Visualisierung von Gefäß- und Parenchymregeneration nach 70% Teilhepatektomie in normalen Mäusen

Visualisierung der vaskulären und parenchymalen Regeneration nach 70 % partieller Hepatektomie bei normalen Mäusen. Traditionell wird die Leberregeneration durch die Messung des Anstiegs von Lebergewicht und -volumen sowie durch die Bestimmung der Proliferationsrate der Hepatozyten beurteilt. Heutzutage liegt das Interesse auf der vaskulären Regeneration der Leber bei Mäusen, und es soll das Wachstum der Blutgefäße sichtbar gemacht und quantifiziert werden.

Daher etablieren wir den Arbeitsablauf zur Bildgebung der vaskulären Regeneration. Der Arbeitsablauf umfasst vier Schritte: Kontrastierung des Gefäßbaums, Erfassung von CT-Scans, 3D-Rekonstruktion sowie quantitative und qualitative Analyse der resultierenden Bilder. Der Arbeitsablauf beginnt mit der Kontrastierung des Gefäßbaums.

Zunächst exponieren wir die Leber, entweder eine normale oder eine resezierte, und injizieren anschließend die polymerisierende Silikon-Kontrastmasse entweder in die Pfortader oder in die Lebervene, abhängig vom interessierenden Gefäßsystem. Danach werden die explantierten Lebern einer Mikro-CT-Untersuchung unterzogen. Nach der Aufnahme führen wir eine 3D-gezielte Rekonstruktion der Gefäße mit der Imalytics Preclinical-Software durch.

Wenn die technische Qualität der resultierenden Bilder ausreichend ist, kann eine 3D-Rekonstruktion mithilfe von HepaVision durchgeführt werden. Dieses Programm wird in Kliniken zur Planung hepatobiliärer Eingriffe verwendet. Neben der 3D-Visualisierung des Gefäßbaums ermöglicht die Software die Darstellung und Berechnung des Lebervolumens – sowohl des Gesamtvolumens als auch der einzelnen Lappen – basierend auf den versorgenden und abführenden Gefäßen.

Nach der Rekonstruktion können wir mithilfe computergestützter Verfahren zusätzliche Parameter bestimmen, die auf das Gefäßwachstum hinweisen, wie beispielsweise die Länge und der Durchmesser eines bestimmten Gefäßes. Dies ermöglicht eine quantitative Beschreibung des Gefäßwachstums. Andererseits können in Formalin fixierte Microfil-Proben in Serienschnitte zerschnitten werden.

Die seriellen Schnitte können mit einem Ganzpräparat-Scanner angefärbt und digitalisiert werden. Nach der starren und elastischen Registrierung der seriellen Schnitte lassen sich 3D-Gefäßbäume sowohl des portalen als auch des hepatischen venösen Systems rekonstruieren. In einem zukünftigen Schritt möchten wir die räumliche Verteilung molekularer Ereignisse untersuchen.

Ein Beispiel für ein molekulares Ereignis von Interesse bei der hepatischen Regeneration ist das Auftreten des Proliferationsmarkers Ki-67 in den Hepatozytenkernen und dessen räumliche Verteilung in den dreidimensional rekonstruierten vaskulären Bäumen. Als Nächstes werden wir eine detaillierte Einführung in die Durchführung der Microfil-Injektion geben. Vorbereitung der Reagenzien.

Für die Microfil-Verbindungsmischung benötigen wir MV-Verdünnungsmittel, MV-Verbindung, in unserem Fall das blaue MV-120, und Aushärtungsmittel. Außerdem benötigen wir Pipetten, ein Gefäß und einen Pipettierer. Bereiten Sie zwei Milliliter MV-120 in einem Fünf-Milliliter-Gefäß vor.

Anschließend verdünnen Sie es, indem Sie drei Milliliter MV-Verdünnungsmittel hinzufügen. Mischen Sie die Lösungen durch vorsichtiges Schütteln. Für die Heparin-Salzlösung geben Sie 1 Milliliter Heparin zu 10 Milliliter Salzlösung hinzu.

Vorbereitung des Operationstisches. Zunächst benötigen wir ein Mikroskop, zweitens wird ein Satz an Verbrauchsmaterialien benötigt. 6-0 Seiden- und 6-0 Polypropylennähte, Fünf-Milliliter- und Ein-Milliliter-Spritzen, 30-Gauge- und 21-Gauge-Nadeln, Verlängerungsschlauch zur Verbindung von Spritze und Katheter, 26-Gauge-Katheter mit Nadeleinführung, Wattestäbchen und Mullbinden.

Drittens werden chirurgische Instrumente benötigt. Mikroinstrumente, Klemmen und ein elektrischer Koagulator. Viertens wird eine Perfusionspumpe benötigt.

Vorbereitung des Tieres. Das Maus in die Narkoseinduktionskammer geben und mit 2 % Isofluran und 0,3 Milliliter pro Minute Sauerstoff anästhesieren. Die anästhesierte Maus mit Klebeband auf dem Operationstisch fixieren, wobei kontinuierlich 2 % Isofluran und 0,3 Milliliter pro Minute Sauerstoff inhaliert werden.

Microfil-Injektion, portales Venensystem. Führen Sie einen Querschnitt am Bauch mit einer Schere für die Hautschicht und einem elektrischen Koagulator für die Muskelschicht durch. Verlagern Sie den Darm mithilfe von Wattestäbchen nach links und bedecken Sie den Darm mit mit Kochsalzlösung getränktem Mull.

Präparieren Sie die Pfortader unter dem Mikroskop. Legen Sie eine 6-0-Seidennaht unterhalb der extrahepatischen Pfortader in einem Abstand von etwa einem Millimeter zur Bifurkation an. Knoten Sie sie locker, um sie später verwenden zu können.

Spritzen Sie die Heparin-Salzlösung über eine Penisvene für eine systemische Heparinisierung über fünf Minuten. Diese Animation zeigt den Vorgang der Katheterplatzierung. Legen Sie zunächst die 6-0-Seidennaht unterhalb der extrahepatischen Pfortader an, fügen Sie dann den 26-Gauge-Katheter in die Pfortader ein und fixieren Sie ihn mit einer Klemme.

Binden Sie die zuvor platzierte Naht zur Fixierung des Katheters und zur Blockierung des Blutflusses aus der Vena splenica und der Vena mesenterica. Hier wird das chirurgische Vorgehen demonstriert. Führen Sie den 26-Gauge-Katheter mit Nadel ein.

Schieben Sie den Katheter weiter vor und ziehen Sie gleichzeitig langsam die Nadel heraus. Sichern Sie den Katheter mit einer Klemme. Füllen Sie den Katheter vollständig mit Heparin-Salzlösung, um Luftblasen zu vermeiden.

Verbinden Sie das Verlängerungsrohr mit dem Katheter und befestigen Sie beide fest. Schalten Sie die Perfusionspumpe ein. Beginnen Sie die Heparin-Saline-Perfusion mit einer Flussrate von 0,4 Milliliter pro Minute.

Beobachten Sie, wie die rechten Lappen unmittelbar nach der Perfusion blass werden. Spülen Sie die Leber mit Kochsalzlösung, um sie während des gesamten Perfusionsvorgangs feucht zu halten. Töten Sie die Maus durch Exsanguination mittels Perfusion unter Anästhesie.

Führen Sie die Heparin-Perfusion mehrere Minuten lang fort, bis die gesamte Leber blass wird. Vor der Microfil-Perfusion geben Sie 0,1 Milliliter Härtemittel in die vorbereitete Microfil-Mischung, um den Polymerisationsvorgang zu beschleunigen. Füllen Sie die Microfil-Mischung in eine Fünf-Milliliter-Spritze und eine Verlängerungsschlauchleitung.

Entfernen Sie die Luftblasen, indem Sie die Heparin-Salzlösung wie zuvor in den Katheter injizieren. Verbinden Sie den Schlauch mit dem Katheter und befestigen Sie ihn fest. Beginnen Sie die Microfil-Injektion mit einer Flussrate von 0,2 Milliliter pro Minute für ungefähr eine bis zwei Minuten.

Beobachten Sie, wie sich das blaue Mittel langsam in die Zweige der Pfortader ausbreitet. Stoppen Sie die Perfusion, wenn die blaue Gefäßstruktur auf der Oberfläche jedes Leberlappens erscheint, wie durch einen roten Kreis angezeigt. Lassen Sie die Leber mindestens 15 Minuten lang zur Polymerisation der Microfil-Verbindung stehen.

Microfil-Injektion, hepatisches venöses System. Das Verfahren folgt im Wesentlichen denselben Schritten wie die Injektion in das portalvenöse System. Legen Sie eine 6-0-Seidennaht unterhalb der extrahepatischen Vena portae in einem Abstand von etwa einem Millimeter zu ihrer Bifurkation an.

Danach einen Katheter in die Pfortader einführen und mit einer Klemme fixieren. Einen weiteren Katheter in die untere Hohlvene einführen und ebenfalls mit einer Klemme befestigen. Die zuvor platzierte Naht ligieren, um den Katheter zu fixieren und den Blutfluss aus der Milzvene und der Mesenterialvene zu blockieren.

Platzieren Sie eine Klemme an der suprahepatischen Vena cava inferior, um den Abfluss aus der Leber zu unterbinden. Ligieren Sie die Seitenäste der Vena cava inferior, einschließlich beider Nierenvenen und dem distalen Ende der Vena cava inferior. Spülen Sie die Leber über Katheter eins mit Heparin-haltiger Kochsalzlösung aus.

Perfusieren Sie das hepatische venöse System über Katheter zwei mit der Microfil-Verbindung. Ergebnisse, Mikro-CT-Rekonstruktion. Wir erhielten 3D-gefäßmäßige Rekonstruktionen mittels Imalytics Preclinical-Software nach Mikro-CT-Scannen.

Die vaskuläre Regeneration sowohl im portalen als auch im hepatischen venösen System zeigte sich als Verlängerung und Verbreiterung der Hauptgefäße in Kombination mit der Ausbildung von kleineren Seitenästen. Am zweiten postoperativen Tag verlängerten sich die Gefäßbäume der verbleibenden Lappen. Bis zum siebten postoperativen Tag wurden zusätzliche kleine Äste derselben Hauptporta- und der Lebervene sichtbar.

Ergebnisse, dreidimensionale farbkodierte Rekonstruktion des hepatischen Gefäßbaums und der zugehörigen hepatischen Anteile. Jedes Leberlappen wurde nach der farbkodierten Rekonstruktion mittels HepaVision in allen drei Dimensionen leicht sichtbar. Wie in der Tabelle angegeben, wurden die Lebervolumina der gesamten Leber und jedes einzelnen Lappens bestimmt, wie hier für das hepatische Venensystem einer normalen Leber dargestellt.

Ergebnisse, Serienschnitte und Rekonstruktion. Andererseits wurde die formalinfixierte Microfil-Probe einer Serienschnitttechnik unterzogen. Die gefärbten Serienschnitte wurden mithilfe eines Ganzpräparat-Scanners digitalisiert und zur Rekonstruktion des vaskulären Baums beider Systeme verwendet.

Dies sind Querschnitte eines Stapels serieller Mausleber-Schnitte vor und nach starrer und elastischer Registrierung. Nach der computergestützten Registrierung können das portalvenöse und das hepatische venöse System in einem einzigen 3D-Modell rekonstruiert werden. Dieser manuell und rechnerisch zeitaufwändige Schritt erfordert weitere Optimierung.

Der nächste Schritt, nämlich die Visualisierung der räumlichen Verteilung molekularer Ereignisse in Bezug auf die Gefäßbäume, befindet sich derzeit in der Entwicklung. Dieser Schritt könnte als Fusion von Mikro-CT-Daten, die aus dem kontrastierten Gefäßbaum stammen, mit histologischen Informationen oder als 3D-Visualisierung rein histologischer Informationen realisiert werden. In diesem Fall würde die Mikro-CT-Information als Qualitätskontrolle für die anspruchsvolle, auf Histologie basierende 3D-Rekonstruktion dienen.

Einmal erreicht, verfügen wir über ein Werkzeug, um die Leberregeneration besser zu untersuchen, insbesondere die räumliche Verteilung molekularer Ereignisse und des hepatischen Parenchyms in Bezug auf die vaskuläre Regeneration.