Name: Die Erzeugung von Induced-pluripotenten Stammzellen Fibroblast-wie Synoviozyten Isoliert von Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus fibroblastenartigen Synoviozyten von Patienten mit rheumatoider Arthritis mittels lentiviralem System ohne Feederzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Krankheitsmechanismen.

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Diese Arbeit wurde durch das Forschungsprogramm unterstützt, das von den Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188) finanziert wurde.

Ethik-Erklärung: Diese Studienprotokoll vom Institutional Review Board der Katholischen Universität von Korea (KC12TISI0861) genehmigt wurde. 1. Synoviocyte Isolierung und Expansion <ol><li> Synoviocyte Isolation <ol><li> Sterilisieren zwei Paare von chirurgische Scheren und ein Paar Zangen. </li><li> Übertragung der synovialen Gewebe zu einer 100 mm-Schale und wasche mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 1% Penicillin / Streptomycin. </li><li> Schneiden Sie die gelbliche Fettgewebe und Knochenreste aus. Bringen Sie das zugeschnittene Gewebe auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und 5 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 20% fötalem Rinderserum (FBS). </li><li> Hacken Sie die Gewebe mit der Schere bis die Stücke sind klein genug, um eine Einweg-Pipette eindringen. </li><li> Übertragen, um das Gewebe enthaltende Medium zu einem 50 ml konischen Röhrchen. Ernten Sie die verbleibende Material durch Zugabe von 5 ml DMEM mit 20% FBS auf die 6-Well-Platte und dann übertragen auf das Rohr. &lt;/ Li&gt; <li> Thaw Kollagenase auf Eis. Hinzufügen Kollagenase bis zu einer Endkonzentration von 0,01% und dichten das Rohr mit Parafilm. Inkubieren in einem Wasserbad bei 37 ° C mit 4 h schütteln. </li><li> Nach der Inkubation Füllen des Röhrchens mit DMEM mit 20% FBS, bis das Gesamtvolumen 50 ml und Zentrifuge bei 300 xg ist, RT für 10 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie 40 ml Medium, das Pellet zu resuspendieren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.1.10-1.1.11. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 25 ml DMEM mit 20% FBS und warten auf die großen Klumpen von Gewebe auf den Boden zu versenken. </li><li> Den Überstand auf eine 100 mm - Schale und inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 für 14 Tage. </li></ol></li><li> Synoviocyte Wartung und Erweiterung <ol><li> Entsorgen Sie die Medien von der Platte und die Zellen werden mit 5 ml PBS. </li><li> 1 ml PBS / 1 mM EDTA und Inkubation bei 37 ° C in 5% CO 2 für 2 min. </li><li> Tippen Sie auf die Schale sanft und transfer die Zellen einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 · g, RT für 2 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand ohne das Pellet zu stören und das Pellet in 30 ml DMEM mit 20% FBS resuspendiert. </li><li> Übertragen Sie die Zellen bis 3 x 100-mm-Schalen, ohne sichtbare Überbleibsel Material zurückbleibt. </li><li> Ersetzen Sie die Medien durch frische Medien alle 3 d. Aufgeteilt, die Zellen bei 80% Konfluenz unter Verwendung von 1 ml PBS / 1 mM EDTA. Pflegen bis Passage 3 vor dem Gebrauch. Teilen Sie jedes Gericht von Zellen in drei Gerichte in jedem Split. HINWEIS: Nach dem Durchgang Erreichen 3, Zellen, die nicht sofort eingefroren werden können, verwendet werden werden. </li></ol></li></ol> 2. Reprogrammierung FLSS Mit Lentiviren kodierenden Yamanaka Faktoren <ol><li> Transduction (D0) <ol><li> Seed 3 × 10 4 Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen in Wachstumsmedium (500 ml DMEM , supplementiert mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin). Inkubiere die Zellen O / N bei 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie ein Fläschchen von Lentiviren, die 4 Yamanaka Faktoren: Oct4, Klf4, Sox2 und c-Myc aus dem Gefrierschrank und Tauwetter bei 4 ° C. Hinweis: Lentivirus wurde durch das Verfahren hergestellt , beschrieben in unserer früheren Studie 11. </li><li> Während das Virus Auftauen, ändern Sie die Medien zu FLS Wachstumsmedien (20% FBS und Antibiotika in DMEM) 10 ug / ml Hexadimethrinbromid und 50 ug / ml Ascorbinsäure enthält. </li><li> Nach den Medienwechsel, fügen Sie 30 ul Lentiviren zu den Zellen und vorsichtig mischen. Zur Verbesserung der Infektion, Zentrifuge die Platte bei 680 · g, 35 ° C für 30 min. </li><li> Nach der Zentrifugation inkubiert , die Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol></li><li> Wartung Bis Reprogrammierung ist sichtbar <ol><li> Für 3 Tage, ersetzen Sie die Medien täglich mit FLS Wachstumsmedium 0,1 mM Natriumbutyrat und 50 ug / ml Ascorbinsäure enthält. </li><li> Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Medium mit einer Mischung aus FLS Wachstumsmedien undiPSC Medien (Verhältnis 1: 1), enthaltend 0,1 mM Natriumbutyrat und 50 ug / ml Ascorbinsäure. Hinweis: Die Komponenten der iPSC Medien in der Materialien / Ausstattungsliste gegeben. </li></ol></li><li> Teilen von Zellen für die Koloniebildung <ol><li> Bereiten Sie eine Vitronectin beschichteten 6-Well-Platte. <ol><li> Werden 60 &amp; mgr; l Vitronectin bis 6 ml PBS ohne Ca 2+ und Mg 2+. Setzen Sie 2 ml Mischung in den einzelnen Wells und Inkubation mindestens 1 Stunde in RT. Hinweis: Die Arbeitskonzentration von Vitronectin beträgt 5 &amp; mgr; g / mL. </li></ol></li><li> Auf D5, waschen Sie die Zellen mit PBS. </li><li> 1 ml PBS / 1 mM EDTA , die Zellen abzulösen und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2 min inkubieren. </li><li> Ernten Sie die Zellen und Zentrifuge bei 250 xg, RT für 2 min. </li><li> Aufgeteilt, die Zellen bei 3 verschiedenen Verhältnissen (1: 3, 1: 6 und 1: 9) an unterschiedliche confluencies erzielen. Hinzufügen, 900 &amp; mgr; l Medium zu dem Zellpellet und resuspendieren. Hinzufügen von 300, 150 und 100 &amp; mgr; l der Zellmischung pro Vertiefung einer 6-3, 1: 6 und 1: 9, jeweils Well-Platte ein Verhältnis von 1 zu erreichen. </li><li> Ersetzen Sie die Medien täglich mit iPSC Medien bis Kolonien erscheinen. Die Kolonien werden nach etwa D18 erscheinen. Anmerkung: In diesem Stadium iPSC Kolonien koexistieren mit dem nicht umprogrammiert FLSS. </li></ol></li><li> Colony Kommissionierung <ol><li> Bereiten Sie eine 48-Well Vitronectin beschichteten Platte durch Zugabe von 500 ul Vitronectin an den Brunnen, und bei RT inkubieren mindestens 1 Stunde für. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop auf eine saubere Bank, und entfernen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator. </li><li> Entfernen Sie die Vitronectin-Lösung aus der 48-Well-Platte und fügen 500 ul iPSC Medien, ergänzt mit 10 mM Rho-assoziierten, Coiled-Coil-containing protein kinase (ROCK) -Inhibitor. </li><li> Mit Hilfe eines 10p-Pipettenspitze, schneiden um die Kolonie. Übertragen Sie die gepflückt Kolonie zu einer Vertiefung der 48-Well-Platte. </li><li> Mehrere Kolonien Nach der Kommissionierung, Inkubation der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Pflegen Sie die Zellen, bis die Kolonien groß eno sindPfui für die Übertragung. Hinweis: Wir in der Regel die Zellen verschüttet, wenn die Kolonie aus dem sichtbaren Bereich des Mikroskops wird, wenn bei 100-facher Vergrößerung betrachtet. </li></ol></li></ol> 3. Immunfluoreszenzanfärbung <ol><li> Zellpräparation <ol><li> Legen Sie eine sterile 18 mm Deckglas in eine 12-Well-Platte. </li><li> 1 ml PBS des Deckglases abkühlen lassen und abspülen. </li><li> Ersetzen mit 1 ml einer 10 ug / ml Vitronectin Lösung. </li><li> Die Platte bei RT für mindestens 1 Stunde. </li><li> Entsorgen Sie die Vitronectin - Lösung und Platte iPSCs in den Vitronectin beschichteten 12-Well - Platte und Kultur für 7 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2, täglich die Medienwechsel. </li></ol></li><li> Zellfärbung <ol><li> Entsorgen Sie die Kulturmedien und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. </li><li> Fixieren Sie die Zellen in 0,4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei RT. </li><li> Permeabilisierung der Zellen mit 0,1% Triton X-100 für 5 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die PermeabilisierungLösung und Block mit PBS 2% Rinderserumalbumin (BSA) für 30 min bei RT enthält. </li><li> Verdünne die Antikörper in PBS , enthaltend 2% BSA gemäß Tabelle 1. Inkubieren der Zellen mit den primären Antikörpern für 2 h bei RT. </li><li> Fügen Sie den sekundären Antikörper (1: 200 verdünnt) und Inkubation der Zellen für 1 h bei RT, Licht zu vermeiden. </li><li> Behandeln Sie die Zellen mit 1 &amp; mgr; l / ml DAPI für 10 min. </li><li> Legen Sie das Deckglas auf dem Glasobjektträger mit Antifade-Reagenz und Inkubation bei RT für 24 h, Vermeidung von Licht. </li><li> Stellen Sie sicher, Ausdruck mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li></ol> 4. Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) <ol><li> Extrahieren von mRNA aus dem Zellpellet unter Verwendung des Guanidinium - Thiocyanat-Phenol-Chloroform - Extraktionsverfahren 11. </li><li> Amplify cDNA von 2 ug Gesamt - mRNA unter Verwendung der reversen Transkription 11. </li><li> Mischen Sie die Komponenten für die PCR benötigten mit 2 ul cDNA temPlatte 11. </li><li> Führen Sie RT-PCR und überprüfen Sie die Ergebnisse durch Gelelektrophorese 11. </li></ol> 5. Alkalische Phosphatase (AP) Staining <ol><li> Kultur iPSCs für 5-7 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2 vor der Färbung. </li><li> Absaugen Medien und fixieren die Zellen mit 4% PFA für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie die Fixiermittel und spülen Sie die Zellen mit 1X Spülpuffer. </li><li> Bereiten Sie die Reagenzien für die AP-Färbung. Mischen Sie die Reagenzien in folgendem Verhältnis: Fast Red Violet: Naphthol AS-BI-Phosphat-Lösung: Wasser = 2: 1: 1. </li><li> Inkubieren der Zellen mit der Färbelösung bei RT für 15 min, leicht vermieden werden. </li><li> Entsorgen Sie die Farblösung und spülen Sie die Zellen mit Spülpuffer. </li><li> Decken Sie die Zellen mit PBS Austrocknen zu verhindern und sicherzustellen, Ausdruck einer Hellfeld-Mikroskop. </li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human blood.</a> Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).</li>
<li>Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes+in+inflammatory+arthritis+pathology%3A+the+emerging+role+of+cadherin-11%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11.</a> Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).</li>
<li>Bartok, B., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes%3A+key+effector+cells+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis.</a> Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis.</a> Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Vor der Entdeckung von iPS-Zellen, vor allem Wissenschaftler verwendeten WSR Stammzellbiologie und andere Zelllinien durch Differenzierung zu untersuchen. Allerdings stammen WSR von der inneren Masse eines Blastozyste, die eine im Frühstadium Embryo ist. WSR, Zerstörung der Blastozyste zu isolieren, ist unvermeidlich, die Erhöhung ethische Fragen, die zu überwinden sind unmöglich. Darüber hinaus, obwohl WSR stemness Eigenschaften und Pluripotenz haben, können sie nicht von Personen gewonnen werden und sind manchmal nich...

Pluripotente Stammzellen sind die Plattform der nächsten Generation in verschiedenen klinischen und biologischen Bereichen. Sie sind ein vielversprechendes Werkzeug, das in Krankheitsmodelle verwendet werden können, Wirkstoff-Screening, und regenerative medizinische Therapie. Humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) wurden vor allem verwendet, um zu studieren und pluripotenten Zellen zu verstehen. Doch durch die Zerstörung des menschlichen Blastozysten isoliert, hESCs sind mit mehreren ethischen Bedenken verbunden. Im Jahr 2007 kehrte Dr. Shinya Yamanaka und sein Team die Zelle Programmierprozess und entwickelt Stammzellen aus menschlichen adulten somatischen Zellen 1,2. Deshalb, im Gegensatz zu hES, induziert-pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) können aus reifen somatischen Zellen erzeugt werden, die ethischen Hürden zu vermeiden. Üblicherweise iPSCs werden durch die Lieferung von vier exogenen Gene erzeugt: Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc. Diese Yamanaka Faktoren sind ursprünglich mit Lentiviren und retrovirale Systeme geliefert. Die ersten iPSCs wurden aus Maus somatischen c abgeleitetells 3. Danach wurde die Technik , um humane dermale Fibroblasten 1,2 angewendet. Nachfolgende Studien erzeugten erfolgreich iPSCs aus verschiedenen Quellen, wie beispielsweise Urin 4, Blut 5,6, Keratinozyten 7 und mehrere andere Zelltypen. Es gibt jedoch einige somatische Zellen sind, die nicht in Umprogrammierung verwendet haben, und Screening der Umprogrammierung Fähigkeiten verschiedener Zelltypen von spezifischen Geweben in Krankheitszustand, ist immer noch erforderlich. Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Erkrankung, die alle Gelenke treffen können und zu Autoimmunerkrankungen in anderen Organen führen. RA betrifft etwa 1% der Erwachsenen in der entwickelten Welt. Es ist eine ziemlich häufige Erkrankung und ihre Häufigkeit steigt jedes Jahr 8. Jedoch ist RA hart in den frühen Stadien und oncebone Zerstörung zu identifizieren auftritt gibt es keine Behandlung, die den Schaden erholen kann. Darüber hinaus unterscheidet sich die Arzneimittelwirksamkeit von Patient zu Patient, und es ist schwer, die Sanitäter zu prognostizierenine, die erforderlich ist. Daher wird die Entwicklung eines Medikaments-Screening-Verfahren benötigt wird, und ein Zellmaterial, das die Bedingungen von RA erforderlich reflektieren kann. Fibroblast-like Synoviozyten (FLSS) sind eine aktive Mobilteilnehmer in der Pathogenese der RA 9,10. FLSS existieren in der synovialen intimale Auskleidung zwischen der Gelenkkapsel und den Hohlraum, der auch als das Synovium bezeichnet wird. Durch die gemeinsame Trägerstruktur und Nährstoffe zu den umgebenden Knorpel Bereitstellung FLSS in der Regel eine entscheidende Rolle bei der Gelenkfunktion und Wartung spielen. Allerdings FLSS in RA haben einen invasiven Phänotyp. RA FLSS haben einen Krebs-ähnlichen Phänotyp, was schließlich den umgebenden Knochen 10 durch unendliche Vermehrung zu zerstören. Mit dieser einzigartigen Charakteristik kann FLSS als vielversprechendes Material verwendet werden, das die Pathobiologie von RA reflektieren kann. Doch werden diese Zellen nur selten hergestellt und die Zelle Phänotypen verändern , wenn die Zellen durch mehrere Passagen in in vitro gehen </em&gt; Bedingungen. Daher kann es RA FLSS als Werkzeug zu benutzen, kompliziert sein, dass der Zustand des Patienten darstellen kann. Theoretisch RA-Patienten stamm iPSCs (RA-iPS-Zellen) kann ein ideales Werkzeug für Wirkstoff-Screening und weitere Forschung. Erzeugte iPSCs haben Selbsterneuerungsvermögen und aufrecht erhalten und in vitro erweitert werden. Mit Pluripotenz, können diese Zellen in reife Chondrozyten und Osteozyten Abstammungslinien unterschieden werden, die Zellmaterial für spezifische Forschung in RA und anderen Knochen bedingte Krankheiten 11 beitragen kann. In dieser Studie zeigen wir, wie FLSS von einem chirurgisch entfernt Synovium zu isolieren und zu erweitern, und wie RA-iPS-Zellen aus FLSS mit Lentiviren enthält Yamanaka Faktoren zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>100 mm Schale</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mlL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Einwegpipette</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Einwegpipette</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>FLS Isolationsmaterialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Zange</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6885-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>54956</td><td></td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039<</td><td></td></tr><tr><td>strong>iPSC Generation Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Polybren</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>iPSC-Medieninhaltsstoff (500 ml)</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>iPSC-Medieninhaltsstoff (Konz.: 543 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>iPSC Medienbestandteil&nbsp; (Konz.: 14 ng/mL)</td></tr><tr><td>Humaner Transfferin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>iPSC-Medienbestandteil (Konz.: 10,7 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Basic FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>iPSC Medienbestandteil&nbsp; (Konz.: 100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>iPSC-Medienbestandteil (Konz.: 20 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Menschliches TGF&beta; 1</td> Inhaltsstoff des <td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>iPSC-Mediums (Konzentration: 2 ng/ml)</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>iPSC-Wirkstoff (Konz.: 64 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Guality Control Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Deckglas</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyd (PFA)</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper</td><td>Molekulare Sonde</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper</td><td>Molekulare Sonde</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifading-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerglas, beschichtet</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalkohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid Erststrang cDNA Synthese Kit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA Polymerase</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>loading star</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) DNA-Leitermarker</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr></tbody></table>

die erzeugung von induced-pluripotenten stammzellen fibroblast-wie synoviozyten isoliert von gelenken von patienten mit rheumatoider arthritis

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Reife somatische Zellen in eine pluripotente Stammzelle ähnlichen Zustand mit einem definierten Satz von Reprogrammierungsfaktoren rückgängig gemacht werden. Zahlreiche Studien haben induzierte pluripotente Stammzellen erzeugt Zellen (iPS-Zellen) aus verschiedenen Zelltypen, die von vier Yamanaka Transkriptionsfaktoren transduzierenden: Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc. Die Studie von iPS-Zellen bleibt auf dem neuesten Stand der biologischen und klinischen Forschung. Insbesondere patientenspezifische iPSCs kann als Pionier Werkzeug für die Untersuchung von Krankheits Pathobiologie verwendet werden kann, da iPSCs aus dem Gewebe eines Individuums induziert werden. Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die durch die Zerstörung von Knorpel und Knochenstruktur in dem gemeinsamen klassifiziert. Synoviale Hyperplasie ist einer der wichtigsten Gründe, oder Symptome, die zu diesen Ergebnissen bei RA führen. Fibroblast-wie Synoviozyten (FLSS) sind die Hauptkomponentenzellen in der hyperplastischen Synovium. FLSS in der gemeinsamen unbegrenzt vermehren, schließlich das benachbarte cartil eindringendenAlter und Knochen. Derzeit kann der hyperplastischen Synovium nur durch einen chirurgischen Eingriff entfernt werden. Das entfernte Synovium ist für RA Forschung als Material verwendet, die die entzündliche Erkrankung des Gelenks widerspiegelt. Als wichtiger Akteur in der Pathogenese der RA kann FLSS als Material verwendet werden, um die iPS-Zellen von RA-Patienten zu erzeugen und zu untersuchen. In dieser Studie verwendeten wir die FLSS eines RA Patienten iPSCs zu erzeugen. Verwendung eines lentiviralen System entdeckten wir, dass FLSS kann RA patientenspezifische iPSC erzeugen. Die iPSCs erzeugt aus FLSS kann weiter als ein Werkzeug verwendet werden, um die Pathophysiologie der RA in der Zukunft zu studieren.

In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll iPSCs von FLSS Verwendung eines lentiviralen System zu erzeugen. 1A zeigt ein einfaches Schema des FLS Isolierungsprotokoll. Verwendung von chirurgischen Scheren nach der chirurgischen Entfernung der Synovia wurde das Gewebe in kleine Stücke zerhackt. Kollagenase wurde zugegeben, um die Zellen aus den Gewebeklumpen zu isolieren. Die Zellen wurden für 14 Tage vor der weiteren Verarbeitung inkubiert. 1B</strong...

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die menschliche Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen von Patienten stammenden Fibroblasten-ähnlichen Synoviozyten, ein lentiviraler System ohne Feeder-Zellen.

Die Erzeugung von Induced-pluripotenten Stammzellen Fibroblast-wie Synoviozyten Isoliert von Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, induzierte pluripotente Stammzellen, oder IPS-Zellen, aus faserähnlichen Synoviozyten zu erzeugen, die aus dem Synovialgewebe eines entzündeten Gelenks bei rheumatoider Arthritis isoliert wurden. Derzeit können iPSCs aus verschiedenen humanen primären Zellen gewonnen werden. Wir haben erfolgreich iPSCs aus humanen faserähnlichen Synoviozyten generiert, die die zentralen pathologischen Zellen rheumatoider Gelenke darstellen.Dies kann zur Untersuchung der Pathologie der rheumatoiden Arthritis beitragen. Diese periodische Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Degeneration von iPSCs unter Verwendung von RA-FLSs zu beantworten. Beginnen Sie damit, das Synovialgewebe in eine 100 Millimeter Schale zu geben und das Gewebe mit 5 Millilitern PBS, ergänzt mit Antibiotika, zu waschen.Entfernen Sie das gelbliche Fettgewebe und Knochenrückstände. Überführen Sie das präparierte Gewebe anschließend in eine Vertiefung einer 6-Loch-Platte, die 5 Milliliter DMEM ergänzt mit FBS enthält, und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Schere, bis die Stücke klein genug sind, um eine Einweg-Pipettenspitze zu durchdringen. Überführen Sie das Medium in ein 50-Milliliter-Konischglas, geben Sie dann 5 Milliliter frisches DMEM mit FBS in die Vertiefung, um verbliebenes Gewebe aufzusammeln, und überführen Sie den gesamten Inhalt der Vertiefung in das Glas.Fügen Sie anschließend eisgetauten Kollagenase in einer Endkonzentration von 0,01 % dem Röhrchen hinzu und verschließen Sie es mit Parafilm, um es unter Schütteln in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius zu inkubieren. Nach vier Stunden füllen Sie das Röhrchen mit frischem DMEM ergänzt mit FBS auf ein Endvolumen von 50 Milliliter auf und sammeln die Gewebefragmente durch Zentrifugation. Entfernen Sie das Überstandvolumen, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen anschließend in 40 Milliliter frischem Medium für eine weitere Zentrifugation.Suspendieren Sie das zweite Pellet erneut in 25 Milliliter frischem DMEM mit FBS und lassen Sie die großen Gewebeklumpen absinken. Überführen Sie dann den Überstand in eine neue 100-Millimeter-Schale und inkubieren Sie die Synoviozyten 14 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2. Um die Synoviozytenkultur zu vergrößern, entsorgen Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie die Zellen mit 5 Milliliter PBS. Entfernen Sie das PBS und lösen Sie die Zellen mit 1 Milliliter EDTA im Zellkulturgehäuse für 2 Minuten auf. Am Ende der Inkubation klopfen Sie vorsichtig auf die Petrischale, um verbliebene anhaftende Zellen abzulösen, und überführen Sie die resultierende Zellsuspension in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen zur Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in 30 Milliliter DMEM und FBS und teilen Sie die Zellen auf 3 neue 100-Millimeter-Schalen auf.Füttern Sie die Synoviozyten alle 3 Tage mit frischem Medium und teilen Sie die Zellen bei 80 % Konfluenz in 3 neue Kulturen auf, wie gerade gezeigt. Am Tag null der Transduktion säen Sie 3 × 10⁴ FLS pro Vertiefung in eine 6-Loch-Platte mit frischem Wachstumsmedium für eine Übernacht-Inkubation bei 37 °C in 5 % CO₂ aus. Am nächsten Tag tauen Sie eine Vial Lentivirus, die die 4 Yamanaka-Faktoren enthält, bei 4 °C auf und ersetzen das FLS-Kulturmedium durch FLS-Wachstumsmedium, ergänzt mit Hexadimethrinbromid und Ascorbinsäure.Nachdem der Inhalt des Vials aufgetaut ist, 30 Mikroliter Lentivirus zu den Zellen geben und vorsichtig mischen, um das Virus gleichmäßig zu verteilen. Um die Infektion zu verbessern, die Platte zentrifugieren und die Zellen anschließend in den Inkubator zurückbringen. Das Medium dabei jeden Tag durch frisches FLS-Wachstumsmedium mit Natriumbutyrat und Ascorbinsäure ersetzen, und zwar über einen Zeitraum von 3 Tagen. Am 4. Tag das Medium durch eine Mischung aus FLS-Wachstums- und iPSC-Medium, das Natriumbutyrat und Ascorbinsäure enthält, ersetzen.Am Tag 5 fügen Sie 60 Mikroliter Vitronectin zu 6 Milliliter PBS ohne Calcium und Magnesium hinzu und beschichten 3 Vertiefungen einer 6-Loch-Platte jeweils mit 2 Milliliter der Lösung für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur. Während das Vitronectin andockt, waschen Sie die transduzierten Zellen mit PBS und lösen sie mit EDTA wie gezeigt ab. Nachdem Sie die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation gesammelt haben, resuspendieren Sie das Pellet in 900 Mikroliter frischem Medium.Entfernen Sie das überschüssige Vitronectin aus den Vertiefungen und geben Sie 300, 150 bzw. 100 Mikroliter Zellen in einzelne Vertiefungen. Bringen Sie die Zellen anschließend in den Inkubator zurück und ersetzen Sie das Medium täglich durch frisches iPSC-Medium, bis Kolonien sichtbar werden. Um die Kolonien auszuwählen, geben Sie zunächst 500 Mikroliter iPSC-Medium, ergänzt mit ROCK-Inhibitor, in jede Vertiefung einer mit Vitronectin beschichteten 48-Loch-Platte.Dann stellen Sie die FLS-Kulturen unter ein Stereomikroskop auf eine saubere Arbeitsfläche und schneiden Sie mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze um eine interessierende Kolonie herum. Übertragen Sie die ausgewählte Kolonie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze in ein Loch der 48-Loch-Platte. Nachdem alle Kolonien ausgewählt wurden, stellen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator, bis die Kolonien groß genug für die Übertragung sind.Teilen Sie die Zellen, wenn die Kolonien außerhalb des sichtbaren Mikroskopfeldes liegen, wie bei 100facher Vergr&ouml;&szlig;erung beobachtet. In diesem Bild kann die Morphologie der isolierten FLS nach einer anf&auml;nglichen 14-t&auml;gigen Kultur beobachtet werden. Die Zellen weisen die allgemeinen Merkmale von Fibroblasten auf, einschlie&szlig;lich eines &auml;hnlichen Expressionsmusters der fibrotischen Marker Vimentin und Fibronectin sowie einer geringen Expression des makrophagen&auml;hnlichen Synoviozyten-Markers CD-68. 8 bis 11 Tage nach der Lentiviraltransduktion mit den Yamanaka-Faktoren bilden sich kleine Kolonien, die isoliert und &uuml;ber 5 bis 10 Passagen amplifiziert werden k&ouml;nnen.Diese aus rheumatoider Arthritis abgeleiteten iPSCs exprimieren alkalische Phosphatase, was darauf hinweist, dass sie undifferenziert bleiben. Die Zellen exprimieren außerdem pluripotente Marker, wie durch RT-PCR und Immunfluoreszenzanalyse bestätigt wurde. iPSCs aus rheumatoider Arthritis weisen ein normales chromosomales Muster von 44+XY auf, wie durch Karyotypisierung ermittelt wurde.Weiterhin bildeten die aus Fibroblasten-ähnlichen Synovialzellen (FLSs) gewonnenen induziert pluripotenten Stammzellen (iPSCs) bei Rheumatoider Arthritis zwölf Wochen nach ihrer Injektion in SCID-Mäuse Teratome, die vielfältige Gewebe-Phänotypen aufwiesen. Die Differenzierung in Keimblätter wurde durch immunfluoreszenzchemische Färbung bestätigt. Sobald die Technik beherrscht ist, können iPSCs aus FLSs mit Synovialgewebe generiert werden.Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie man aus synovialem Gewebe isoliert und wie man die Umprogrammierung unter Verwendung dieser Zellen induziert. Diese aus RAF-FLS gewonnenen iPSCs können nützlich sein, um Regenerationsprozesse oder Wirkstoffscreenings in der Rheumatologie zu untersuchen. Sobald diese iPSCs etabliert sind, können verschiedene Arten von Zielzellen oder Organen erzeugt werden.Die für die Untersuchung der Krankheit oder andere zukünftige Anwendungen, wie etwa Genom-Editierung und dergleichen, nützlich sein könnten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Die Erzeugung von Induced-pluripotenten Stammzellen Fibroblast-wie Synoviozyten Isoliert von Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis (Video) | JoVE Journal

Die Erzeugung von Induced-pluripotenten Stammzellen Fibroblast-wie Synoviozyten Isoliert von Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis

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