Name: Visualisierung von Gefäß- und Parenchymregeneration nach 70% Teilhepatektomie in normalen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Visualisierung der Gefäßregeneration nach Teilhepatektomie bei Mäusen mittels µCT und 3D-Rekonstruktion. Dieser Workflow ermöglicht die quantitative Analyse vaskulärer Wachstumsprozesse in der Leber.

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Die Autoren danken für die Förderung durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) über das Systembiologie-Netzwerk "Virtual Liver", Fördernummern 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS). Die Autoren danken auch Frank Schubert für die technische Unterstützung.

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Bundesrepublik Deutschland. Da die Pfortader-System wurde getrennt von der Leber-venösen System sichtbar gemacht, getrennte Tiere wurden für die verschiedenen Gefäßbäumen benötigt. 1. Reagenzien Vorbereitung <ol><li> Heparin-Kochsalzlösung <ol><li> 0,1 ml Heparin in 10 ml Kochsalzlösung (5 IU / ml). </li></ol></li><li> Silikon-Verbindungsmischung <ol><li> 2 ml MV-120 in ein 5-ml-Tube. Verdünnte MV-120 durch Zugabe von 3 ml MV Verdünnungsmittel, was zu einer 40% igen Lösung. </li></ol></li></ol> 2. Pfortader-System-Silikon-Einspritzung <ol><li> Laparotomie <ol><li> Platzieren Sie die Maus in der Anästhesie Induktionskammer und betäuben sie mit 2% Isofluran und 0,3 l / min Sauerstoff. </li><li> Befestigen Sie den narkotisierten Maus auf dem Operationstisch mit kontinuierlicher Inhalation mit Klebeband von 2%oflurane und 0,3 l / min Sauerstoff. Überprüfen Sie die Zehen Prise Rückzug Reflex der Maus und starten Sie den Betrieb, wenn der Reflex fehlt. </li><li> Machen Sie einen Quereinschnitt auf den Bauch einer Schere für die Hautschicht und einer elektrischen Koagulator für die Muskelschicht verwendet wird. Bewegen Sie heraus den Darm auf die linke Seite mit Baumwollspitzen und decken den Darm mit Kochsalzlösung getränkten Gaze. </li></ol></li><li> Einführkatheter <ol><li> Präparieren Pfortader unter dem Mikroskop mit Mikro-Pinzette. Legen Sie eine 6-0 Seidennaht unterhalb der extrahepatischen Pfortader, in etwa 1 mm Abstand zu seiner Gabelung und binden Sie es locker für die spätere Verwendung. </li><li> Spritzen Sie bereit Heparin-Kochsalzlösung über Penis-Vene (männlich) oder untere Hohlvene (weiblich) für die systemische Heparinisierung für 5 min. </li><li> Legen Sie die 26-Gauge (26 G) Katheter mit Nadel in Pfortader und fixieren Sie es mit einer Klammer </li></ol></li><li> Heparin-Kochsalzlösung und Silikon-Verbindung Perfusion <ol><li> Laden Heparin-Kochsalzlösung Solution in 5-ml-Spritze und schalten Sie die Perfusion Gerät. Füllen Sie den Katheter vollständig mit Heparin-Kochsalzlösung Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Schließen Sie das Verlängerungsrohr mit dem Katheter und befestigen Sie sie fest. Starten Sie Heparin-Kochsalzlösung Perfusion mit einer Durchblutungsrate von 0,4 ml / min. </li><li> Ligat vorplatzierte 6-0 Seidennaht für die doppelte Katheter Fixierung und den Blutfluss aus Milzvene und mesenterica blockieren. Euthanatize die Maus durch Ausbluten über die Perfusion unter Narkose. </li><li> Spülen Sie die Leber während der gesamten Perfusion, um es feucht zu halten mit Kochsalzlösung. </li><li> 0,1 ml Mittel in die MV-120 Rohr aushärtet. Ändern Sie Heparin-Kochsalzspritze Silikonspritze. </li><li> Starten Sie Silikon-Perfusion mit einer Durchblutungsrate von 0,2 ml / min für ca. 1 min das Kathetersystem zu prefill und die Pfortader-System zu füllen. Stoppen Sie Silikon-Perfusion, wenn die Gefäße auf der Oberfläche blau. </li></ol></li><li> Sampling <ol><li> Halten Sie die Leber in situ until das Silikon wird nach ca. 15 bis 30 min vollständig polymerisiert. Präparieren Bänder Leber und benachbarte Organe sorgfältig Verbindungs ​​Leber intakt zu halten. Explantat die Leber und steckte es in Formalin-Fixierung. </li></ol></li></ol> 3. Lebervenensystem Silikon-Einspritzung <ol><li> Führen Sie Laparotomie als vollständig in Schritt 2.1 und setzen Operationsfeld durchgeführt. </li><li> Einführkatheter <ol><li> Präparieren Pfortader unter dem Mikroskop mit Mikro-Pinzette. Legen Sie eine 6-0 Seidennaht unterhalb der extrahepatischen Pfortader, in etwa 1 mm Abstand zu seiner Gabelung und binden Sie es locker für die spätere Verwendung. </li><li> Spritzen Sie bereit Heparin-Kochsalzlösung über Penis-Vene (männlich) oder untere Hohlvene (weiblich) für die systemische Heparinisierung für 5 min. </li><li> Legen Sie eine 26 G-Katheter (Katheter 1) mit Nadel in Pfortader und befestigen Sie ihn mit einer Klemme. Legen Sie eine andere 26 G-Katheter (Katheter 2) mit der Nadel in der unteren Hohlvene und fixieren Sie es mit einer Klammer. </li><li> Ligieren die Zweige der unteren Hohlvene (einschließlich linke und rechte Nierenvenen) und seinem distalen Ende mit 6-0 synthetischen, Monofilament, nicht-resorbierbaren Polypropylen Naht. </li></ol></li><li> Heparin-Kochsalzlösung und Silikon-Verbindung Perfusion <ol><li> Laden Heparin-Kochsalzlösung in 5-ml-Spritze und schalten Sie die Perfusion Gerät. Füllen Katheter 1 vollständig mit Heparin-Kochsalzlösung, um Luftblasen zu vermeiden. Schließen Sie das Verlängerungsrohr zu Katheter 1 und befestigen Sie es fest. Beginnen Heparin-Kochsalzlösung Perfusion mit einer Rate von 0,4 ml / min. </li><li> Ligat vorplatzierte 6-0 Seidennaht für die doppelte Katheter Fixierung und den Blutfluss aus Milzvene und mesenterica blockieren. Euthanatize die Maus durch Ausbluten über die Perfusion unter Narkose. </li><li> Spülen Sie die Leber während der gesamten Perfusion, um es feucht zu halten mit Kochsalzlösung. 0,1 ml Mittel in die MV-120 Rohr aushärtet. Exchange-Heparin-Kochsalzlösung Spritze mit Silikonspritze. </li><li> Legen Sie eine Klemme an der suprahepatic inferior vena cava den Abfluss von der Leber zu behindern. </li><li> Schließen Sie das Verlängerungsrohr 2 mit dem Katheter und Silikon-Perfusion mit einer Durchblutungsrate von 0,2 ml / min für ca. 2 min eine objektive Lebergefäßvolumen zu erreichen, wie berichtet, beginnen. Stoppen Sie Silikon-Perfusion, wenn die Gefäße auf der Oberfläche blau. </li></ol></li><li> Sampling <ol><li> Präparieren Leber Bänder eine Schädigung der Leber zu vermeiden. Explantat die Leber und steckte es in Formalin-Fixierung. </li></ol></li></ol> 4. Micro-CT (μCT) Scan Zum Scannen werden die explantiert Leberprobe mit μCT, die folgenden Schritte erforderlich. <ol><li> Nehmen Sie die Leberprobe aus der Fixierungslösung. Legen Sie die Leber auf die μCT Bett. Setzen Sie die μCT Bett mit der Leberprobe in die μCT. </li><li> Erwerben Sie Topogramm vor dem Scan zu starten. Verwenden Sie eine Nebenabtastrichtung für die kleine Leberprobe und zwei Teilscan für große Proben. </li><li> Wählen Sie ein81; CT - Protokoll mit einer hohen Auflösung (zB HQD-6565-390-90). Dieses Protokoll erwirbt 720 Projektionen mit 1.032 x 1.012 Pixeln bei einer vollen Umdrehung mit der Scanzeit von 90 Sekunden pro Unterabtastung. Starten Sie den μCT-Scan. </li></ol> 5. Histologische Serienschnitte <ol><li> Einbetten der Leberprobe in Paraffin als Ganzes nach μCT Scannen. Schneiden gesamte Paraffinprobe in 4 um Abschnitte, was zu einer Reihe von 2000 bis 2500 Abschnitten. </li><li> Stain Abschnitte mit entsprechenden Färbetechnik molekularen Ereignisse von Interesse zu visualisieren, wie Ki-67 als Proliferationsmarker und HMGB1 als Marker für ischämische Schädigung. Bestimmen Sie Reihenfolge der Färbung in Bezug auf wissenschaftliche Frage. </li><li> Verwenden Sie eine ganze Dia-Scanner die gefärbten Schnitten zu digitalisieren. </li><li> Führen Sie 3D-Rekonstruktion des Gefäßbaumes (n) (bereits machbar) und visualisieren 3D-Verteilung der molekularen Ereignisse in Bezug auf Gefäßbaum (Forschung im Gange). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Kontras den Gefäßbaum durch Silikon - Injektion und μCT - Scanning wurde 5,7,8,10 die angiogene Progression häufig zu studieren in Tumormodellen und neurologische Krankheitsmodelle eingeführt. Verbesserungen in der Methodik der Silikoninjektion wurden in der vorliegenden Studie zur Visualisierung und Quantifizierung von vaskulären Wachstums nach partieller Hepatektomie in Mäusen hergestellt. Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte Aufmerksamkeit benötigen gute Perfusion Qualitä...

Leberregeneration wird durch Messen der Zunahme des Lebergewichts und Volumens und durch die Bewertung der Hepatozyten Proliferationsrate 16 häufig bestimmt. Allerdings ist die Regeneration der Leber nicht nur Parenchymregeneration induziert , sondern auch Gefäßregeneration 6. Daher sollte Gefäßwachstum weiter in Bezug auf ihre Rolle bei der Progression der Leberregeneration untersucht werden. Visualisierung des Lebergefäßsystems ist von entscheidender Bedeutung für unser Verständnis der vaskulären Regeneration voranzutreiben. Zahlreiche indirekte Methoden wurden die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Lebergefäßregeneration zu studieren entwickelt. Traditionell Nachweis von Zytokinen (vascular endothelial growth factor, VEGF) 14, Chemokine und deren Rezeptoren (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 haben die tragende Säule gewesen vaskuläre Regeneration für das Studium. Jedoch zusammen ein 3D-Modell mit quantitativen Analyse des Gefäßsystems würde hinzufügen kritischen anatomischenInformationen ein besseres Verständnis für die wichtige Beziehung zwischen Leberparenchyms und Gefäßregeneration zu gewinnen. Um die hepatische Gefäßsystem sichtbar zu machen, die die vaskuläre Bäume erfordert kontras wurden Mäuse mit einem strahlenundurchlässigen Silikonkautschuk Kontrastmittel direkt in das Portal oder hepatische venöse Gefäßbaum injiziert. Nach der Polymerisation des Silikon und Explantation des Organs, wurden die Leberproben zu μCT Abtastung unterworfen, um ein CT-Scanner. Die Scans ergaben in Voxel-Bilddarstellungen des silikonInjektionsProben 9. Für die Qualitätskontrolle wurde das Gefäßsystem zunächst in 3D mit präklinischen Software visualisiert. Die Segmentierung erfolgt durch Setzen einer Schwelle zwischen dem weichen Gewebe Intensität und der Gefäß Intensität durchgeführt. Die sich ergebende Gefäß Maske wurde unter Verwendung von Oberflächendarstellung visualisiert. Die Software auch für die manuelle Bestimmung von zwei Parametern von vascul erlaubtar Wachstum: maximale Schiffslänge und Radius. Eine präklinische Software wurde dann zur 3D - Rekonstruktion von Gefäßbäumen und die anschließende Berechnung der Lieferung oder Trockenlegung Gefäßterritorien 13 verwendet. Darüber hinaus bestimmt dieses Software automatisch bestimmte Parameter der Gefäßwachstum, wie beispielsweise die Gesamtlänge aller sichtbaren Gefäßstrukturen auch als die Gesamtkantenlänge oder Gesamtbehältervolumen bekannt. Die Silikon-Perfusions-Verfahren wurde in naiven Mäusen und in Mäusen durchgeführt, die 70% partielle Hepatektomie (PH) unterzog. Die Lebern wurden zur Analyse von Gefäß- und parenchymalen Leberregeneration bei unterschiedlichen Beobachtungszeitpunkten nach der Resektion gesammelt, um die oben genannten Visualisierung und Quantifizierung Technik. Die Hauptziele dieses Films sind: (1) erforderlich, um die empfindlichen Spritztechnik zeigen eine optimale Kontrastierung zu erreichen, und (2) zeigen den möglichen Nutzen daraus resultierende from eine detaillierte Analyse der erhaltenen Probe μCT und histologischen Schnittserien mit. Nachdem sie diesen Film sehen, sollte der Leser ein besseres Verständnis dafür, wie Silicon-Verbindung in einem bestimmten Gefäßsystem und von der Nützlichkeit und Anwendbarkeit der Technik zu injizieren.

<table><tbody><tr><td>PERFUSOR&reg; VI</td><td>B.BRAUN</td><td>87 222/0</td><td></td></tr><tr><td>Pipetus&reg;-akku</td><td>Hirschmann</td><td>9907200</td><td></td></tr><tr><td>Pipets</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td><td>Nr. 14058-09</td><td></td></tr><tr><td>micro serrefine</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td><td>Nr.18055-05</td><td></td></tr><tr><td>Mikroklemmen-Applikator</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td><td>Nr. 18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Mikrozange</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td><td>Nr. 00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Mikrozange</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td><td>Nr. 00649-11</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td><td>Nr. 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>B.Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Spritze</td><td>B.Braun</td><td>4606051V</td><td></td></tr><tr><td>Verlängerungs- und Verbindungsleitungen</td><td>B.Braun</td><td>4256000</td><td>30 cm, innen & schräg 1,2 mm</td></tr><tr><td>6-0 Seide (Perma-Hand Seide)</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 prolene</td><td>Ethicon</td><td>8711H</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofil&reg; MV-Verdünnungsmittel</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfil&reg; MV - 120</td><td>FLOW TECH, INC</td><td>MV - 120 (blau)</td><td></td></tr><tr><td>MV Härter</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin 2500 I.E./5 ml</td><td>Rotexmedica</td><td>ETI3L318-15</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td>E15117/D DE</td><td></td></tr><tr><td>Imalytics Präklinische Software</td><td>Experimentelle Molekulare Bildgebung, RWTH Aachen University, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepaVision</td><td>Fraunhofer MEVIS, Bremen, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0-HT&nbsp; Digitaler Diascanner</td><td>Hamamatsu Electronic Press, Japan&nbsp;</td><td>C9600</td><td></td></tr><tr><td>Tomoskop Duo CT&nbsp;</td><td>CT Imaging GmbH, Erlangen, Deutschland</td><td>TomoScope&reg; &nbsp; Synergie</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von gefäß- und parenchymregeneration nach 70% teilhepatektomie in normalen mäusen

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Eine modifizierte Silikoninjektionsverfahren wurde zur Sichtbarmachung des Leber-Gefäßbaum verwendet. Dieses Verfahren bestand aus in-vivo - Injektion der Siliconverbindung, über eine 26 G - Katheter, in das Portal oder Lebervene. Nach Silikon Injektion wurden Organe explantiert und für die Ex-vivo - Mikro-CT (μCT) Scannen vorbereitet. Die Silikon-Injektionsverfahren ist technisch anspruchsvoll. ein erfolgreiches Ergebnis zu erreichen, erfordert umfangreiche mikro Erfahrung des Chirurgen. Eine der Herausforderungen dieses Verfahren beinhaltet die Bestimmung der angemessenen Perfusionsgeschwindigkeit für die Siliconverbindung. Die Perfusionsgeschwindigkeit für die Silicon-Verbindung muss auf der Basis der hämodynamischen des Gefäßsystems von Interesse definiert werden. Unangemessen Perfusionsrate kann zu einer unvollständigen Perfusion, künstliche Dilatation und Ruptur von Gefäßbäumen führen. Die 3D-Rekonstruktion des Gefäßsystems wurde auf CT-Scans basieren und wurde erreicht unter Verwendung vonpräklinische Software wie HepaVision. Die Qualität des rekonstruierten Gefäßbaum wurde direkt auf die Qualität des Silicon-Perfusions verwandt. Anschließend berechnet Gefäßparameter indikativ für Gefäßwachstum, wie Gesamtgefäßvolumen, wurden basierend auf den vaskulären Rekonstruktion berechnet. Kontras den Gefäßbaum mit Silikon für die anschließende histologische Aufarbeitung der Probe nach μCT Scannen erlaubt. Die Probe kann auf Serienschnitt, histologische Analyse und ganze Dia Scan unterzogen werden, und danach auf 3D-Rekonstruktion der Gefäßbäume basierend auf histologischen Bildern. Dies ist die Voraussetzung für die Erkennung von molekularen Ereignissen und deren Verteilung in Bezug auf den Gefäßbaum. Dieses modifizierte Silikoninjektionsverfahren können auch die Gefäßsysteme anderer Organe zu visualisieren und zu rekonstruieren, verwendet werden. Diese Technik hat das Potenzial, umfassend Studien angewendet werden Gefäßanatomie über und Wachstum in verschiedenen Tier and Krankheitsmodelle.

Qualitätskriterien Die Qualität der Silikoninjektion kann mit dem bloßen Auge während des Verfahrens beurteilt werden. Die kleinen Schiffe, die auf Leberoberfläche füllen nach und nach mit der blauen Verbindung. Wenn der normale vaskuläre Struktur auf der Leberoberfläche beobachtet wurde, wurde die Siliconkautschukinjektionsqualität gut. Wenn der Perfusionsvolumen unzureichend war, wurden die kleinen Gefäße au...

Werkzeuge, die zur Visualisierung der Gefäßregeneration verwendet werden, erfordern Methoden zur Gegenüberstellung der Gefäßbäume. Dieser Film demonstrierte eine filigrane Injektionstechnik, die verwendet wurde, um einen optimalen Kontrast der Gefäßbäume zu erreichen, und veranschaulichte die potenziellen Vorteile, die sich aus einer detaillierten Analyse der resultierenden Probe mittels μCT und histologischer Serienschnitte ergeben.

Visualisierung von Gefäß- und Parenchymregeneration nach 70% Teilhepatektomie in normalen Mäusen

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Visualisierung der vaskulären und parenchymalen Regeneration nach 70 % partieller Hepatektomie bei normalen Mäusen. Traditionell wird die Leberregeneration durch die Messung des Anstiegs von Lebergewicht und -volumen sowie durch die Bestimmung der Proliferationsrate der Hepatozyten beurteilt. Heutzutage liegt das Interesse auf der vaskulären Regeneration der Leber bei Mäusen, und es soll das Wachstum der Blutgefäße sichtbar gemacht und quantifiziert werden.Daher etablieren wir den Arbeitsablauf zur Bildgebung der vaskulären Regeneration. Der Arbeitsablauf umfasst vier Schritte: Kontrastierung des Gefäßbaums, Erfassung von CT-Scans, 3D-Rekonstruktion sowie quantitative und qualitative Analyse der resultierenden Bilder. Der Arbeitsablauf beginnt mit der Kontrastierung des Gefäßbaums.Zunächst exponieren wir die Leber, entweder eine normale oder eine resezierte, und injizieren anschließend die polymerisierende Silikon-Kontrastmasse entweder in die Pfortader oder in die Lebervene, abhängig vom interessierenden Gefäßsystem. Danach werden die explantierten Lebern einer Mikro-CT-Untersuchung unterzogen. Nach der Aufnahme führen wir eine 3D-gezielte Rekonstruktion der Gefäße mit der Imalytics Preclinical-Software durch.Wenn die technische Qualität der resultierenden Bilder ausreichend ist, kann eine 3D-Rekonstruktion mithilfe von HepaVision durchgeführt werden. Dieses Programm wird in Kliniken zur Planung hepatobiliärer Eingriffe verwendet. Neben der 3D-Visualisierung des Gefäßbaums ermöglicht die Software die Darstellung und Berechnung des Lebervolumens – sowohl des Gesamtvolumens als auch der einzelnen Lappen – basierend auf den versorgenden und abführenden Gefäßen.Nach der Rekonstruktion können wir mithilfe computergestützter Verfahren zusätzliche Parameter bestimmen, die auf das Gefäßwachstum hinweisen, wie beispielsweise die Länge und der Durchmesser eines bestimmten Gefäßes. Dies ermöglicht eine quantitative Beschreibung des Gefäßwachstums. Andererseits können in Formalin fixierte Microfil-Proben in Serienschnitte zerschnitten werden.Die seriellen Schnitte können mit einem Ganzpräparat-Scanner angefärbt und digitalisiert werden. Nach der starren und elastischen Registrierung der seriellen Schnitte lassen sich 3D-Gefäßbäume sowohl des portalen als auch des hepatischen venösen Systems rekonstruieren. In einem zukünftigen Schritt möchten wir die räumliche Verteilung molekularer Ereignisse untersuchen.Ein Beispiel für ein molekulares Ereignis von Interesse bei der hepatischen Regeneration ist das Auftreten des Proliferationsmarkers Ki-67 in den Hepatozytenkernen und dessen räumliche Verteilung in den dreidimensional rekonstruierten vaskulären Bäumen. Als Nächstes werden wir eine detaillierte Einführung in die Durchführung der Microfil-Injektion geben. Vorbereitung der Reagenzien.Für die Microfil-Verbindungsmischung benötigen wir MV-Verdünnungsmittel, MV-Verbindung, in unserem Fall das blaue MV-120, und Aushärtungsmittel. Außerdem benötigen wir Pipetten, ein Gefäß und einen Pipettierer. Bereiten Sie zwei Milliliter MV-120 in einem Fünf-Milliliter-Gefäß vor.Anschließend verdünnen Sie es, indem Sie drei Milliliter MV-Verdünnungsmittel hinzufügen. Mischen Sie die Lösungen durch vorsichtiges Schütteln. Für die Heparin-Salzlösung geben Sie 1 Milliliter Heparin zu 10 Milliliter Salzlösung hinzu.Vorbereitung des Operationstisches. Zunächst benötigen wir ein Mikroskop, zweitens wird ein Satz an Verbrauchsmaterialien benötigt. 6-0 Seiden- und 6-0 Polypropylennähte, Fünf-Milliliter- und Ein-Milliliter-Spritzen, 30-Gauge- und 21-Gauge-Nadeln, Verlängerungsschlauch zur Verbindung von Spritze und Katheter, 26-Gauge-Katheter mit Nadeleinführung, Wattestäbchen und Mullbinden.Drittens werden chirurgische Instrumente benötigt. Mikroinstrumente, Klemmen und ein elektrischer Koagulator. Viertens wird eine Perfusionspumpe benötigt.Vorbereitung des Tieres. Das Maus in die Narkoseinduktionskammer geben und mit 2 % Isofluran und 0,3 Milliliter pro Minute Sauerstoff anästhesieren. Die anästhesierte Maus mit Klebeband auf dem Operationstisch fixieren, wobei kontinuierlich 2 % Isofluran und 0,3 Milliliter pro Minute Sauerstoff inhaliert werden.Microfil-Injektion, portales Venensystem. Führen Sie einen Querschnitt am Bauch mit einer Schere für die Hautschicht und einem elektrischen Koagulator für die Muskelschicht durch. Verlagern Sie den Darm mithilfe von Wattestäbchen nach links und bedecken Sie den Darm mit mit Kochsalzlösung getränktem Mull. Präparieren Sie die Pfortader unter dem Mikroskop. Legen Sie eine 6-0-Seidennaht unterhalb der extrahepatischen Pfortader in einem Abstand von etwa einem Millimeter zur Bifurkation an. Knoten Sie sie locker, um sie später verwenden zu können.Spritzen Sie die Heparin-Salzlösung über eine Penisvene für eine systemische Heparinisierung über fünf Minuten. Diese Animation zeigt den Vorgang der Katheterplatzierung. Legen Sie zunächst die 6-0-Seidennaht unterhalb der extrahepatischen Pfortader an, fügen Sie dann den 26-Gauge-Katheter in die Pfortader ein und fixieren Sie ihn mit einer Klemme.Binden Sie die zuvor platzierte Naht zur Fixierung des Katheters und zur Blockierung des Blutflusses aus der Vena splenica und der Vena mesenterica. Hier wird das chirurgische Vorgehen demonstriert. Führen Sie den 26-Gauge-Katheter mit Nadel ein.Schieben Sie den Katheter weiter vor und ziehen Sie gleichzeitig langsam die Nadel heraus. Sichern Sie den Katheter mit einer Klemme. Füllen Sie den Katheter vollständig mit Heparin-Salzlösung, um Luftblasen zu vermeiden.Verbinden Sie das Verlängerungsrohr mit dem Katheter und befestigen Sie beide fest. Schalten Sie die Perfusionspumpe ein. Beginnen Sie die Heparin-Saline-Perfusion mit einer Flussrate von 0,4 Milliliter pro Minute.Beobachten Sie, wie die rechten Lappen unmittelbar nach der Perfusion blass werden. Spülen Sie die Leber mit Kochsalzlösung, um sie während des gesamten Perfusionsvorgangs feucht zu halten. Töten Sie die Maus durch Exsanguination mittels Perfusion unter Anästhesie.Führen Sie die Heparin-Perfusion mehrere Minuten lang fort, bis die gesamte Leber blass wird. Vor der Microfil-Perfusion geben Sie 0,1 Milliliter Härtemittel in die vorbereitete Microfil-Mischung, um den Polymerisationsvorgang zu beschleunigen. Füllen Sie die Microfil-Mischung in eine Fünf-Milliliter-Spritze und eine Verlängerungsschlauchleitung.Entfernen Sie die Luftblasen, indem Sie die Heparin-Salzlösung wie zuvor in den Katheter injizieren. Verbinden Sie den Schlauch mit dem Katheter und befestigen Sie ihn fest. Beginnen Sie die Microfil-Injektion mit einer Flussrate von 0,2 Milliliter pro Minute für ungefähr eine bis zwei Minuten.Beobachten Sie, wie sich das blaue Mittel langsam in die Zweige der Pfortader ausbreitet. Stoppen Sie die Perfusion, wenn die blaue Gefäßstruktur auf der Oberfläche jedes Leberlappens erscheint, wie durch einen roten Kreis angezeigt. Lassen Sie die Leber mindestens 15 Minuten lang zur Polymerisation der Microfil-Verbindung stehen.Microfil-Injektion, hepatisches venöses System. Das Verfahren folgt im Wesentlichen denselben Schritten wie die Injektion in das portalvenöse System. Legen Sie eine 6-0-Seidennaht unterhalb der extrahepatischen Vena portae in einem Abstand von etwa einem Millimeter zu ihrer Bifurkation an.Danach einen Katheter in die Pfortader einführen und mit einer Klemme fixieren. Einen weiteren Katheter in die untere Hohlvene einführen und ebenfalls mit einer Klemme befestigen. Die zuvor platzierte Naht ligieren, um den Katheter zu fixieren und den Blutfluss aus der Milzvene und der Mesenterialvene zu blockieren.Platzieren Sie eine Klemme an der suprahepatischen Vena cava inferior, um den Abfluss aus der Leber zu unterbinden. Ligieren Sie die Seitenäste der Vena cava inferior, einschließlich beider Nierenvenen und dem distalen Ende der Vena cava inferior. Spülen Sie die Leber über Katheter eins mit Heparin-haltiger Kochsalzlösung aus.Perfusieren Sie das hepatische venöse System über Katheter zwei mit der Microfil-Verbindung. Ergebnisse, Mikro-CT-Rekonstruktion. Wir erhielten 3D-gefäßmäßige Rekonstruktionen mittels Imalytics Preclinical-Software nach Mikro-CT-Scannen.Die vaskuläre Regeneration sowohl im portalen als auch im hepatischen venösen System zeigte sich als Verlängerung und Verbreiterung der Hauptgefäße in Kombination mit der Ausbildung von kleineren Seitenästen. Am zweiten postoperativen Tag verlängerten sich die Gefäßbäume der verbleibenden Lappen. Bis zum siebten postoperativen Tag wurden zusätzliche kleine Äste derselben Hauptporta- und der Lebervene sichtbar.Ergebnisse, dreidimensionale farbkodierte Rekonstruktion des hepatischen Gefäßbaums und der zugehörigen hepatischen Anteile. Jedes Leberlappen wurde nach der farbkodierten Rekonstruktion mittels HepaVision in allen drei Dimensionen leicht sichtbar. Wie in der Tabelle angegeben, wurden die Lebervolumina der gesamten Leber und jedes einzelnen Lappens bestimmt, wie hier für das hepatische Venensystem einer normalen Leber dargestellt.Ergebnisse, Serienschnitte und Rekonstruktion. Andererseits wurde die formalinfixierte Microfil-Probe einer Serienschnitttechnik unterzogen. Die gefärbten Serienschnitte wurden mithilfe eines Ganzpräparat-Scanners digitalisiert und zur Rekonstruktion des vaskulären Baums beider Systeme verwendet.Dies sind Querschnitte eines Stapels serieller Mausleber-Schnitte vor und nach starrer und elastischer Registrierung. Nach der computergestützten Registrierung können das portalvenöse und das hepatische venöse System in einem einzigen 3D-Modell rekonstruiert werden. Dieser manuell und rechnerisch zeitaufwändige Schritt erfordert weitere Optimierung.Der nächste Schritt, nämlich die Visualisierung der räumlichen Verteilung molekularer Ereignisse in Bezug auf die Gefäßbäume, befindet sich derzeit in der Entwicklung. Dieser Schritt könnte als Fusion von Mikro-CT-Daten, die aus dem kontrastierten Gefäßbaum stammen, mit histologischen Informationen oder als 3D-Visualisierung rein histologischer Informationen realisiert werden. In diesem Fall würde die Mikro-CT-Information als Qualitätskontrolle für die anspruchsvolle, auf Histologie basierende 3D-Rekonstruktion dienen.Einmal erreicht, verfügen wir über ein Werkzeug, um die Leberregeneration besser zu untersuchen, insbesondere die räumliche Verteilung molekularer Ereignisse und des hepatischen Parenchyms in Bezug auf die vaskuläre Regeneration.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir haben ein Protokoll für die Durchführung von teilweise Hepatektomie (PHx) und Zelltransplantation über Milz in NOD beschrieben. SCID (NICKEN. CB17-Prkdcscidj) Mäuse. In diesem Protokoll wird ein Einschnitt gemacht, zu entlarven und den linken Leberlappen folgte ein weiterer Einschnitt für die intrasplenic Transplantation von Zellen zu resezieren.

Intrasplenic Transplantation von Leberzellen nach teilweiser Hepatektomie in NOD. SCID-Mäuse

Hier präsentieren wir eine neue Methode zur teilweisen Resektion des linken hepatischen Lappens bei Neugeborenen (Tag 0) Mäusen. Dieses neue Protokoll eignet sich für akute Leberschädigung und Verletzungen Reaktion in der neonatalen Einstellung zu studieren.

Partielle Lobuläres Hepatektomie: Chirurgische Modell für morphologische Leberregeneration

Wir etablieren eine neuartige Operationstechnik für ein Modell in Vivo einzelne Leber Lappen Perfusion in der Ratte als Voraussetzung für das weitere Studium in Vivo teilweise Leber engineering in der Zukunft.

Eine neuartige Operationstechnik als Grundlage für In Vivo teilweise Leber Engineering in der Ratte

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Entfernung des Bauchlappens der Leber bei erwachsenen Zebrafischen, um die Untersuchung der Leberregeneration zu ermöglichen.

Partielle Hepatektomie bei erwachsenen Zebrafischen

Lipidbeladene Hepatozyten sind der Leberregeneration inhärent, gehen aber normalerweise bei der Zentrifugation mit Dichtegradienten verloren. Hier stellen wir ein optimiertes Zellisolationsprotokoll vor, das steatotische Hepatozyten beibehält, was repräsentative Populationen von regenerierenden Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen ergibt.

Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

In diesem Protokoll diskutieren wir die Implementierung eines Modells für eine erfolgreiche orthotope Lebertransplantation (OLT) bei Mäusen. Darüber hinaus werden auch Adjuvantien zur weiteren Analyse der Durchgängigkeit von Transplantaten nach erfolgreicher OLT in einer Maus diskutiert, insbesondere unter Verwendung von Mikrocomputertomographie (microCT)-Scans.

Erfolgreiche orthotope Lebertransplantation bei Mäusen mittels Mikrocomputertomographie-Angiographie

Es hat sich gezeigt, dass die Assoziierung der Leberpartition und der Pfortaderligatur bei der gestiebenen Hepatektomie (ALPPS) mehrere Wochen nach der Operation im ersten Stadium zu einer bemerkenswerten Leberregeneration führt. Tiermodelle, die einer ALPPS unterzogen wurden, wurden entwickelt, um die potenzielle Regenerationsfähigkeit der Leber zu untersuchen und günstige klinische Ergebnisse zu erzielen.

Ein Mausmodell der zugehörigen Leberpartition und der Pfortaderligatur für ein gestuftes Hepatektomieverfahren mit Hilfe der Mikroskopie

Dieses Protokoll enthält technische Informationen für die Gefäßrekonstruktion mit der Manschettentechnik bei der orthotopen Lebertransplantation der Maus.

Gefäßrekonstruktion mit der Manschettentechnik bei der orthotopen Lebertransplantation der Maus

Organoide, die aus Patiententumoren erzeugt werden, werden orthotopisch in die Leber der Maus injiziert. Die Resektion von nicht-tumorösem Lebergewebe führt zu einer regenerativen Umgebung im Lebergewebe, in dem sich der Tumor befindet.

Ein von Patienten mit hepatozellulärem Krebs abgeleitetes Organoid-Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung des Einflusses der Leberregeneration auf das Tumorwachstum

Das Mausmodell der partiellen 2/3 (66%) Hepatektomie ist in der Literatur gut beschrieben, aber ausgedehntere Hepatektomien, die das Small-for-Size-Syndrom nach Lebertransplantation nachahmen, wurden selten verwendet. Wir beschreiben eine erweiterte 78%ige Hepatektomie in einem Mausmodell, die bei gesunden Mäusen zu einer postoperativen Letalität von etwa 50% führt.

Erweiterte 78%-Hepatektomie in einem chirurgischen Mausmodell

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Bildgebende Pipeline, um die Morphologie hepatischer Stellatenzellen im intakten Lebergewebe zu visualisieren und zu modellieren. Dieser Ansatz kombiniert fluoreszierende Markierung von Fibroblasten mittels Mausgenetik, in situ leberperfusionsbasierte Gewebevorbereitung und eine modifizierte iDISCO-Gewebereinigungsmethode, um optische Transparenz zu erreichen.

Kartierung der Morphologie hepatischer stellater Zellen in Mausmodellen der Leberfibrose

Erfahren Sie eine Methode zur Visualisierung der Gefäßregeneration nach Teilhepatektomie bei Mäusen mittels µCT und 3D-Rekonstruktion. Dieser Workflow ermöglicht die quantitative Analyse vaskulärer Wachstumsprozesse in der Leber.

Visualisierung von Gefäß- und Parenchymregeneration nach 70% Teilhepatektomie in normalen Mäusen

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