,2% BSA / PBS, fügen Sie 2 ul FcRI- Blockierungsreagenz und Inkubation für 15 min bei RT im Dunkeln. </li><li> In 13 ul Antikörpermischung, Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln, 500 &amp; mgr; l PBS und Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT. </li><li> Überstand verwerfen, suspendieren die Zelle pellet in 500 ul PBS (oder einem geeigneten Laufpuffer) und überträgt es auf die Durchflusszytometrie Röhre. </li></ol></li></ol> 3. Analyse über Durchflusszytometrie <ol><li> Titrieren alle vorher Antikörper optimalen Konzentrationen zu bestimmen , wie durch Olesch et al. 25. </li><li> Verwenden Antikörper-Einfangen Entschädigung Perlen für einfarbige Kompensation Mehrfarbkompensation Matrizen gemäß den Hersteller `s Anweisungen zu erstellen. </li><li> Kontrollieren Sie die Gerätekalibrierung täglich mit speziellen Perlen gemäß den Hersteller `s Anweisungen. </li><li> Unmittelbar vor der Durchflusszytometrie Messung wurden 30 ul absolute Zahl Standard durchflusszytometrischen zu den Zellen hinzu (für die Isolierung siehe Abschnitt 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) absolute Zellzahlen zu bestimmen. Anstelle des Zählens Perlen verwenden, können die Zellen gezählt werden. </li><li> Nehmen Sie Proben (Zellen aus der Milz, Lymphknoten und Blut: 100.000 Ereignisse, Rückenmark: 500.000 Ereignisse) in einem Durchflusszytometer einnd analysieren spezifische Durchflusszytometrie-Software. <ol><li> Öffnen Sie die Durchflusszytometrie Software und fügen Sie fcs 3.0-Dateien durch Drücken der Taste &quot;add Samples&quot;. </li><li> Öffnen Sie die hinzugefügte Datei mit einem Doppelklick. Stellen Sie die Kanäle für die x- und y-Achse. So wählen Sie die Zellpopulationen von Interesse ein Tor erzeugen (siehe Abbildung 4). </li></ol></li></ol> 4. Quantitative PCR-Analyse <ol><li> Isolierung von mRNA und Transkription in cDNA <ol><li> Extrahieren Sie die mRNA von lumbalen Rückenmark (1/3), Milz (1/8) und Leistenlymphknoten durch Phenol-Chloroform und fällt mit Ethanol 26. <ol><li> Hierzu homogenisieren das Gewebe in 1 ml Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Mischung für 10 min inkubieren. In 200 ul Chloroform und Inkubation erneut 10 min. </li><li> Nach einem Zentrifugationsschritt (18.000 xg für 15 min bei 4 ° C), waschen Sie die obere wässrige Phase wird mit 500 &amp; mgr; l Isopropanol und Zentrifuge (18000 × g für 8 min bei 4° C). </li><li> Waschen Sie das Pellet mit 500 ul Ethanol und nach einem Zentrifugationsschritt (18.000 xg für 5 min bei 4 ° C), trocknet das Pellet im Vakuum-Konzentrator (5 min bei 30 ° C). Danach das Pellet in 30 ul Wasser. </li></ol></li><li> Zur Extraktion der mRNA aus Blut, Zentrifuge 500 ul EDTA-stabilisiertes Blut (300 · g 10 min 4 ° C). <ol><li> Nehmen den buffy coat, enthält weiße Blutkörperchen und verdünnt in 1 ml Lyse - Lösung (150 mM NH 4 Cl, 100 mM NaHCO 3, 0,1 mM Na-EDTA pH 7,4). </li><li> Zentrifuge Nach 10 min Inkubation bei RT, die Zellen bei 650 × g für 6 min und danach zweimal waschen mit PBS. </li><li> Extrahieren der mRNA aus weißen Blutkörperchen (WBCs) ein Kit zur RNA-Extraktion unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li><li> Führen cDNA-Synthese ein Kit für die cDNA-Synthese einschließlich zufälliger Hexamere gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Verwenden Sie 200 ng mRNA für das CDNEine Synthese. </li></ol></li><li> Quantitative PCR <ol><li> Um die Menge einer spezifischen mRNA zu quantifizieren, verwendet werden 1 &amp; mgr; l cDNA, 1 &amp; mgr; M Vorwärts / Rückwärts - Primer und einen fluoreszierenden DNA - Bindungsfarbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers 27. Siehe Tabelle 1 für die Sequenzen für die Primer - Sets. Messen Sie die CT-Werte von IL-1β, IL-6, IL-23, IFN &amp; ggr;, TNFa und PPIA (Peptidyl-Prolyl-Isomerase), um eine quantitative PCR-System. </li><li> Zur Bestimmung der relativen mRNA - Expression des Vergleichs CT (cycle threshold) Verfahren 27 verwendet werden . <ol><li> Hierzu CT-Werte der Zielgene zu den Expressionsniveaus von PPIA normalisieren , indem der Mittelwert CT-Wert von PPIA vom Zielgen subtrahieren, wie in früheren Studien beschrieben (Barthelmes et al. 28, Schiffmann et al. 29, Schiffmann et al. 30). Anschließend berechnen die so ΔΔCT-Werte genannt, mit denen, normalisieren die ACt-Werteder Zielgene von EAE Mäuse mit dem Expressionsniveau der Zielgene von unbehandelten Mäusen, wiederum durch den Mittelwert ACt-Wert in der unbehandelten Mäusen aus dem ACt-Wert in EAE Mäuse subtrahieren. </li><li> Um die relative mRNA - Expression des Zielgens zu gewinnen, wird das Verhältnis unter Verwendung der folgenden Formel: 2 - ΔΔct. </li></ol></li></ol></li><li> Testen Sie die Spezifität von jedem Primer. Bestimmung der amplifizierten Fragmentgröße unter Verwendung einer 2% igen Agarosegel 31. Die Fragmentgröße ist in Tabelle 1 gezeigt. </li></ol>

MJP ist Berater von Xellia und Leo Pharmaceuticals.

Die EAE - Modell hier beschrieben hat die meiste Aufmerksamkeit als ein Modell der MS empfangen und in die Prüfung therapeutischer Strategien für MS 32 routinemäßig eingesetzt. Die Maus-Krankheit zeigt viele klinische und histologische Merkmale der MS und wird durch die Induktion von Autoimmunität zu neuronale Antigene verursacht. Die Sensibilisierung gegen Myelin-Antigene ist mit Blut-Hirn-Schranke Dysfunktion assoziiert und dadurch Immunzellinfiltration in das ZNS. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Immunzellen...

Multiple Sklerose (MS) und der entsprechenden Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zeigen, Autoimmun neuroinflammation Veränderungen im zentralen Nervensystem (ZNS). Frühe aktive MS und EAE Läsionen werden durch die Anwesenheit von Immunzellen infiltriert gekennzeichnet. Die Ätiologie von MS ist unbekannt, wird aber häufig von autoreaktiven T-Zellen vermittelt beinhalten die Zerstörung des Myelins betrachtet. Diese autoreaktiver T-Zellen sezernieren pro-inflammatorische Zytokine und Chemokine, die andere Immunzellen anziehen, wie beispielsweise B-Zellen, Monozyten und Neutrophile aus dem Kreislauf. Monozyten differenzieren sich in Makrophagen. Interferon gamma (IFNy) abgesondert von autoreaktiven T-Zelle polarisiert die Makrophagen in pro-inflammatorischen Makrophagen. Die pro-inflammatorischen Makrophagen Freisetzung Zytokine und reaktive Sauerstoffspezies, die Apoptose in Oligodendrozyten fördern. Der Tod der Oligodendrozyten führt zu einer Demyelinisierung. Weiterhin unterscheiden B-Zellen in pLASMA Zellen und Freisetzung Autoantikörper gegen die Myelinscheide, was letztlich zu einer Verschlechterung der Myelin. Der Verlust von Myelin führt zu einer Verschlechterung von Axonen und Nervenzellen und dadurch zur Bildung von Läsionsstellen im ZNS , die das Hauptmerkmal der MS 1 darstellen. In der Peripherie sind T-Zellen und B-Zellen in den Lymphknoten aktiviert, proliferieren sie in der Milz und wandern durch den Kreislauf in das zentrale Nervensystem. Monocyten und Neutrophile proliferieren im Knochenmark und auch durch den Kreislauf in das zentrale Nervensystem zu migrieren. Leukozytenextravasation aus dem Knochenmark, der Milz und der Lymphknoten in das Blut oder aus dem Blut in das ZNS ist ein mehrstufiger Prozess, der von mehreren Faktoren abhängt, einschließlich der molekularen Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und von Chemokinen und Chemokinrezeptoren vermittelte Endothel. Die Produktion von Chemokinen durch verschiedene Zelltypen während der Immun reactio induziert werdenn durch Zytokine wie Tumor - Nekrose - Faktor-α (TNF &amp; agr;), IFN &amp; ggr; und Interleukin-6 (IL-6), die anschließend Immunzellen an den Ort der Entzündung 2,3 rekrutiert. Immunzellen, die eine Untergruppe von Chemokin-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, je nach Zelltyp und Migrationspfad zur Entzündungsstelle. Somit CXCR2, CCR1 und CXCR1 auf reifen Neutrophilen im Knochenmark exprimiert werden und Blut 4 und Bindung seiner Liganden, CXCL2, CCL5 oder CXCL6 bzw. aktiviert Neutrophile und fördert ihre Adhäsion an das Endothel und anschließend, um die Migration der Zellen in das Gewebe 5-9. CCL2 und CCL20 anziehen Monozyten und Th1 / Th17 - Zellen 10, die jeweils CCR2 11 und CCR6 12, zum Ausdruck bringen. CCR1 und CCR5, die von verschiedenen Zelltypen exprimiert, einschließlich T - Zellen, Monozyten und Makrophagen 13 binden CCL3, CCL5 und CCL7 und werden während der MS 14 aufreguliert. CXCR3 wird ausgedrückt auf T-Zellen und bindet CCL9, CCL10 undCCL11 15. Eine Hauptstrategie in der MS-Behandlung ist der Abbau von Immunzellen oder die Verhinderung von Immunzellinfiltration in das ZNS. Daher hat die Blockade von spezifischen Chemokinrezeptoren wurde in EAE untersucht. Antagonismus oder genetische Deletion von CCR1 16, 17 CCR2, CCR7 18 oder CXCR2 19 reduziert EAE Pathologie, während Antagonismus oder genetische Deletion von 20 CCR1, CCR5 20 oder 21 CXCR3 hat die Pathologie nicht reduzieren. Daher ist die Expression von spezifischen Chemokinrezeptoren auf Leukozyten entscheidend für die Infiltration des letzteren in das ZNS und bestimmt den Verlauf der EAE. Die Abreicherung von Immunzellen ist eine wirksame Behandlungsstrategie für MS - Patienten, da infiltriert Immunzellen Cytokine freizusetzen, wie TNFa, IL-6 und IL-1β, welche wiederum, 22 den Entzündungsprozess oder den Abbau von Neuronen fördern. Darüber hinaus auto-reaktiven Th1 Zellen setzen IFNy, die wiederum Makrophagen freizusetzen TNFa, IL-1β und IL-23 stimuliert. Diese Handschrift beschreibt die Induktion von EAE, die Bestimmung der Immunzellverteilung und die Zytokinkonzentrationen (mRNA) in verschiedenen Geweben in EAE-Mäusen. Die Zellen wurden während des Krankheitsverlaufs zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert eine zeitabhängige Überblick über die entzündlichen Prozesse zu schaffen, die schließlich in der ZNS-Läsion Bildung führen.

<table><tbody><tr><td>ABI Prism 7500 Sequenz-Erkennungssystem&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Austin, USA</td><td></td><td>quantitatives PCR-System</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich München, Deutschland</td><td>A6964</td><td>Zellablösungslösung</td></tr><tr><td>CD3-PE-CF594</td><td>BD, Heidelberg, Deutschland</td><td>562286</td><td></td></tr><tr><td>CD4-V500</td><td>BD, Heidelberg, Deutschland</td><td>560782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-eFluor650</td><td>eBioscience, Frankfurt, Deutschland</td><td>95-0081-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-eFluor605</td><td>eBioscience, Frankfurt, Deutschland</td><td>93-0112-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-AlexaFluor700</td><td>BD, Heidelberg, Deutschland</td><td>560583</td><td></td></tr><tr><td>CD19-APC-H7&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Deutschland</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD45-Vioblue&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland</td><td>130-092-910</td><td></td></tr><tr><td>CompBeads</td><td>BD, Heidelberg, Deutschland</td><td>552843</td><td>Kompensationskügelchen</td></tr><tr><td>Kollagenase A</td><td>Sigma Aldrich München, Deutschland</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Zytometrischer absoluter Zählstandard</td><td>Polyscience, Eppelheim, Deutschland</td><td>BLI-580-10</td><td></td></tr><tr><td>Zytometer-Setup und Tracking-Beads&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Deutschland</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich München, Deutschland</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>EAE Kit</td><td>Hooke Laboratories, Lawrence, USA</td><td>EK2110</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7&nbsp;</td><td>BioLegend, Fell, Deutschland</td><td>123114</td><td></td></tr><tr><td>erstes Strang-cDNA-Synthese-Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>K1612</td><td></td></tr><tr><td>Fc-Rezeptor-1-Blockierungspuffer</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometrischer Absolutzahlstandard</td><td>Polyscience, Eppelheim, Deutschland</td><td>580</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software v10&nbsp;</td><td>Treestar, Ashland, USA</td><td></td><td>Durchflusszytometrie-Software</td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Deutschland</td><td></td><td>Durchflusszytometer</td></tr><tr><td>Ly6G-APC-Cy7&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Deutschland</td><td>560600</td><td></td></tr><tr><td>Lysing-Lösung&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Deutschland</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Maxima SYBR Green&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>K0221</td><td>fluoreszierender DNA-Bindungsfarbstoff&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Bausatz&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>74104</td><td>RNA-Extraktionskit</td></tr></tbody></table>

die induktion der experimentellen autoimmunen enzephalomyelitis bei mäusen und die auswertung des krankheitsabhängige verteilung von immunzellen in verschiedenen geweben

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple Sklerose ist vermutlich eine entzündliche Autoimmunerkrankung, die durch Bildung von Läsionen im zentralen Nervensystem (ZNS), die sich in kognitiven und motorischen Beeinträchtigungen charakterisiert ist. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein nützliches Tiermodell der MS, weil es auch durch Bildung von Läsionen im ZNS, motorischen Beeinträchtigungen charakterisiert ist und auch von Autoimmun- und Entzündungsreaktionen angetrieben wird. Einer der EAE - Modellen mit einem Peptid , abgeleitet von dem Myelin - Oligodendrozyten - Protein (MOG) 35-55 in Mäusen induziert. Die EAE Mäuse einen progressiven Krankheitsverlauf zu entwickeln. Dieser Kurs ist in drei Phasen unterteilt: die präklinische Phase (Tag 0 - 9), der Ausbruch der Krankheit (Tag 10 - 11) und der akuten Phase (Tag 12 bis 14). MS und EAE werden durch autoreaktive T-Zellen induziert, die das ZNS infiltrieren. Diese T-Zellen sezer Chemokine und Zytokine, die die Einstellung von weiteren Immunzellen führen. Daher ist die Immunzellverteilung im Rückenmark dährend die drei Krankheitsphasen untersucht. Um den Zeitpunkt der Krankheit hervorheben, an dem die Aktivierung / Proliferation / Anhäufung von T-Zellen, B-Zellen und Monozyten beginnt, die Immunzellverteilung in Lymphknoten, Milz und Blut wurde ebenfalls bewertet. Darüber hinaus sind die Ebenen der mehreren Cytokinen (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFN &amp; ggr;) in den drei Krankheitsphasen bestimmt, Einblick in die Entzündungsprozesse der Krankheit zu erhalten. Zusammenfassend liefern die Daten, die einen Überblick über das Funktionsprofil von Immunzellen während EAE Pathologie.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Übersicht über die verschiedenen Methoden in diesem Artikel beschrieben. 1) Die Mäuse erhalten eine Injektion von MOG 35-55 Antigen und entwickeln erste klinische Symptome nach 10,7 ± 0,3 Tagen 28. Eine repräsentative Krankheitsverlauf der EAE - Mäusen ist in Abbildung 1. 2) verschiedene Gewebe (Milz, Lymphknoten, Lenden - Rückenmark) und Blut werden von der Kontr...

Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Induktion und Bewertung des experimentellen Modells der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zusammen mit der Beurteilung der Immunzellverteilung und der mRNA-Zytokinspiegel in Lymphknoten, Milz, Blut und Rückenmark mittels Durchflusszytometrie bzw. quantitativer PCR in verschiedenen Krankheitsstadien.

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Das übergeordnete Ziel des Modells der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) besteht darin, die Untersuchung der potenziellen molekularen Mechanismen zu erleichtern, die der Entstehung der Multiplen Sklerose zugrunde liegen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Multiplen Sklerose zu beantworten, beispielsweise, in welchem Stadium der Erkrankung Immunzellen das zentrale Nervensystem infiltrieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das EAE-Modell viele der wesentlichen Merkmale der Multiplen Sklerose nachahmt, wie beispielsweise die Demyelinisierung und die Infiltration von Immunzellen.Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis zur Therapie der Multiplen Sklerose, da Medikamente, die mit dieser Methode getestet wurden, bereits für diese Erkrankung zugelassen sind. Im Allgemeinen würden sich Personen, die neu in dieser Methode sind, schwertun, da gründliche Bedingungen berücksichtigt werden müssen, wenn die EAE ausgelöst wird. Die Mäuse müssen in einer stressfreien Umgebung gehalten werden, und ein Pertussis-Toxin sollte frisch hergestellt werden.Die offizielle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Isolierung der Lymphknoten und die Entnahme des Rückenmarks allein anhand einer Beschreibung schwer zu erlernen sind. Beginnen Sie damit, weibliche Mäuse im Alter von 10 bis 13 Wochen subkutan mit 200 Mikrogramm Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein zu injizieren, emulgiert in 200 Mikroliter komplettem Freund-Adjuvans, das 400 Mikrogramm Mycobacterium tuberculosis enthält.Sofort und 24 Stunden später injizieren Sie den Mäusen intraperitoneal 0,2 Mikrogramm Pertussistoxin in 200 Mikrolitern PBS. Es ist entscheidend, dass die Mäuse sowohl an die Handhabung als auch an die experimentelle Umgebung gewöhnt wurden, um Stress zu vermeiden, der die Entwicklung klinischer Symptome verhindern könnte. Eine Woche nach der Injektion untersuchen Sie die Mäuse täglich auf klinische Symptome, wie in der Tabelle beschrieben.Um die durch EAE induzierte Immunzellpopulation in den Lymphknoten zu bewerten, befeuchten Sie zum geeigneten Zeitpunkt nach der Induktion den Inzisionsbereich mit 80 % Isopropanol und entfernen vorsichtig die Haut über dem Hüftbereich. Entfernen Sie mithilfe einer Pinzette den Leistenlymphknoten vorsichtig aus dem Fettgewebe. Anschließend den Lymphknoten wiegen und die Probe in PBS auf Eis legen.Um die Zellen des Rückenmarks zu analysieren, benetzen Sie die Rückseite des Tieres mit Isopropanol und führen mit einem Skalpell einen Längsschnitt entlang der Wirbelsäule durch. Entfernen Sie anschließend die Haut und präparieren Sie den lumbalen Abschnitt der Wirbelsäule, der die Hintergliedmaßen versorgt. Spülen Sie die Wirbelsäule mit einer mit PBS gefüllten Spritze aus, um das Rückenmark zu gewinnen.Nachdem etwa 1/3 des Lendenmarks entfernt wurde, das Rückenmarkfragment wiegen und das Gewebe in PBS auf Eis lagern. Um die immunzelluläre Zusammensetzung der Milz zu analysieren, das Gewebe öffnen, um Zugang zum unteren Bauchraum zu erhalten. Anschließend die Milz entfernen und etwa 1/8 des Gewebes abschneiden.Wiegen Sie das Milzfragment und lagern Sie das Gewebe in PBS auf Eis. Zerreiben Sie dann den Rest des Gewebes mit Hilfe des Kolbens einer 2-mL-Spritze durch ein 70-Mikron-Netzsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen, gefolgt von einer fünf Milliliter PBS-Waschung des Siebs. Zentrifugieren Sie die filtrierten Zellen.Suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Zelllysepuffer und überführen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur waschen Sie die Zellen zwei Mal mit jeweils 500 Mikrolitern PBS. Nach dem zweiten Waschschritt suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern 0,2 % BSA in PBS und geben zwei Mikroliter Fc-Rezeptor-1-Blockierpuffer zu den Zellen hinzu.Nach 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur die Zellen mit 13 µL Antikörper-Cocktail für weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln markieren. Am Ende der Inkubation die Zellen mindestens zweimal mit jeweils 500 µL PBS waschen und das endgültige Pellet in 500 µL frischem PBS resuspendieren. Anschließend die Zellen in ein Durchflusszytometrie-Röhrchen überführen und auf Eis legen.Abschließend, um die Proben mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, vor der Durchflusszytometriemessung direkt 30 Mikroliter eines absoluten Zählstandards für die Durchflusszytometrie zu den Zellen hinzufügen, um die absoluten Zellzahlen zu bestimmen. Anschließend die Proben am Durchflusszytometer analysieren. Wie diese Abbildung veranschaulicht, wird während der akuten Phase der EAE-Induktion ein vorübergehender Anstieg aller Immunzellpopulationen in den Lymphknoten beobachtet.Im Milzgewebe zeigen hingegen nur Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen und neutrophile Granulozyten eine erhöhte Infiltration. Im Blut zeigen alle Immunzellpopulationen eine vorübergehende Zunahme ihres peripheren Vorkommens während der präklinischen Phase, was einer ähnlichen, krankheitsabhängigen Zunahme im lumbalen Rückenmark während der akuten Krankheitsphase entspricht, mit Ausnahme der Monozytenpopulation, die nach dem Eintritt in das Rückenmark vermutlich in Makrophagen differenziert. Hier wird die Gating-Strategie zur Auswertung der verschiedenen Zellpopulationen dargestellt.Die Zellzahlen stehen in Beziehung zur Menge des analysierten Gewebes oder zum Blutvolumen und spiegeln die absolute Zellanzahl wider. In den Lymphknoten ist die Expression von IL-23-mRNA in der präklinischen Phase erhöht, während die Expression von IL-6 abhängig vom Krankheitsverlauf ansteigt. In der Milz steigen die Expression von IL-6 und IL-23 in der präklinischen Phase an, wohingegen die IL-1-beta-mRNA-Expression erst mit dem Auftreten der Erkrankung beeinflusst wird.Im Blut wird ausschließlich die Expression von TNF-alpha-mRNA hochreguliert, und zwar in abhängiger Weise vom Krankheitsverlauf. Im Lendenrückmark werden TNF-alpha, IL-1 beta und Interferon-gamma in der akuten Phase induziert, während IL-6 nur in der Anfangsphase der Erkrankung hochreguliert wird. Wenn das EAE-Modell einmal beherrscht ist, können die anschließende Zellisolation und die Wirkungsanalyse bei zehn Mäusen innerhalb von acht Stunden abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden.Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie Western Blot oder ELISA durchgeführt werden, um die Ergebnisse der mRNA-Expressionsanalyse zu bestätigen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der multiplen Sklerose den Weg, um den Mechanismus der Demyelinisierung im zentralen Nervensystem zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das EAE-Modell induziert und wie Immunzellen isoliert werden, um reproduzierbare Durchflusszytometrie-Ergebnisse zu erhalten.Beachten Sie, dass die Arbeit mit komplettem Freund-Adjuvans äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie Vorsichtsmaßnahmen wie das Anheben der Haut des Mäuschens und die Gewährleistung eines vollständigen Durchdringens der Haut durch die Spritze, während dieser Vorgang durchgeführt wird.

induction-experimental-autoimmune-encephalomyelitis-mice-evaluation

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Induktion und klinischen Scoring von einem Tiermodell der Multiplen Sklerose: chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in DA-Ratten. Die Krankheit, durch die Immunisierung von Ratten mit einer Emulsion, die ganze Ratte Rückenmark und komplettem Freund-Adjuvans induziert, weist klinische Symptome ähnlich der menschlichen Erkrankung.

Induction and Clinical Scoring von chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Das Video zeigt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell durch Injektion einer Kombination aus Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinen und inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis. Das Modell ermöglicht es Forschenden, Krankheitsmechanismen zu untersuchen und therapeutische Interventionen zu testen.

Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

Dieses Video zeigt die Methode zur Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) durch Injektion von Myelin-abgeleiteten Peptiden mit einem Adjuvans, um autoreaktive T-Zellen zu aktivieren, die ins Gehirn wandern. Pertussis-Toxin wird verabreicht, um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass diese T-Zellen und andere Immunzellen in das Gehirn eindringen können. Diese Immunzellen verursachen eine Demyelinisierung, die zu einer gestörten...

Generierung einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

In diesem Video wird ein Mausmodell für Multiple Sklerose mit Hilfe der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) erstellt. Der Maus wird eine Emulsion injiziert, die ein neuronales Peptid und ein Adjuvans enthält, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird, die autoreaktive T-Zellen aktiviert. Darauf folgt eine Injektion von Pertussis-Toxin (PTX), um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass die autoreaktiven T-Zellen das Gehirn infiltrieren können. Diese...

Dieses Protokoll beschreibt, wie bestimmt werden kann, ob pharmakologische Behandlungen für experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis einen ZNS-Schutz als Folge der Unterdrückung der Immunzellinfiltration zeigen oder während des Ansturms der Immunzellinfiltration neuroprotektiv sind.

Die Bestimmung Unterdrückung des Immunsystems gegen ZNS-Schutz für pharmakologische Interventionen im Bereich der Autoimmun- Demyelinisierung

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Induzieren von aktiver experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen dar. Eine Methode zur Isolierung und Charakterisierung der infiltrierten Lymphozyten im Zentralnervensystem (ZNS) wird ebenfalls vorgestellt, um zu zeigen, wie Lymphozyten an der Entwicklung einer CNS-Autoimmunerkrankung beteiligt sind.

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Bis heute sind Protokolle für die gleichzeitige Isolierung aller wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus derselben Maus ein ungedeckter Bedarf. Das Protokoll zeigt ein Verfahren, das in naiven und experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mäusen angewendet werden kann, um komplexe zelluläre Netzwerke während der Neuroinflammation zu untersuchen und gleichzeitig die erforderliche Anzahl von Mäusen zu reduzieren.

Gleichzeitige Isolierung der wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus adulten Autoimmun-Enzephalomyelitis-Mäusen

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis ist eines der am weitesten verbreiteten murinen Modelle der Multiplen Sklerose. Im aktuellen Protokoll werden C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts mit dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinpeptid immunisiert, was hauptsächlich zu einer aufsteigenden Parese des Schwanzes und der Gliedmaßen führt. Hier besprechen wir das Protokoll der EAE-Induktion und -Auswertung.

Modellierung der Multiplen Sklerose bei beiden Geschlechtern: MOG35-55-induzierte experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell für Multiple Sklerose (MS), das mit der menschlichen Krankheit eine robuste humorale Autoimmunreaktion teilt. In dieser Arbeit berichten wir über ein einfaches und flexibles ELISA-Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von EAE-immunisierten Mäusen.

Quantifizierung autoreaktiver Antikörper in Mäusen nach experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Lernen Sie die Induktion von experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen zur Untersuchung multiplier Sklerose. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Immunzellverteilung und Zytokinexpression in verschiedenen Geweben mittels Durchflusszytometrie und quantitativer PCR.

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben (Video) | JoVE Journal

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Weitere Videos entdecken