Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Das Protokoll, das wir hier vorstellen, wird uns helfen zu verstehen, wie Lymphozyten an der Entwicklung der Autoimmunerkrankung des zentralnervösen Systems beteiligt sind. Mit dieser Methode können Lymphozyten im Gehirn auf Zellbasis untersucht werden. Dieses Protokoll kann auch auf andere Modelle und Erkrankungen des zentralen Nervensystems angewendet werden, die benötigt werden, um die Eigenschaften und Funktionen von Immunzellen zu analysieren.

In diesem Video kann das Protokoll leicht zeigen, wie man Modellier- und Isolatiateinzelner Zellen im Gehirn induziert. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf pedalreflex bestätigt haben, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um anästherisierte C57BL/6-Mäuse mit 100 Mikrogramm emulgierter MOG 35-55 in 100 Mikrolitern kompletten Freund-Adjuvans in zwei verschiedene Stellen des Rückens in der Nähe des Halses subkutan zu injizieren. Am selben Tag und am zweiten Tag nach der Immunisierung injizieren die Mäuse intraperitoneal die Mäuse mit 200 Mikrolitern eines Nanogramms pro Mikroliter Pertussistoxin-Arbeitslösung.

Nach der zweiten Injektion, übertragen Sie die Mäuse zurück in ihren heimischen Käfig mit einem wärmenden Pad und Überwachung bis zur vollen Rekonsthestorei. Am nächsten Tag und während des Verlaufs der Krankheit, untersuchen und gradieren Alle Mäuse in einer geblendeten Weise für die neurologischen Zeichen in der Tabelle und für alle Änderungen im Gewicht. Schneiden Sie den Schädel am entsprechenden experimentellen Endpunkt vorsichtig von der Nase bis zum Hals und übertragen Sie das Gehirn jedes Tieres aus der Schädelbox in einzelne 50-Milliliter-Röhren mit 10 Milliliter RPMI-Medium.

Mischen Sie die Schläuche gut, um die anhaftenden roten Blutkörperchen zu entfernen und entfernen Sie das Medium durch Aspiration. Fügen Sie 10 Milliliter frisches Medium zu jeder Röhre hinzu und übertragen Sie das Gehirn in einzelne 100-Millimeter-Gerichte. Schließlich hacken Sie jedes Gehirn mit einem Rasiermesser und verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um so viel Gewebe von einer Schale nach der anderen und sechs Milliliter Medium in einen eiskalten sieben Milliliter zentrierten Glas Homogenisator zu übertragen.

Schleifen Sie das Gehirn mit dem lockeren Kolben des Stößes, bevor Sie den engen Kolben verwenden, um das Gewebe zu bringen, bis die Suspension homogen ist. Dann gießen Sie die resultierende Gewebeschlämme in eine vorgekühlte 15 Milliliter konische Röhre auf Eis. Wenn alle Proben homogenisiert sind, stellen Sie das Volumen in jedem Rohr auf sieben Milliliter mit frischem Medium ein, bevor Sie jede Gewebesuspension zu einem neuen gekühlten 15-Milliliter-Rohr hinzufügen, das drei Milliliter 100%Kellermembranmatrix pro Tube enthält.

Mischen Sie durch Inversion ein paar Mal und verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Pipette, um sorgfältig und langsam einen Milliliter 70 Prozent Dichte Gradient lösung unter jeder Gewebelösung Probe hinzufügen. Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientzentrifugation und entfernen Sie fast die gesamte obere Schicht, wobei darauf zu achten ist, dass das gesamte Myelin vollständig entfernt wird. Übertragen Sie die Schnittstelle in ein neues 15-Milliliter-Rohr und stellen Sie das Volumen mit frischem Medium auf 10 Milliliter ein.

Dann zentrifugieren Sie die Proben wieder und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die Pellets in etwa 100 Mikroliter Medium pro Röhre wieder aufhängen. Für die zytometrische Durchflussanalyse der geernteten Gehirnzellen, ordnen Sie etwa zwei Mal 10 zu den sechs Zellen in 100 Mikrolitern Medium in einzelne Brunnen einer 96-Well-Platte. Wenn alle Zellen plattiert sind, fügen Sie 100 Mikroliter 500X Zellstimulationscocktail plus Proteintransportinhibitoren in die Brunnen und legen Sie die Platte für vier Stunden in den Zellkultur-Inkubator.

Am Ende der Inkubationsbecken die Zellen am Boden der Brunnen durch Zentrifugation und resuspendieren die Pellets in 100 Mikroliter Durchflusszytometrie Puffer pro Brunnen. Die Zellen mit drei Mikrolitern Anti-Maus CD16/CD32 Fc Block 10 Minuten bei vier Grad Celsius vorderinbrüten, bevor sie färben. So blockieren Sie alle unspezifischen Fc-vermittelten Interaktionen.

Am Ende der Inkubation, fügen Sie den Antikörper-Cocktail von Interesse zu jedem Brunnen und legen Sie die Platte bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt. Nach 30 Minuten die Brunnen mit 100 Mikrolitern Durchflusszytometriepuffer pro Brunnen waschen und die Zellen durch Zentrifugation sedimentieren. Nach dem Wegwerfen der Überstand, fügen Sie 200 Mikroliter intrazellulären Fixationspuffer zu jedem Brunnen.

Nach einer 30- bis 60-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Proben per Zentrifugation sammeln und die Pellets in 200 Mikrolitern 1X Permeabilitätspuffer pro Brunnen wieder aufsetzen. Zentrifugieren Sie die Proben erneut und setzen Sie die Pellets nach dem Wegwerfen des Überstandes in 100 Mikrolitern mit frischem Permeabilisationspuffer wieder auf. Als nächstes fügen Sie die entsprechenden Antikörper für den Nachweis von intrazellulären Antigenen von Interesse für eine 30-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius hinzu, die vor Licht geschützt sind.

Am Ende der Inkubation 100 Mikroliter 1X Permeabilisationspuffer zu jedem Brunnen hinzufügen und die Proben durch Zentrifugation verdrehen. Dann setzen Sie die Fleckenzellen in 200 Mikroliter Nließzytometrie-Färbungspuffer wieder auf und analysieren die Zellen durch Durchflusszytometrie nach Standardprotokollen. Ein typischer klinischer Verlauf von EAE sollte zu einer Krankheitskurve und einer Veränderung des Körpergewichts führen, wie dargestellt.

C57BL/6 Mäuse, die mit MOG 35-55 geimpft wurden, beginnen in der Regel, Krankheitssymptome um Tag 10 bis 12 zu entwickeln und erreichen den Höhepunkt der Krankheit um Tag 15 bis 21. Vor dem Auftreten der Krankheit steigt das Körpergewicht von immunisierten Mäusen allmählich an, bevor sie in Korrelation mit den zunehmenden Krankheitssymptomen abnehmen. Die Mäuse zeigen das niedrigste Körpergewicht auf dem Höhepunkt der EAE, wobei sich die Körpergewichte leicht erholen, wenn die klinischen Symptome abnehmen. Die Mäuse erholen sich jedoch in der Regel nicht vollständig und entwickeln in der Regel eine monophasische chronische Krankheitspathologie.

Wie diese repräsentative Strömungsanalyse zeigt, sind Interferon-Gamma-produzierende Th1- und IL17-produzierende Th17-Zellen bei EAE-Mäusen signifikant erhöht. Der wichtigste Schritt ist 3.10. Der Bediener sollte die mittlere Schicht und das Licht übertragen, vorsichtig, nehmen sie so wenig andere Schichten wie möglich.

Nach diesem Protokoll können wir weitere T-Lymphozyten für weitere Transkriptionsanalysen