Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Induktion und Bewertung des experimentellen Modells der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zusammen mit der Beurteilung der Immunzellverteilung und der mRNA-Zytokinspiegel in Lymphknoten, Milz, Blut und Rückenmark mittels Durchflusszytometrie bzw. quantitativer PCR in verschiedenen Krankheitsstadien.

Das übergeordnete Ziel des Modells der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) ist es, die Untersuchung der potenziellen molekularen Mechanismen, die der Entwicklung von Multipler Sklerose zugrunde liegen, zu erleichtern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Multiplen Sklerose zu beantworten, wie zum Beispiel: In welchem Stadium der Erkrankung infiltrieren Immunzellen das zentrale Nervensystem? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das EAE-Modell viele der Hauptmerkmale der Multiplen Sklerose, wie z. B. Demyelinisierung und Infiltration von Immunzellen, nachahmt.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie der Multiplen Sklerose, da Medikamente, die mit dieser Methode getestet wurden, bereits für diese Krankheit zugelassen sind. Im Allgemeinen würden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es gründliche Bedingungen gibt, die bei der Induktion von EAE berücksichtigt werden müssen. Mäuse müssen in einer stressfreien Umgebung gehalten werden, und ein Pertussis-Toxin sollte frisch zubereitet werden.

offizielle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Isolierung der Lymphknoten und die Extraktion des Rückenmarks allein durch Beschreibung schwer zu erlernen sind. Beginnen Sie mit der subkutanen Injektion von 200 Mikrogramm Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein an 10 bis 13 Wochen alte weibliche Mäuse. emulgiert in 200 Mikrolitern des vollständigen Freund-Adjuvans, das 400 Mikrogramm Mycobacterium tuberculosis enthält.

Unmittelbar und 24 Stunden später injizierten Sie den Mäusen intraperitoneal 0,2 Mikrogramm Pertussis-Toxin in 200 Mikroliter PBS. Es ist wichtig, dass Mäuse vor der EAE-Induktion sowohl an die Handhabung als auch an die Versuchsumgebung angepasst wurden, um Stress zu induzieren, der die Entwicklung klinischer Symptome verhindern kann. Eine Woche nach der Injektion untersuchen Sie die Mäuse täglich auf klinische Symptome, wie in der Tabelle beschrieben.

Um die EAE-induzierte Lymphknoten-Immunzellpopulation zu bewerten, befeuchten Sie den Inzisionsbereich zum geeigneten Zeitpunkt nach der Induktion mit 80 % Isopropanol und entfernen Sie vorsichtig die Haut über der Hüftregion. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig den Leistenlymphknoten aus dem Fettgewebe. Wiegen Sie dann den Knoten und legen Sie die Probe in PBS auf Eis.

Um die Zellen des Rückenmarks zu analysieren, befeuchten Sie den Rücken des Tieres mit Isopropanol und verwenden Sie ein Skalpell, um einen Längsschnitt durch die Wirbelsäule zu machen. Entfernen Sie dann die Haut und präparieren Sie den lendenwirbelnden Teil der Wirbelsäule, um die Hintergliedmaßen zu innervieren. Spülen Sie die Wirbelsäule mit einer PBS-gefüllten Spritze, um das Rückenmark zu extrahieren.

Nachdem Sie etwa 1/3 des Lendenmarks entfernt haben, wiegen Sie das Wirbelsäulenfragment und lagern Sie das Gewebe in PBS auf Eis. Um die Milz-Immunzellpopulation zu analysieren, öffnen Sie das Gewebe, um Zugang zum unteren Teil des Bauches zu erhalten. Entfernen Sie als Nächstes die Milz und schneiden Sie etwa 1/8 des Gewebes ab.

Wiegen Sie das Milzfragment und lagern Sie das Gewebe in PBS auf Eis. Verwenden Sie dann den Kolben einer Zwei-ml-Spritze, um den Rest des Gewebes durch ein 70-Mikron-Maschensieb auf einem 50-Milliliter-Röhrchen zu mazerieren, gefolgt von einer Fünf-Milliliter-PBS-Spülung des Siebs. Zentrifugieren Sie die gefilterten Zellen.

Resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Zelllysepuffer und geben Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen nach 10 Minuten bei Raumtemperatur zweimal in 500 Mikrolitern PBS. Nach dem zweiten Waschen resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern 0,2 % BSA in PBS und fügen Sie den Zellen zwei Mikroliter Fc-Rezeptor und einen Blockierungspuffer hinzu.

Nach 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur markieren Sie die Zellen mit 13 Mikrolitern Antikörpercocktail für weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation mindestens zweimal in 500 Mikrolitern PBS und resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 500 Mikrolitern frischem PBS. Anschließend werden die Zellen in ein Durchflusszytometrie-Röhrchen auf Eis überführt.

Um die Proben schließlich durchflusszytometrisch zu analysieren, fügen Sie den Zellen direkt vor der durchflusszytometrischen Messung 30 Mikroliter durchflusszytometrischen absoluten Zählstandard zu, um die absoluten Zellzahlen zu bestimmen. Analysieren Sie dann die Proben auf dem Durchflusszytometer. Wie diese Abbildung zeigt, wird während der akuten Phase der EAE-Induktion ein vorübergehender Anstieg aller Immunzellpopulationen innerhalb der Lymphknoten beobachtet.

In der Milz zeigen jedoch nur Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen und Neutrophile eine vermehrte Infiltration. Im Blut zeigen alle Immunzellpopulationen während der präklinischen Phase eine vorübergehende Zunahme ihrer peripheren Durchblutung, die einer ähnlichen krankheitsabhängigen Zunahme des lumbalen Rückenmarks während der akuten Phase der Erkrankung entspricht, unter Ausschluss der Monozytenpopulation, die sich nach Eintritt in das Rückenmark vermutlich in Makrophagen differenziert. Hier wird die Gating-Strategie zur Bewertung der verschiedenen Zellpopulationen gezeigt.

Die Anzahl der Zellen hängt mit der Menge des analysierten Gewebes oder Blutvolumens zusammen und spiegelt die absolute Zellzahl wider. In den Lymphknoten ist die IL-23-mRNA-Expression in der präklinischen Phase erhöht, während die Expression von IL-6 krankheitsabhängig zunimmt. In der Milz steigt die IL-6- und IL-23-Expression in der präklinischen Phase an, während die IL-1-beta-mRNA-Expression erst mit Beginn der Erkrankung beeinflusst wird.

Im Blut ist die Expression von nur TNF-alpha-mRNA hochreguliert und krankheitsabhängig. Im lumbalen Rückenmark werden TNF-alpha, IL-1 beta und Interferon gamma in der akuten Phase induziert, während IL-6 nur in der Beginnphase der Erkrankung hochreguliert wird. Einmal gemeistert, können das EAE-Modell, die anschließende Zellisolierung und die Wirkungsanalyse bei zehn Mäusen in acht Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Western Blot oder ELISA durchgeführt werden, um die Ergebnisse der mRNA-Expressionsanalyse zu bestätigen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Multiplen Sklerose, um den Mechanismus der Demyelinisierung im Zentralnervensystem zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das EAE-Modell induziert und wie man Immunzellen isoliert, um reproduzierbare Ergebnisse der Durchflusszytometrie zu erhalten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem vollständigen Freund-Adjuvans äußerst gefährlich sein kann, und fügen Sie Vorsichtsmaßnahmen hinzu, wie z. B. das Anheben der Haut der Maus und das Sicherstellen, dass die Haut vollständig durch die Spritze durchdrungen wird, während dieses Verfahrens durchgeführt wird.