Visualisierung von Gefäß- und Parenchymregeneration nach 70% Teilhepatektomie in normalen Mäusen

Visualisierung der vaskulären und parenchymalen Regeneration nach 70%iger partieller Hepatektomie bei normalen Mäusen. Traditionell wird die Leberregeneration durch Messung der Zunahme des Lebergewichts und -volumens sowie durch die Bestimmung der Hepatozytenproliferationsrate bewertet. Heutzutage interessieren wir uns für die vaskuläre Leberregeneration bei Mäusen und wollen das Gefäßwachstum sichtbar machen und quantifizieren.

Damit etablieren wir den Workflow für die bildgebende Gefäßregeneration. Der Arbeitsablauf besteht aus vier Schritten: Kontrastierung des Gefäßbaums, Aufnahme von CT-Scans, 3D-Rekonstruktion sowie quantitative und qualitative Analyse der resultierenden Bilder. Der Arbeitsablauf beginnt mit der Gegenüberstellung des Gefäßbaums.

Zuerst legen wir die Leber frei, entweder eine normale oder eine resezierte, dann injizieren wir das polymerisierende Silikonkontrastmittel entweder in die Pfortader oder in die Lebervene, je nachdem, welches Gefäßsystem von Interesse ist. Anschließend werden die explantierten Lebern in einem MicroCT gescannt. Nach dem Scannen führen wir eine 3D-Gefäßrekonstruktion mit der präklinischen Software Imalytics durch.

Wenn die technische Qualität der resultierenden Bilder gut genug ist, kann eine 3D-Rekonstruktion mit HepaVision durchgeführt werden. Dieses Programm wird in Kliniken zur Planung von hepatobiliären Operationen eingesetzt. Neben der 3D-Visualisierung des Gefäßbaums ermöglicht dieses Programm die Visualisierung und Berechnung des Lebervolumens, der Gesamtleber und jedes Lappens, basierend auf den versorgenden und drainierenden Gefäßen.

Nach der Rekonstruktion können wir mit Hilfe von Computertechniken zusätzliche Parameter bestimmen, die auf das Gefäßwachstum hinweisen, wie z. B. die Länge und den Durchmesser eines bestimmten Gefäßes. Dies wird eine quantitative Beschreibung des Gefäßwachstums ermöglichen. Auf der anderen Seite können formalinfixierte Microfil-Proben in Serienschnitte geschnitten werden.

Die Seriensektionen können mit einem Ganzdiascanner gefärbt und digitalisiert werden. Nach starrer und elastischer Registrierung von Serienschnitten können 3D-Gefäßbäume sowohl des portalvenösen als auch des hepatischen Venensystems rekonstruiert werden. In einem zukünftigen Schritt wollen wir die räumliche Verteilung von molekularen Ereignissen erforschen.

Ein Beispiel für ein molekulares Ereignis, das für die Leberregeneration von Interesse ist, ist das Auftreten des Proliferationsmarkers Ki-67 in Hepatozytenkernen und seine räumliche Verteilung in den 3D-rekonstruierten Gefäßbäumen. Als nächstes geben wir eine detaillierte Einführung in die Durchführung der Microfil-Injektion. Vorbereitung der Reagenzien.

Für die Mischung aus Microfil-Compound benötigen wir MV-Verdünnungsmittel, MV-Compound, in unserem Fall das blaue MV-120, und Härter. Wir brauchen auch Pipetten, ein Röhrchen und eine Pipette. Bereiten Sie zwei Milliliter MV-120 in einer Fünf-Milliliter-Tube vor.

Verdünnen Sie es dann durch Zugabe von drei Millilitern MV-Verdünnungsmittel. Mischen Sie sie, indem Sie sie leicht schütteln. Für Heparin-Kochsalzlösung fügen Sie 1 Milliliter Heparin in 10 Milliliter Kochsalzlösung hinzu.

Vorbereitung des Operationstisches. Erstens benötigen wir ein Mikroskop, zweitens wird ein Satz Verbrauchsmaterialien benötigt. 6-0 Seiden- und 6-0 Polypropylen-Nähte, Fünf-Milliliter- und 1-Milliliter-Spritzen, 30-Gauge- und 21-Gauge-Nadeln, Verlängerungsschlauch zum Verbinden von Spritze und Katheter, 26-Gauge-Katheter mit Nadeleinführung, Wattespitzen und Gaze.

Drittens werden chirurgische Instrumente benötigt. Mikroinstrumente, Klemmen und elektrischer Koagulator. Viertens wird eine Perfusionspumpe benötigt.

Vorbereitung des Tieres. Legen Sie die Maus in die Anästhesie-Induktionskammer und betäuben Sie die Maus mit 2% Isofluran und 0,3 Milliliter Sauerstoff pro Minute. Befestigen Sie die betäubte Maus mit Klebebändern auf dem Operationstisch mit kontinuierlicher Inhalation von 2 % Isofluran und 0,3 Millilitern Sauerstoff pro Minute.

Microfil-Injektion, portalvenöses System. Machen Sie einen Querschnitt am Bauch mit einer Schere für die Hautschicht und einem elektrischen Koagulator für die Muskelschicht. Schieben Sie den Darm mit Wattestäbchen nach links heraus und bedecken Sie den Darm mit salzhaltiger Gaze.

Präparieren Sie die Pfortader unter dem Mikroskop. Legen Sie eine 6-0-Seidennaht unter die Ader extra hepatisch in einem Abstand von etwa einem Millimeter zu ihrer Bifurkation. Binden Sie es für den späteren Gebrauch locker zusammen.

Injizieren Sie die Heparin-Kochsalzlösung fünf Minuten lang durch eine Penisvene zur systemischen Heparinisierung. Diese Animation zeigt das Verfahren des Einführens eines Katheters. Legen Sie zuerst die 6-0-Seidennaht unter die extra hepatische Pfortader, führen Sie dann den 26-Gauge-Katheter in die Pfortader ein und fixieren Sie ihn mit einer Klemme.

Lilizieren Sie die vorplatzierte Naht, um den Katheter zu fixieren und den Blutfluss aus der Milzvene und der Mesenterialvene zu blockieren. Hier zeigen wir Ihnen den chirurgischen Ablauf. Führen Sie den 26-Gauge-Katheter mit der Nadel ein.

Führen Sie den Katheter weiter ein und ziehen Sie die Nadel gleichzeitig langsam heraus. Befestigen Sie den Katheter mit einer Klemme. Füllen Sie den Katheter vollständig mit Heparin-Kochsalzlösung, um Luftblasen zu vermeiden.

Verbinden Sie den Verlängerungsschlauch mit dem Katheter und fixieren Sie sie. Schalten Sie die Perfusionspumpe ein. Beginnen Sie die Perfusion mit Heparin-Kochsalzlösung mit einer Flussrate von 0,4 Millilitern pro Minute.

Beobachten Sie, wie die rechten Lappen unmittelbar nach der Perfusion blass werden. Spülen Sie die Leber mit Kochsalzlösung, um sie während des gesamten Perfusionsvorgangs feucht zu halten. Euthanasieren Sie die Maus durch Ausblutung durch Perfusion unter Narkose.

Setzen Sie die Heparinperfusion einige Minuten lang fort, bis die gesamte Leber blass wird. Vor der Microfil-Perfusion 0,1 Milliliter Härter in die vorbereitete Microfil-Verbindung geben, um den Polymerisationsprozess zu beschleunigen. Laden Sie die Microfil-Verbindung in eine Fünf-Milliliter-Spritze und einen Verlängerungsschlauch.

Befreien Sie sich von den Luftblasen, indem Sie die Heparin-Kochsalzlösung wie zuvor in den Katheter injizieren. Verbinden Sie den Schlauch mit dem Katheter und fixieren Sie ihn fest. Beginnen Sie die Microfil-Injektion mit einer Durchflussrate von 0,2 Millilitern pro Minute für etwa ein bis zwei Minuten.

Beobachten Sie, wie sich der blaue Wirkstoff langsam in die Pfortaderäste ausbreitet. Stoppen Sie die Perfusion, wenn die blaue Gefäßstruktur auf der Oberfläche jedes Leberlappens erscheint, wie ein roter Kreis angezeigt wird. Lassen Sie die Leber mindestens 15 Minuten lang für die Polymerisation der Microfil-Verbindung stehen.

Microfil-Injektion, hepatisches Venensystem. Der Eingriff erfolgt grundsätzlich nach den gleichen Schritten wie die Injektion in das portalvenöse System. Legen Sie eine 6-0-Seidennaht unter die Ader extra hepatisches Pfortader in etwa einem Millimeter Abstand zu ihrer Bifurkation.

Führen Sie dann einen Katheter in die Pfortadera ein und fixieren Sie diesen per Klemme. Führen Sie einen weiteren Katheter in die untere Hohlvene ein und fixieren Sie diesen ebenfalls mit einer Klemme. Lilizieren Sie die vorplatzierte Naht, um den Katheter zu fixieren und den Blutfluss aus der Milzvene und der Mesenterialvene zu blockieren.

Setzen Sie eine Klemme auf die suprahepatische untere Hohlvene, um den Abfluss der Leber zu behindern. Ligateäste der unteren Hohlvene, einschließlich der beiden Nierenvenen und des distalen Endes der unteren Hohlvene. Spülen Sie die Leber mit Heparin-Kochsalzlösung über den ersten Katheter.

Perfundieren Sie das Lebervenensystem mit Microfil Compound über Katheter zwei. Ergebnisse, Mikro-CT-Rekonstruktion. Wir erhielten 3D-Gefäßrekonstruktionen mit der präklinischen Software Imalytics nach dem Mikro-CT-Scan.

Die Gefäßregeneration sowohl im portalen als auch im hepatischen Venensystem zeigte sich als Verlängerung und Erweiterung der Hauptgefäßstrukturen in Kombination mit einer Verzweigung kleinerer Gefäße. Am zweiten postoperativen Tag verlängerten sich die Gefäßbäume der Restlappen. Am postoperativen Tag sieben wurden weitere kleine Aste aus derselben Hauptpfortader und der Lebervene sichtbar.

Ergebnis: 3D-farbcodierte Rekonstruktion des hepatischen Gefäßbaums und der davon abhängigen Leberterritorien. Jeder Leberlappen konnte nach der farbcodierten Rekonstruktion durch HepaVision in allen drei Dimensionen leicht sichtbar gemacht werden. Wie in der Tabelle angegeben, wurden, wie hier gezeigt, die Lebervolumina der Gesamtleber und jedes Lappens für das hepatische Venensystem einer normalen Leber bestimmt.

Ergebnisse, Serienschnitte und Rekonstruktion. Auf der anderen Seite wurde die formalinfixierte Microfil-Probe einer seriellen Sektion unterzogen. Die gefärbten Serienschnitte wurden mit Hilfe eines Ganzdia-Scanners digitalisiert und für die Gefäßbaumrekonstruktion beider Systeme verwendet.

Dies sind Querschnitte eines Stapels von seriellen Schnitten der Mausleber vor und nach der starren und elastischen Registrierung. Nach der Computerregistrierung können portalvenöse und hepatische Venensysteme in einem einzigen 3D-Modell rekonstruiert werden. Dieser manuell und rechenintensiv zeitaufwändige Schritt muss weiter optimiert werden.

Der nächste Schritt, nämlich die Visualisierung der räumlichen Verteilung molekularer Ereignisse in Bezug auf die Gefäßbäume, befindet sich derzeit in der Entwicklung. Dieser Schritt kann als Verschmelzung von Mikro-CT-Informationen, die aus dem kontrastierenden Gefäßbaum abgeleitet wurden, mit histologischen Informationen oder als 3D-Visualisierung rein histologischer Informationen vorgestellt werden. In diesem Fall würden die Mikro-CT-Informationen als Qualitätskontrolle für die anspruchsvolle, histologiebasierte 3D-Rekonstruktion dienen.

Sobald dies erreicht ist, haben wir ein Werkzeug, um die Leberregeneration besser untersuchen zu können. Insbesondere die räumliche Verteilung des molekularen Geschehens und des Leberparenchyms in Bezug auf die Gefäßregeneration.