Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Vor über 50 Jahren wurde die Hypothese aufgestellt, dass terminale differenzierte Zellen wie Hautfibroblasten gezwungen werden könnten, einen pluripotenten Zustand einzunehmen, der den embryonalen Stammzellen ähnelt. Grundlage für dieses Konzept war die Beobachtung, dass alle Zelltypen mit wenigen Ausnahmen den gleichen genetischen Code haben und dass der einzige Unterschied zwischen den Zelltypen darin besteht, wie der Code gelesen wird. Diese Fähigkeit, die zelluläre Identität einer differenzierten Zelle in einen pluripotenten Zustand zu versetzen, wird als zelluläre Reprogrammierung bezeichnet.

Nach einem halben Jahrzehnt Forschung wurde kürzlich gezeigt, dass die erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren Hautfibroblasten so umprogrammieren kann, dass sie pluripotent werden. Die Auswirkungen dieser Erkenntnis sind enorm. Neben der Bedeutung für die Grundlagenbiologie werden auch die wichtigsten ethischen Einwände gegen die Verwendung menschlicher embryonaler Stammzellen für die Transplantationstherapie überwunden.

Damit die Reprogrammierung stattfinden kann, müssen vier Gene, die für die Transkriptionsfaktoren OC vier, sox, zwei cmic und K vier kodieren, verpackt und in eine Lentivirus-Gewebekultur gegeben werden. Medium, das das gereinigte Virus enthält, wird dann in eine Zellkulturschale gegeben, die eine hohe Dichte an Fibroblasten enthält, und in dieser Schale geschieht etwas Erstaunliches. Ein kleiner Teil der Fibroblasten infiziert sich mit allen vier Viren, die den Transkriptionsfaktor tragen, und beginnt, sich zu dedifferenzieren.

Sie durchlaufen drastische Veränderungen in ihrer Morphologie und Vermehrung und beginnen, sich in große spirituelle Cluster von pluripotenten Stammzellen zu teilen, die gebildet werden. Nach zwei- bis dreiwöchiger Kultivierung unter embryonalen Stammzellbedingungen können Kolonien von reprogrammierten Fibroblasten manuell isoliert und in vitro vermehrt werden. Nach der Reinigung können diese Zellen verwendet werden, um chimäre Mäuse zu erzeugen, bei denen ein bestimmter Prozentsatz der Zellen von denen abstammt, die dedifferenzierte Fibroblasten zu verschiedenen Geweben der Maus beitragen können.

In Glockenspielen, in denen das genetische Material der ursprünglichen Fibroblasten zur Keimbahn beigetragen hat, wird der genetische Code an die nächste Generation weitergegeben und dann an die nächste und dann an die nächste. Obwohl der Einsatz eines viralen Verabreichungssystems derzeit ein Hindernis für klinische Anwendungen darstellt, wird dies wahrscheinlich in kurzer Zeit überwunden werden. In diesem Video zeigen Mitglieder des Yin-Labors, wie induzierte potente Stammzellen aus embryonalen Fibroblasten der Maus gewonnen werden.

Hallo, ich bin Grant Welted aus dem Labor von Rudolph Jish am Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts. Und ich bin Tobias Bro brink auch von ish lab. Heute zeigen wir Ihnen die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch die Einführung von vier CDNAs OCT vier SOX und zwei CIC KF vier unter Verwendung von Lentiviren, die diese vier CDNAs von einem Tet OCMV Promotor exprimieren.

Dies ermöglicht die präzise Kontrolle der Expression dieser vier Transgene nach der Infektion von embryonalen Fibroblasten der Maus. Das Protokoll, das wir Ihnen heute zeigen, beinhaltet den Umgang mit Lentiviren, die möglicherweise menschliche Zellen infizieren können. Es ist wichtig, dass Sie immer sichere Verfahren befolgen und sich an Ihr Sicherheitsbüro wenden, bevor Sie versuchen, dies selbst zu tun.

Erzeugen wir also einige IPS-Zellen, um Lentiviren zu erzeugen, die mes in IPS-Zellen umwandeln. 2 9 3 Zellen müssen mit drei Plasmiden transfiziert werden, Paks zwei, was die erforderlichen genetischen Elemente für die Virusverpackung liefert. Das virale Rückgrat, das ein FUW TE OCMV-Lentivirus mit einem der vier CD-Aids T vier SOX zwei, KLA vier oder CMIC PMDG ist, das das Hüllglykoprotein des vesikulären Stomatitisvirus oder VSV exprimiert.

Dies macht das Virus, das ein atropisches Virus erzeugt. Daher müssen die richtigen BL zwei plus-Verfahren befolgt werden. In diesem speziellen Video haben wir es nicht wirklich mit infektiösen Viren zu tun, also tragen wir nicht unsere typischen Kittel und sind nicht in unserer BL two plus-Einrichtung.

Vor der Transfektion 2 werden 9 3 Zellen von flüssigem Stickstoff aufgetaut und zu 90 % Co gezüchtet. Fluenzzellen werden dann mit dem FU-Gen transfiziert und erhalten 48 bis 72 Stunden Zeit, um das Virus zu exprimieren, wobei das Medium, das die Zellen badet, mit einem 0,45-Mikron-Filter filtriert und nach der Konzentration des Virus durch Ultrazentrifugation konzentriert wird. Wir sind jetzt bereit, MES zu infizieren, um IPS-Cluster zu erzeugen Während der Schritte der Virusvorbereitung werden embryonale Fibroblasten der Maus weniger als dreimal auf 90% Co-Flüssigkeit in 10-Zentimeter-Schalen gezüchtet, etwa zweimal 10 auf die sechs Zellen pro Schale. In diesem speziellen experimentellen Protokoll verwenden wir MES, die die RTTA exprimieren, die für die Doxycyclin-Expression und GFP aus dem endogenen OC-Vier-Locus entscheidend ist.

MES sind GFP-negativ, aber echte IPS-Zellen werden GFP-positiv. Dieser Marker ermöglicht eine Methode, mit der reprogrammierte Mes identifiziert, das Kulturmedium aus den Fibroblasten aspiriert und mit 10 mil Hippies, EDTA, gewaschen wird, das Hippies-EDTA verworfen und fünf mil einmaliges Trypsin hinzugefügt und 10 Minuten lang bei 37 Grad inkubiert wird. Trypsin hilft, die Zellen vom Boden des Geschirrs zu heben.

Fügen Sie nun neun mil des Kulturmediums hinzu, um die Zellen in einer Einzelzellsuspension zu resuspendieren, und geben Sie sie in ein 15-mil-Röhrchen. Diese Zellen werden dann heruntergeschleudert und pelletiert. Nach der Reanimation des Pellets wird die Anzahl der Zellen in der Suspension gezählt und die Konzentration auf acht mal 10 auf die vier Zellen pro Mil eingestellt.

10 mil der Zellsuspension werden dann in eine 10 Zentimeter große Schale gegeben, die mit Gelatine beschichtet ist. Inkubieren Sie die Schale über Nacht bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2, nachdem das Inkubationsmedium aus einer Fibroblastenschale über Nacht abgesaugt und 10 mil des virushaltigen Mediums dem Meth zugesetzt werden. Inkubieren Sie die Zellen von vier Stunden bis über Nacht bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2.

Am nächsten Tag wird das Medium aus einer Faserstrahlschale abgesaugt und anschließend 10 mil frisches ESL-Medium hinzugefügt. In diesem Stadium können die Zellen eingefroren, expandiert oder für den Beginn der Reprogrammierung vorbereitet werden. Um die Reprogrammierung zu initiieren, ersetzen Sie das reguläre ESL-Medium durch ein Medium, das Doxycyclin enthält, um die Expression der vier Gene zu initiieren.

Legen Sie diese Zellen in den Inkubator, wechseln Sie täglich das Medium, bis die Völker groß genug sind, um entnommen zu werden. Die Kolonien sollten erst etwa eine Woche nach Beginn der Reprogrammierung sichtbar werden. Sie sollten groß genug werden, um um den 20. Tag herum abgeholt zu werden.

Jetzt, da 20 Tage vergangen sind, können wir IPS-Völker auswählen, bevor wir Völker auswählen. Man sollte daran denken, die erforderliche Anzahl von gelatinebeschichteten 24-Well-Platten mit gammabestrahltem DR vier Mythen ein bis zwei Stunden vor der Ernte zu sehen. Man sollte die Kolonien auf den Platten füttern, indem man kurz vor der Entnahme frisches Medium hinzufügt, unmittelbar vor der Entnahme 50 Mikroliter HEPA-Puffer in die Vertiefungen einer 96-Well-Schale mit V-Boden gibt, die Schale mit den zu pflückenden Kolonien einmal mit PBS waschen und 10 mls PBS in die Schale geben; IPS-Zellcluster können entweder unter einem Stereomikroskop oder einem inversen Mikroskop entnommen werden.

Entnehmen Sie die Kolonien mit einer kleinen Pipettenspitze und geben Sie sie in eine Vertiefung in der 96-Well-Schale, die PBS enthält, um die Cluster zu entfernen. Ein Kreis wird mit einer Pipettenspitze um das Cluster gezeichnet, um die Mathematik aufzulockern. Nun können die umprogrammierten Zellen mit der Mehrkanalpipette extrahiert werden, wobei jeweils 20 Mikroliter Tripsin zugesetzt werden.

Nun, dreimal auf und ab spritzen, vier Minuten bei 37 Grad Inkubation betreiben. Nach der vierminütigen Inkubation werden 100 Mikroliter ES-Medium zu den schönen Kolonien der Tripps hinzugefügt. Pfeifen Sie es 10 Mal auf und ab und übertragen Sie sechs Klone gleichzeitig.

Von der 96-Well-Schale zu einer 24-Well-Schale, bei der eine Spitze an jeder zweiten Position des 12-Teller-Pipettierers verwendet wird, werden dann auf der 24-Well-Platte in einem 37 Cent Grad, 5 %CO2-Inkubator gezüchtet, bis die Zellen 80 bis 90 % Co Fluency Fitting Deli mit ES-Zellen Medium-Zellen erreichen, die Zellen werden wahrscheinlich in drei bis sieben Tagen bereit sein, sich zu vermehren. Ein paar Tage später. Jetzt, da die IPS-Zellen konfluent sind, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit einer Million Hippies vollständig. Entfernen Sie die Hippies und fügen Sie 100 Mikroliter einmaliges Trypsin hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Nach der Inkubation mit Trypsin fügen Sie 400 Mikroliter ESL-Medium hinzu und suspendieren die Zellen durch Auf- und Abpipettieren und stellen eine Einzelzellsuspension her.

Die 500-Mikroliter-Einzelzellsuspension aus der 24-Well-Platte wird dann in eine Einzelvertiefung einer Sechs-Well-Platte überführt und in einem 37 Grad Celsius heißen 5%CO2-Inkubator inkubiert, bis die Zellen in der Sechs-Well-Platte eine Flüssigkeit von 80 bis 90 % co erreichen. An diesem Punkt können Sie entweder mit der Amplifikation von Zellen für die Südanalyse, Blasten, Injektionen, Teratom-Assays oder In-vitro-Differenzierungsassays fortfahren. Und Sie sollten daran denken, die Vorratsventile dieser Zellen einzufrieren, damit Sie diesen wertvollen Vorrat an IPS-Zellen nicht verlieren.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Pluripotenz in embryonalen Fibroblasten der Maus mit Hilfe eines induzierbaren antiviralen Systems induziert. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.