Name: Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-07T10:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Lernen Sie die Reprogrammierung von Maus-Embryonalfibroblasten zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels lentiviraler Überexpression von Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Generierung von iPS-Zellen für die regenerative Medizin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Schritt 1: Auftauen 293-Zellen und die Platte für Lentivirus Produktion. <ol><li> Bereiten 9 ml DMEM + Medium in einer 15-ml-Tube. </li><li> Nehmen Sie ein Fläschchen eingefroren 293 Aktien aus dem flüssigen Stickstoff-Tank und steckte die Flasche in einem 37 ° C Wasserbad, bis die meisten (aber nicht alle) Zellen aufgetaut werden. </li><li> Entfernen Zellen vor dem Einfrieren Fläschchen und Ort in die 15ml Tube aus Schritt 1. </li><li> Zentrifugation bei 180g für 5 min, und dann den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der Zellen mit 10 ml DMEM + Medium, und in ein mit Gelatine beschichtete 100-mm-Schale. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator bis sie 80-90% konfluent sind. </li><li> Passage des 293-Zellen: Zellen mit PBS waschen, saugen Sie den PBS und 4 ml pro 10-cm-Spiegel von 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA und Inkubation für 1 min bei 37 ° C. </li><li> Lösen Sie Zellen aus Gerichten, indem Sie mit 10 ml DMEM + Medium resuspendieren und Transfer zu einem 15-ml-Tube. Zentrifugation bei 180g für 5 min, und saugen Sie den Überstand. </li><li> Add entsprechenden Volumen DMEM + Medium und die Zellen aufzubrechen zu einer einzigen Zelle Suspension durch Auf-und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Zellen und stellen Sie die Konzentration auf 8x10 5 Zellen pro ml mit FP-Medium. </li><li> Seed-Zellen bei 8x10 6 Zellen (10 ml) pro 100-mm Kulturschale, und bei 37 ° C über Nacht, 5% CO 2. </li></ol> Schritt 2: Transfizieren 293 Zellen mit Lentiviren Plasmide und Ernte-Virus <ol><li> Für jeden 10-cm-Platte, verwenden 10 ug FUW-tetO-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 oder c-Myc) Lentivirus Backbone mit 2.5ug der PMD-G und 7,5 ug pPax2. </li><li> Während Aliquotierung der drei Plasmide in ein Rohr, liefern 30μl der Fugene 6 Transfektionsreagenz in ein zweites Röhrchen mit 500μl DMEM ohne Serum und vorsichtig mischen mit dem Finger tippen und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Fügen Sie die DNA-Mix Drop-by-drop in die Fugene 6/DMEM-containing Rohr, mischen Sie durch Fingertapping und Inkubation für 20 min. </li><li> Fügen Sie die DNA / Fugene 6-Komplex tropfenweise in die Schüssel von 293 ist, beimpft und über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Morgen: Saugen Sie das Transfektionsreagenz-haltigem Medium, 5 ml frischem ES-Zell-Medium, und kehren die Zellen in den Inkubator. </li><li> Nach 48 Stunden und 72 Stunden nach der Transfektion, sammeln das Medium von den 293 ist mit einem 10-ml sterilen Einwegspritze, Filtrieren durch ein 0,45-um Porengröße Celluloseacetat-Filter, und die Übertragung in einen 15-ml-Tube. </li><li> Konzentrieren Sie sich die Virus-Überstand durch Ultrazentrifugation. Resuspendieren Viruspellet in gewünschte Lautstärke und stellen ein Gemisch von gleichen Teilen aus dem Medium, das Oct-3/4-, Sox2-, Klf4 und c-Myc-Lentiviren. </li><li> Während der Arbeit an dem Virus, bereiten Oct4-neo/rtTA oder Oct4-GFP/rtTA MEFs (Durchgang &lt;3) bis 90% Konfluenz in 10-cm-Schalen (2x10 6 Zellen pro Schale) </li><li> Absaugen des Kulturmediums und Waschen mit 10 ml PBS. </li><li> Discard PBS, 1 ml pro Schale von 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, und bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Add 9 ml des Kulturmediums, Aussetzung der Zellen zu einer einzigen Zelle, und in ein 15-ml-Tube. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Zellen, und passen Sie die Konzentration auf 8x10 4 Zellen pro ml. Transfer 10 ml Zellsuspension (8x10 5 Zellen) zu einer 10-cm-Spiegel mit Gelatine beschichtet. Inkubieren Sie die Schüssel über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Saugen Sie das Medium aus Fibroblasten Schüssel und fügen Sie 10 ml des Virus-haltigem Medium. Inkubieren Sie die Zellen von 4 h bis über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Nach 24 Saugen Sie das Medium aus Fibroblasten Schüssel, und mit 10 ml frischem ES-Zell-Medium. </li><li> Ersetzt einen regulären ES-Zell-Medium mit Medium mit Doxycyclin die Expression der vier Gene initiieren, mit anderen Worten, zu initiieren Neuprogrammierung. </li><li> Bei Verwendung eines Oct4-neo-Reporter, dann starten Medikament Abschnitt jederzeit zwischen 6 und 9 Tagen. </li><li> Ändern Sie das Medium jeden Tag, bis die Kolonien groß genug, um abgeholt zu werden. Kolonien sollten zuerst sichtbar werden etwa eine Woche nach Beginn der Umprogrammierung. Sie sollten groß genug, um bis etwa Tag 20 abgeholt werden. </li></ol> Schritt 3: Picking up the iPS Kolonien Am Tag vor Picking: <ol><li> Seed die erforderliche Anzahl von Gelatine beschichtete 24-Well-Platten mit γ-bestrahlten DR4 MEFs </li></ol> Picking Clones an Tag 1: <ol><li> Feed the Kolonien auf den Platten 1-2 Stunden vor Kommissionierung. </li><li> Add 15 ul PBS in die Vertiefungen eines V-Boden 96-well Schale. </li><li> Waschen Sie die Schale mit den Kolonien, einmal mit PBS aufgenommen und fügen Sie 10 ml PBS in die Schale. </li><li> Wählen Sie die Kolonien mit dem kleinen 5μl Pipettenspitzen (stellen Sie den P20 Pipetman auf 4 ul). Transfer-colonies zu einem Brunnen in der 96-well Schale. </li><li> Add 20 ul Trypsin in jede Vertiefung mit dem Multi-Channel-(12) pipetor. Pipet nach oben und unten 3 mal. Bei 37 ° C für 4 Minuten. </li><li> 100 l von ES Medium, um die trypsiniert Kolonien. Pipet nach oben und unten 10-mal. Transfer-6 Klone in einer Zeit, aus dem 96-Loch-Spiegel auf eine 24-Well-Schale mit einer Spitze an jedem anderen Position auf den 12 Platz pipetor. </li><li> Wachsen die Zellen auf der 24-Well-Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator bis die Zellen 80-90% Konfluenz erreichen, Fütterung täglich mit ES-Zell-Medium. Cells dürfte bereit sein, innerhalb von 3-7 Tagen zu erweitern. </li></ol> Schritt 4 <ol><li> Ausbau der iPS-Zellen <ol><li> Saugen Sie das Medium, und waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS. </li><li> Entfernen PBS vollständig, fügen Sie 0,1 ml 0,25% Trypsin / 1 mM EDTA und Inkubation bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Fügen Sie 0,4 ml der ES-Medium und setzt die Zellen durch Auf-und Abpipettieren, einzelne Zell-Suspension. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in eine Vertiefung 6-Well-Platte, 1,5 ml ES-Zell-Medium und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator bis die Zellen zu erreichen 80-90% Konfluenz in 6-well Platten. An dieser Stelle vorzubereiten eingefroren Lager der Zellen, wie folgt. </li></ol></li><li> Vorbereitung von freeze Lager <ol><li> Saugen Sie das Medium, und waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS. </li><li> Entfernen PBS vollständig, 0,5 ml 0,25% Trypsin / 1 mM EDTA und Inkubation bei 37 ° C für 10 min. </li><li> 2 ml des ES-Medium und setzt die Zellen durch Auf-und Abpipettieren, einzelne Zell-Suspension. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15-ml-Tube, die Anzahl von Zellen und Spin-down der Zellen. </li><li> Überstand verwerfen, resuspendieren Sie die Zellen mit ES-Medium, um die Konzentration auf 2x10 6 Zellen pro ml. </li><li> Bereiten Sie 2 ES-Zelle Einfriermedium (20% DMSO in ES-Medium) und aliquote es bei 0,5 ml pro Fläschchen. </li><li> Übertragen 0,5 ml der Zellsuspension Fläschchen einfrieren und vorsichtig mischen. </li><li> Legen Sie die Flaschen in einer Zelle-Gefrierbehälter und halten Sie sie bei -80 ° C über Nacht; in flüssigen Stickstoff Transfer am nächsten Tag für eine langfristige Lagerung. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li>
</ol>

In diesem Video zeigen wir, wie man einen induzierbaren, lentiviralen System nutzen, um GFP-positive, pluripotente iPS-Zellen aus MEFs aus Oct4-GFP/R26-M2rtTA und Nanog-GFP/R26-M2rtTA Mäusen abgeleitet generieren. Dieses Verfahren ist eine nützliche Methode zur Erzeugung von iPS-Zellen, weil es für die Steuerung von Transgenexpression während der Umprogrammierung Prozess ermöglicht. Obwohl der Einsatz von Viren bei der Erzeugung von iPS-Zellen verhindert die Verwendung dieser Zellen in einem klinischen Umfeld, hat dieses Verfahren ermöglichen es uns, einige der wichtigsten biologischen Fragen, die noch nicht definiert Reprogrammierung unterstreichen beantworten.

<table><tbody><tr><td>Doxycyclin-Hyclat</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

generieren von ips-zellen aus mefs durch forced expression von sox-2, oct-4, c-myc und klf4

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotenz in differenzierten murinen durch virale Transduktion von Oct4 induziert werden, Sox2, Klf4 und c-Myc (Takahashi und Yamanaka, 2006; Wernig, et al, 2007;. Okita, et al, 2007;.. Maherali, et al, 2007). Wir haben eine Umprogrammierung Strategie, in der diese vier Transkriptionsfaktoren von Doxycyclin ausgedrückt werden erarbeitet (dox)-induzierbaren lentiviralen Vektoren (Brambrink et al., 2008). Mit Hilfe dieser induzierbaren Konstrukten, können wir ableiten induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) aus embryonalen Fibroblasten (MEFs). In diesem Video zeigen wir, das Verfahren für die Erzeugung von induzierbaren Lentiviren, dass die vier Transkriptionsfaktoren auszudrücken und zu zeigen, wie man MEFs mit diesen Viren zu infizieren, um iPS-Zellen zu produzieren. Durch die Verwendung von induzierbaren Lentiviren, der Ausdruck der vier Faktoren in durch die Zugabe von Doxycyclin zum Kulturmedium kontrolliert. Der Vorteil dieses Systems gegenüber den herkömmlichen retrovirale Infektion ist die Möglichkeit, die Gene ein-und ausschalten, so dass die Kinetik der Neuprogrammierung und Genexpression Anforderungen im Detail analysiert werden können.

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen mit induzierbaren Lentivirus, dass ausdrückliche Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Pluripotenz kann in differenzierten murinen Zellen durch virale Transduktion von Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc induziert werden (Takahashi und Yamanaka, 2006; Wernig et al., ...

Vor über 50 Jahren wurde die Hypothese aufgestellt, dass terminal differenzierte Zellen wie Hautfibroblasten gezwungen werden könnten, einen pluripotenten Zustand anzunehmen, der embryonalen Stammzellen ähnelt. Die Grundlage für dieses Konzept war die Beobachtung, dass alle Zelltypen – mit wenigen geringfügigen Ausnahmen – denselben genetischen Code besitzen und dass der einzige Unterschied zwischen Zelltypen darin besteht, wie dieser Code abgelesen wird. Diese Fähigkeit, die zelluläre Identität einer differenzierten Zelle in einen pluripotenten Zustand zu verändern, wird als zelluläre Reprogrammierung bezeichnet.Nach einem halben Jahrzehnt der Forschung wurde kürzlich gezeigt, dass die erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren Hautfibroblasten so umprogrammieren kann, dass sie pluripotent werden. Die Bedeutung dieser Entdeckung ist enorm. Abgesehen von ihrer Bedeutung für die Grundlagenforschung umgeht sie auch die wichtigsten ethischen Bedenken bezüglich der Verwendung menschlicher embryonaler Stammzellen für die Transplantationstherapie.Um die Umprogrammierung zu ermöglichen, müssen vier Gene, die für die Transkriptionsfaktoren OC4, Sox2, c-Myc und Klf4 kodieren, verpackt und in eine lentivirale Zellkultur übertragen werden. Das mit gereinigtem Virus angereicherte Medium wird anschließend einer Zellkulturschale hinzugefügt, die eine hohe Dichte an Fibroblasten enthält. Innerhalb dieser Schale tritt etwas Erstaunliches ein: Ein kleiner Teil der Fibroblasten wird mit allen vier Viren, die die Transkriptionsfaktoren tragen, infiziert und beginnt, sich zu dedifferenzieren.Sie durchlaufen drastische Veränderungen in ihrer Morphologie und Proliferation und beginnen, sich in große, kugelige Zellverbände pluripotenter Stammzellen zu teilen. Nach zwei bis drei Wochen Kultivierung unter Bedingungen für embryonale Stammzellen können Kolonien reprogrammierter Fibroblasten manuell isoliert und in vitro expandiert werden. Sobald sie gereinigt sind, können diese Zellen zur Erzeugung von chimären Mäusen verwendet werden, bei denen ein bestimmter Prozentsatz der Zellen von den dedifferenzierten Fibroblasten abstammt und zu verschiedenen Geweben der Maus beitragen kann.Bei Chimären, bei denen das genetische Material der ursprünglichen Fibroblasten zur Keimbahn beigetragen hat, kann der genetische Code an die nächste Generation weitergegeben werden und dann an die folgende und danach an die nächste. Obwohl der Einsatz eines viralen Transportsystems derzeit eine Hürde für klinische Anwendungen darstellt, wird dies voraussichtlich in Kürze überwunden sein. In diesem Video demonstrieren Mitglieder des Yin-Labors, wie induzierte pluripotente Stammzellen aus embryonalen Mausfibroblasten gewonnen werden.Hallo, ich bin Grant Welted aus dem Labor von Rudolph Jish am Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts. Und ich bin Tobias Bro brink, ebenfalls aus dem Ish-Labor. Heute zeigen wir Ihnen die Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen durch die Einführung von vier cDNAs – OCT4, SOX2, C-MYC und KLF4 – mithilfe von Lentiviren, die diese vier cDNAs unter Kontrolle eines Tet-OCMV-Promotors exprimieren.Dies ermöglicht die präzise Steuerung der Expression dieser vier Transgene nach der Infektion von embryonalen Fibroblasten der Maus. Das Protokoll, das wir Ihnen heute zeigen, beinhaltet den Umgang mit Lentiviren, die möglicherweise menschliche Zellen infizieren können. Es ist entscheidend, dass Sie stets sichere Verfahren befolgen und vor Durchführung des Verfahrens Kontakt mit Ihrer Sicherheitsabteilung aufnehmen.Erzeugen wir also einige iPS-Zellen, um Lentivirus herzustellen, das MES in iPS-Zellen umwandeln kann. 293-Zellen müssen mit drei Plasmiden transfiziert werden: PAKS2, das die erforderlichen genetischen Elemente für die virale Verpackung bereitstellt; dem viralen Grundgerüst, das ein FUW-TE-OCMV-Lentivirus ist, das einen der vier CD-Helfer T4, SOX2, KLA4 oder CMIC trägt; sowie PMDG, das das Hüllglykoprotein des vesikulären Stomatitis-Virus oder VSV exprimiert.Dadurch entsteht das Virus, das atropisches Virus erzeugen wird. Daher müssen die entsprechenden BSL-2-Plus-Verfahren eingehalten werden. In diesem speziellen Video arbeiten wir jedoch nicht mit infektiösem Virus, weshalb wir keine typischen Schutzkittel tragen und uns nicht in einer BSL-2-Plus-Einrichtung befinden.Vor der Transfektion 2 werden 9 3 Zellen aus fl&uuml;ssigem Stickstoff aufgetaut und bis zu einer Konfluenz von 90 % kultiviert. Anschlie&szlig;end werden die Zellen mit dem FU-Gen transfiziert und 48 bis 72 Stunden zur Expression des Virus inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird das Zellkulturmedium &uuml;ber einen 0,45-Mikrometer-Filter filtriert und anschlie&szlig;end durch Ultrazentrifugation konzentriert. Nach der Konzentration des Virus sind wir bereit, MES zu infizieren, um IPS-Zellklone zu erzeugen. W&auml;hrend der Vorbereitung des Virus werden murine embryonale Fibroblasten, die weniger als dreimal passagiert wurden, in 10 cm-Dishs bis zu einer Konfluenz von 90 % herangez&uuml;chtet, was etwa zwei mal 10 hoch 6 Zellen pro Dish entspricht. In diesem speziellen experimentellen Protokoll verwenden wir MES, die RTTA exprimieren, was f&uuml;r die Doxycyclin-induzierbare Expression und GFP aus dem endogenen OC4-Lokus entscheidend ist.MES sind GFP-negativ, aber echte iPS-Zellen werden GFP-positiv. Dieser Marker ermöglicht eine Methode zur Identifizierung reprogrammierter Mes. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Fibroblasten und waschen Sie mit 10 ml HBSS, EDTA; verwerfen Sie das HBSS, EDTA und geben Sie 5 ml 1× Trypsin hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37 Grad. Trypsin hilft dabei, die Zellen vom Boden der Schalen zu lösen.Jetzt neun Milliliter des Kulturmediums hinzufügen, um die Zellen in einer Einzelzell-Suspension wieder aufzuschwemmen, und in ein 15-Milliliter-Gefäß überführen. Anschließend werden diese Zellen zentrifugiert und als Pellet abgetrennt. Nach dem erneuten Aufschwemmen des Pellets wird die Anzahl der Zellen in der Suspension bestimmt und die Konzentration auf acht mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter eingestellt.10 ml der Zellsuspension werden anschließend auf eine mit Gelatine beschichtete 10 cm-Schale übertragen. Inkubieren Sie die Schale über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2. Nach der Übernacht-Inkubation wird das Medium aus einer Fibroblastenkultur abgesaugt und 10 ml des Virus enthaltenden Mediums werden dem Meth hinzugefügt. Inkubieren Sie die Zellen für vier Stunden bis über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2.Am nächsten Tag das Medium von einer Fibroblasten-Kulturschale abziehen und anschließend 10 ml frisches ESL-Medium hinzufügen. Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen eingefroren, vermehrt oder für die Einleitung der Reprogrammierung vorbereitet werden. Um die Reprogrammierung zu starten, das reguläre ESL-Medium durch Medium ersetzen, das Doxycyclin enthält, um die Expression der vier Gene zu initiieren.Stellen Sie diese Zellen in den Inkubator und wechseln Sie das Medium jeden Tag, bis die Kolonien groß genug sind, um abgenommen zu werden. Die Kolonien sollten etwa eine Woche nach Beginn der Reprogrammierung erstmals sichtbar werden. Sie sollten etwa am Tag 20 groß genug sein, um abgenommen zu werden.Nun, da 20 Tage vergangen sind, können wir fortfahren und IPS-Kolonien auswählen, bevor die Kolonien entnommen werden. Man sollte darauf achten, die erforderliche Anzahl an mit Gelatine beschichteten 24-Loch-Platten mit gamma-bestrahlten DR-vier-Mythen eine bis zwei Stunden vor der Entnahme vorzubereiten. Man sollte die Kolonien auf den Platten versorgen, indem man kurz vor der Entnahme frisches Medium hinzufügt, und 50 Mikroliter HEPA-Puffer unmittelbar vor der Entnahme in die Vertiefungen einer V-förmigen 96-Loch-Platte gibt, die Schale mit den zu entnehmenden Kolonien einmal mit PBS waschen und 10 ml PBS zur Schale hinzufügen. IPS-Zellkluster können entweder unter einem Stereomikroskop oder einem invertierten Mikroskop ausgewählt werden.Die Kolonien mit einer kleinen Pipettenspitze aufnehmen und in eine Vertiefung der 96er-Platte überführen, die PBS enthält, um die Aggregate zu entfernen. Mit der Pipettenspitze wird ein Kreis um das Aggregat gezogen, um die Zellhaufen aufzulösen. Anschließend können die reprogrammierten Zellen mit dem Mehrkanalpipettierer entnommen werden; jeweils 20 Mikroliter Trypsin werden hinzugegeben.Pipettieren Sie die Probe dreimal auf und ab, inkubieren Sie sie 4 Minuten bei 37 °C. Nach der 4-minütigen Inkubation werden 100 µL ES-Medium zu den Trip-Nice-Kolonien gegeben. Pipettieren Sie 10-mal auf und ab und übertragen Sie jeweils sechs Klone. Von der 96-Well-Platte in eine 24-Well-Platte unter Verwendung einer Pipettenspitze an jeder zweiten Position des 12-fach-Pipettiergeräts werden die Zellen anschließend in der 24-Well-Platte in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen. Ergänzen Sie mit ES-Zellmedium. Die Zellen sind wahrscheinlich in drei bis sieben Tagen zur Weitervermehrung bereit. Einige Tage später. Da die iPS-Zellen nun konfluent sind, aspirations das Medium ab und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter HEPES. Entfernen Sie den HEPES vollständig und geben Sie 100 Mikroliter 1× Trypsin hinzu. Inkubieren Sie 10 Minuten bei 37 °C. Nach der Inkubation mit Trypsin fügen Sie 400 Mikroliter ESL-Medium hinzu und suspendieren die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.Die 500 µL große Einzelzell-Suspension aus der 24-Loch-Platte wird anschließend in einen einzelnen Wells einer 6-Loch-Platte übertragen und im 37 °C warmen 5 % CO₂-Inkubator inkubiert, bis die Zellen in der 6-Loch-Platte eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen. Zu diesem Zeitpunkt können Sie entweder mit der Amplifikation der Zellen für Southern-Analysen, Blasten, Injektionen, Teratoma-Assays oder in-vitro-Differenzierungs-Assays fortfahren. Außerdem sollten Sie daran denken, Vorratskulturen dieser Zellen einzufrieren, um diesen wertvollen Vorrat an iPS-Zellen nicht zu verlieren.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Pluripotenz in murinen embryonalen Fibroblasten mithilfe eines induzierbaren antiviralen Systems hervorruft. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

generating-ips-cells-from-mefs-through-forced-expression-sox-2-oct-4

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Stemgent Dox Inducible Maus TF Lentivirus Set kann embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs), um induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) neu zu programmieren. Hier haben wir das Protokoll für DOX-induzierbare Expression von Maus Umprogrammierung Transkriptionsfaktoren Oct4 zu demonstrieren, Sox2, Klf4 und c-Myc iPS Kolonien, die ausdrückliche gemeinsamen mES Pluripotenz Marker zu generieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) Linien produziert Linien unterschiedlicher Entwicklungspotenzial, auch wenn sie Standard-Tests für Pluripotenz passieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Mäuse vollständig aus iPS, die die iPSC Linien definiert als die über volle Pluripotenz abgeleitet...

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Hier ein Protokoll, das auf epigenetische Reprogrammierung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in Richtung Erzeugung eines homogenen Bevölkerung von Skelettmuskelvorläuferzellen, die unter permissiven Kulturbedingungen bilden dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres), die biologischen Merkmale der menschlichen rekapitulieren beschreiben wir Skelettmuskeln.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Embryonale Fibroblasten der Maus können durch die erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc mit geringer Effizienz in induzierte pluripotente Stammzellen reprogrammiert werden. Die seltenen Zwischenprodukte der Reprogrammierungsreaktion sind FACS-isoliert durch Markierung mit Antikörpern gegen die Zelloberflächenhersteller Thy-1.2, Ssea-1 und Epcam.

Zelloberflächenmarker vermittelte Reinigung von iPS-Zellen aus einer Zwischen Reprogrammierbare Maus-Modell

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Erzeugung von iCMs unter Verwendung der Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Tbx5 und Mef2c in einem polycistronischen Konstrukt. Dieses Protokoll liefert eine relativ homogene Population von reprogrammierten Zellen mit verbesserter Effizienz und Qualität und ist wertvoll für zukünftige Studien zur iCM-Reprogrammierung.

Verbesserte Generierung induzierter Kardiomyozyten Mit einem Polycistronische Construct Ausdruck optimale Verhältnis von Gata4, Mef2c und Tbx5

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten der Maus durch Überexpression eines minimalen Satzes von Transkriptionsfaktoren. Diese Technologie kann auf das menschliche System übertragen werden, um Plattformen für zukünftige Studien zur Hämatopoese, zu hämatologischen Erkrankungen und hämatopoetischen Stammzelltransplantationen bereitzustellen.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Lernen Sie die Reprogrammierung von Maus-Embryonalfibroblasten zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels lentiviraler Überexpression von Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Generierung von iPS-Zellen für die regenerative Medizin.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Weitere Videos entdecken