Die Erzeugung von Induced-pluripotenten Stammzellen Fibroblast-wie Synoviozyten Isoliert von Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die menschliche Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen von Patienten stammenden Fibroblasten-ähnlichen Synoviozyten, ein lentiviraler System ohne Feeder-Zellen.

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, induzierte pluripotente Stammzellen (IPCs) aus Fibroblasten-ähnlichen Synoviozyten zu erzeugen, die aus dem Synovialgewebe eines an rheumatoider Arthritis entzündeten Gelenks isoliert wurden. Derzeit können iPSCs aus verschiedenen menschlichen Primärzellen erzeugt werden. Wir haben erfolgreich iPSCs aus humanen Fibroblasten-ähnlichen Synoviozyten generiert, die die pathologischen Schlüsselzellen der rheumatoiden Gelenke sind.

Dies kann helfen, die Pathologie der rheumatoiden Arthritis zu untersuchen. Diese Zeitschrift kann helfen, wichtige Fragen zur Degeneration von IPSCs mit RA-FLS zu beantworten. Beginnen Sie damit, das Synovialgewebe in eine 100-Millimeter-Schale zu legen und das Gewebe mit 5 Millilitern PBS zu waschen, das mit Antibiotika ergänzt wird.

Entfernen Sie das gelbliche Fettgewebe und die Knochenreste. Übertragen Sie dann das getrimmte Gewebe in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit 5 Millilitern DMEM, ergänzt mit FBS, und hacken Sie das Gewebe mit einer Schere, bis die Stücke klein genug sind, um eine Einweg-Pipettenspitze zu durchdringen. Übertragen Sie das Medium in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, geben Sie dann 5 Milliliter frisches DMEM plus FBS in die Vertiefung, um das restliche Gewebe zu sammeln und den gesamten Inhalt der Vertiefung in das Röhrchen zu übertragen.

Geben Sie anschließend eisaufgetaute Kollagenase in einer Endkonzentration von 0,01 % in das Röhrchen und verschließen Sie das Röhrchen mit Parafilm für die Inkubation in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad unter Schütteln. Nach vier Stunden füllen Sie das Röhrchen mit frischem DMEM plus FBS bis zu einem Endvolumen von 50 Millilitern und sammeln die Gewebefragmente durch Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und suspendieren Sie die Zellen in 40 Millilitern frischem Medium für eine weitere Zentrifugation.

Suspendieren Sie das zweite Pellet in 25 Millionen frischem DMEM plus FBS und lassen Sie die großen Gewebeklumpen absetzen. Dann überträgst du den Überstand in eine neue 100-Millimeter-Schale und inkubierst die Synoviozyten 14 Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Um die Synoviozytenkultur zu erweitern, verwerfen Sie das verwendete Medium und waschen Sie die Zellen in 5 Millilitern PBS.

Entfernen Sie das PBS und dissoziieren Sie die Zellen mit 1 Milliliter EDTA im Zellkultur-Inkubator für 2 Minuten. Am Ende der Inkubation klopfen Sie vorsichtig auf die Schale, um alle verbleibenden anhaftenden Zellen zu lösen, und überführen Sie die resultierende Zellsuspension zur Zentrifugation in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Suspendieren Sie das Pellet wieder in 30 Millilitern DMEM und FBS und teilen Sie die Zellen in 3 neue 100-Millimeter-Schalen auf.

Füttern Sie die Synoviozyten alle 3 Tage mit frischem Medium und teilen Sie die Zellen in 3 neue Kulturen mit 80% Konfluenz, wie gerade gezeigt. Am Transduktionstag Null sehen Sie 3 x 10 bis 4. FLS pro Well auf eine 6-Well-Platte in frischem Wachstumsmedium für eine Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2. Tauen Sie am nächsten Tag 1 Durchstechflasche Lenti-Virus mit 4 Yamanaka-Faktoren bei 4 Grad Celsius auf und ersetzen Sie das FLS-Kulturmedium durch FLS-Wachstumsmedium, das mit Hexadimethrinbromid und Ascorbinsäure ergänzt wird.

Wenn der Inhalt des Fläschchens aufgetaut ist, geben Sie 30 Mikroliter Lenti-Virus zu den Zellen und mischen Sie es vorsichtig, um das Virus gleichmäßig zu verteilen. Um die Infektion zu verbessern, zentrifugieren Sie die Platte und geben Sie die Zellen wieder in den Inkubator, wobei Sie das Medium jeden Tag durch frisches FLS-Wachstumsmedium ersetzen, das Natriumbutyrat und Ascorbinsäure enthält. Ersetzen Sie das Medium am 4. Tag durch eine Mischung aus FLS-Wachstums- und iPSC-Medium, das Natriumbutyrat und Ascorbinsäure enthält.

Am Tag 5 fügen Sie 60 Mikroliter Vitronektin zu 6 Millilitern PBS ohne Calcium und Magnesium hinzu und beschichten Sie 3 Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit je 2 Millilitern der Lösung für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur. Während das Vitronektin aushärtet, waschen Sie die transduzierten Zellen mit PBS und lösen Sie sie mit EDTA ab, wie gezeigt. Nachdem Sie die dissoziierten Zellen durch Zentrifuguation gesammelt haben, suspendieren Sie das Pellet wieder in 900 Mikrolitern frischem Medium.

Entfernen Sie das überschüssige Vitronektin aus den Vertiefungen und geben Sie 300, 150 und 100 Mikroliter Zellen in einzelne Vertiefungen. Setzen Sie dann die Zellen wieder in den Inkubator ein und ersetzen Sie das Medium täglich durch frisches iPSC-Medium, bis Kolonien erscheinen. Um die Kolonien auszuwählen, geben Sie zunächst 500 Mikroliter iPCS-Medium, ergänzt mit ROCK-Inhibitor, in jede Vertiefung einer vitronectin-beschichteten 48-Well-Platte.

Legen Sie dann die FLS-Kulturen unter ein Präpariermikroskop auf einer sauberen Bank und verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um eine interessante Kolonie zu schneiden. Übertragen Sie die entnommene Kolonie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze in 1 Vertiefung der 48-Well-Platte. Wenn alle Kolonien entnommen wurden, legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator, bis die Kolonien groß genug für den Transfer sind.

Teilung der Zellen, wenn sich die Kolonien außerhalb des sichtbaren Feldes des Mikroskops befinden, betrachtet bei 100-facher Vergrößerung. In diesem Bild ist die Morphologie des isolierten FLS nach einer anfänglichen 14-Tage-Kultur zu sehen. Die Zellen weisen die Eigenschaften von Fibroblasten im Allgemeinen auf, mit einer ähnlichen Expression der fibrotischen Marker Vimentin und Fibronektin sowie einer geringen Expression des Makrophagen-ähnlichen Synoviozytenmarkers CD-68,8 bis 11 Tage nach der lenti-viralen Transduktion des Yamanaka-Faktors beginnen kleine Kolonien zu erscheinen, die für 5 bis 10 Passagen entnommen und amplifiziert werden können.

Diese iPSCs der rheumatoiden Arthritis exprimieren alkalische Phosphatase, was darauf hindeutet, dass sie undifferenziert bleiben. Die Zellen exprimieren auch pluripotente Marker, wie durch RT-PCR und Immunfluoreszenzanalyse bestätigt wurde. iPCS für rheumatoide Arthritis weisen ein normales Chromosomenmuster von 44+XY auf, das durch Karyotypisierung bestimmt wird.

12 Wochen nach ihrer Injektion in SCID-Mäuse bildeten die iPS-Zellen der rheumatoiden Arthritis Teratome, die unterschiedliche Gewebephänotypen aufweisen. Die Keimschichtdifferenzierung wird durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. Einmal gemeistert, können iPSCs aus FLS mit Synovium erzeugt werden.

Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie man aus Synovialgewebe isoliert und wie man mit ihnen eine Reprogrammierung induziert. Diese RAF-FLS-abgeleiteten iPSCs können für die Untersuchung der Regeneration oder des Wirkstoffscreenings in der Rheumatologie nützlich sein. Sobald diese iPSCs etabliert sind, können verschiedene Arten von Zielzellen oder -organen erzeugt werden.

Dies kann nützlich sein, um die Krankheit oder andere zukünftige Anwendungen zu untersuchen, wie z. B. Gen-Editing und so weiter.