Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Vor über 50 Jahren wurde die Hypothese aufgestellt, dass terminal differenzierte Zellen wie Hautfibroblasten gezwungen werden könnten, einen pluripotenten Zustand anzunehmen, der embryonalen Stammzellen ähnelt. Die Grundlage für dieses Konzept war die Beobachtung, dass alle Zelltypen – mit wenigen geringfügigen Ausnahmen – denselben genetischen Code besitzen und dass der einzige Unterschied zwischen Zelltypen darin besteht, wie dieser Code abgelesen wird. Diese Fähigkeit, die zelluläre Identität einer differenzierten Zelle in einen pluripotenten Zustand zu verändern, wird als zelluläre Reprogrammierung bezeichnet.

Nach einem halben Jahrzehnt der Forschung wurde kürzlich gezeigt, dass die erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren Hautfibroblasten so umprogrammieren kann, dass sie pluripotent werden. Die Bedeutung dieser Entdeckung ist enorm. Abgesehen von ihrer Bedeutung für die Grundlagenforschung umgeht sie auch die wichtigsten ethischen Bedenken bezüglich der Verwendung menschlicher embryonaler Stammzellen für die Transplantationstherapie.

Um die Umprogrammierung zu ermöglichen, müssen vier Gene, die für die Transkriptionsfaktoren OC4, Sox2, c-Myc und Klf4 kodieren, verpackt und in eine lentivirale Zellkultur übertragen werden. Das mit gereinigtem Virus angereicherte Medium wird anschließend einer Zellkulturschale hinzugefügt, die eine hohe Dichte an Fibroblasten enthält. Innerhalb dieser Schale tritt etwas Erstaunliches ein: Ein kleiner Teil der Fibroblasten wird mit allen vier Viren, die die Transkriptionsfaktoren tragen, infiziert und beginnt, sich zu dedifferenzieren.

Sie durchlaufen drastische Veränderungen in ihrer Morphologie und Proliferation und beginnen, sich in große, kugelige Zellverbände pluripotenter Stammzellen zu teilen. Nach zwei bis drei Wochen Kultivierung unter Bedingungen für embryonale Stammzellen können Kolonien reprogrammierter Fibroblasten manuell isoliert und in vitro expandiert werden. Sobald sie gereinigt sind, können diese Zellen zur Erzeugung von chimären Mäusen verwendet werden, bei denen ein bestimmter Prozentsatz der Zellen von den dedifferenzierten Fibroblasten abstammt und zu verschiedenen Geweben der Maus beitragen kann.

Bei Chimären, bei denen das genetische Material der ursprünglichen Fibroblasten zur Keimbahn beigetragen hat, kann der genetische Code an die nächste Generation weitergegeben werden und dann an die folgende und danach an die nächste. Obwohl der Einsatz eines viralen Transportsystems derzeit eine Hürde für klinische Anwendungen darstellt, wird dies voraussichtlich in Kürze überwunden sein. In diesem Video demonstrieren Mitglieder des Yin-Labors, wie induzierte pluripotente Stammzellen aus embryonalen Mausfibroblasten gewonnen werden.

Hallo, ich bin Grant Welted aus dem Labor von Rudolph Jish am Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts. Und ich bin Tobias Bro brink, ebenfalls aus dem Ish-Labor. Heute zeigen wir Ihnen die Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen durch die Einführung von vier cDNAs – OCT4, SOX2, C-MYC und KLF4 – mithilfe von Lentiviren, die diese vier cDNAs unter Kontrolle eines Tet-OCMV-Promotors exprimieren.

Dies ermöglicht die präzise Steuerung der Expression dieser vier Transgene nach der Infektion von embryonalen Fibroblasten der Maus. Das Protokoll, das wir Ihnen heute zeigen, beinhaltet den Umgang mit Lentiviren, die möglicherweise menschliche Zellen infizieren können. Es ist entscheidend, dass Sie stets sichere Verfahren befolgen und vor Durchführung des Verfahrens Kontakt mit Ihrer Sicherheitsabteilung aufnehmen.

Erzeugen wir also einige iPS-Zellen, um Lentivirus herzustellen, das MES in iPS-Zellen umwandeln kann. 293-Zellen müssen mit drei Plasmiden transfiziert werden: PAKS2, das die erforderlichen genetischen Elemente für die virale Verpackung bereitstellt; dem viralen Grundgerüst, das ein FUW-TE-OCMV-Lentivirus ist, das einen der vier CD-Helfer T4, SOX2, KLA4 oder CMIC trägt; sowie PMDG, das das Hüllglykoprotein des vesikulären Stomatitis-Virus oder VSV exprimiert.

Dadurch entsteht das Virus, das atropisches Virus erzeugen wird. Daher müssen die entsprechenden BSL-2-Plus-Verfahren eingehalten werden. In diesem speziellen Video arbeiten wir jedoch nicht mit infektiösem Virus, weshalb wir keine typischen Schutzkittel tragen und uns nicht in einer BSL-2-Plus-Einrichtung befinden.

Vor der Transfektion 2 werden 9 3 Zellen aus flüssigem Stickstoff aufgetaut und bis zu einer Konfluenz von 90 % kultiviert. Anschließend werden die Zellen mit dem FU-Gen transfiziert und 48 bis 72 Stunden zur Expression des Virus inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird das Zellkulturmedium über einen 0,45-Mikrometer-Filter filtriert und anschließend durch Ultrazentrifugation konzentriert. Nach der Konzentration des Virus sind wir bereit, MES zu infizieren, um IPS-Zellklone zu erzeugen. Während der Vorbereitung des Virus werden murine embryonale Fibroblasten, die weniger als dreimal passagiert wurden, in 10 cm-Dishs bis zu einer Konfluenz von 90 % herangezüchtet, was etwa zwei mal 10 hoch 6 Zellen pro Dish entspricht. In diesem speziellen experimentellen Protokoll verwenden wir MES, die RTTA exprimieren, was für die Doxycyclin-induzierbare Expression und GFP aus dem endogenen OC4-Lokus entscheidend ist.

MES sind GFP-negativ, aber echte iPS-Zellen werden GFP-positiv. Dieser Marker ermöglicht eine Methode zur Identifizierung reprogrammierter Mes. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Fibroblasten und waschen Sie mit 10 ml HBSS, EDTA; verwerfen Sie das HBSS, EDTA und geben Sie 5 ml 1× Trypsin hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37 Grad. Trypsin hilft dabei, die Zellen vom Boden der Schalen zu lösen.

Jetzt neun Milliliter des Kulturmediums hinzufügen, um die Zellen in einer Einzelzell-Suspension wieder aufzuschwemmen, und in ein 15-Milliliter-Gefäß überführen. Anschließend werden diese Zellen zentrifugiert und als Pellet abgetrennt. Nach dem erneuten Aufschwemmen des Pellets wird die Anzahl der Zellen in der Suspension bestimmt und die Konzentration auf acht mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter eingestellt.

10 ml der Zellsuspension werden anschließend auf eine mit Gelatine beschichtete 10 cm-Schale übertragen. Inkubieren Sie die Schale über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2. Nach der Übernacht-Inkubation wird das Medium aus einer Fibroblastenkultur abgesaugt und 10 ml des Virus enthaltenden Mediums werden dem Meth hinzugefügt. Inkubieren Sie die Zellen für vier Stunden bis über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2.

Am nächsten Tag das Medium von einer Fibroblasten-Kulturschale abziehen und anschließend 10 ml frisches ESL-Medium hinzufügen. Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen eingefroren, vermehrt oder für die Einleitung der Reprogrammierung vorbereitet werden. Um die Reprogrammierung zu starten, das reguläre ESL-Medium durch Medium ersetzen, das Doxycyclin enthält, um die Expression der vier Gene zu initiieren.

Stellen Sie diese Zellen in den Inkubator und wechseln Sie das Medium jeden Tag, bis die Kolonien groß genug sind, um abgenommen zu werden. Die Kolonien sollten etwa eine Woche nach Beginn der Reprogrammierung erstmals sichtbar werden. Sie sollten etwa am Tag 20 groß genug sein, um abgenommen zu werden.

Nun, da 20 Tage vergangen sind, können wir fortfahren und IPS-Kolonien auswählen, bevor die Kolonien entnommen werden. Man sollte darauf achten, die erforderliche Anzahl an mit Gelatine beschichteten 24-Loch-Platten mit gamma-bestrahlten DR-vier-Mythen eine bis zwei Stunden vor der Entnahme vorzubereiten. Man sollte die Kolonien auf den Platten versorgen, indem man kurz vor der Entnahme frisches Medium hinzufügt, und 50 Mikroliter HEPA-Puffer unmittelbar vor der Entnahme in die Vertiefungen einer V-förmigen 96-Loch-Platte gibt, die Schale mit den zu entnehmenden Kolonien einmal mit PBS waschen und 10 ml PBS zur Schale hinzufügen. IPS-Zellkluster können entweder unter einem Stereomikroskop oder einem invertierten Mikroskop ausgewählt werden.

Die Kolonien mit einer kleinen Pipettenspitze aufnehmen und in eine Vertiefung der 96er-Platte überführen, die PBS enthält, um die Aggregate zu entfernen. Mit der Pipettenspitze wird ein Kreis um das Aggregat gezogen, um die Zellhaufen aufzulösen. Anschließend können die reprogrammierten Zellen mit dem Mehrkanalpipettierer entnommen werden; jeweils 20 Mikroliter Trypsin werden hinzugegeben.

Pipettieren Sie die Probe dreimal auf und ab, inkubieren Sie sie 4 Minuten bei 37 °C. Nach der 4-minütigen Inkubation werden 100 µL ES-Medium zu den Trip-Nice-Kolonien gegeben. Pipettieren Sie 10-mal auf und ab und übertragen Sie jeweils sechs Klone.

Von der 96-Well-Platte in eine 24-Well-Platte unter Verwendung einer Pipettenspitze an jeder zweiten Position des 12-fach-Pipettiergeräts werden die Zellen anschließend in der 24-Well-Platte in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen. Ergänzen Sie mit ES-Zellmedium. Die Zellen sind wahrscheinlich in drei bis sieben Tagen zur Weitervermehrung bereit. Einige Tage später. Da die iPS-Zellen nun konfluent sind, aspirations das Medium ab und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter HEPES. Entfernen Sie den HEPES vollständig und geben Sie 100 Mikroliter 1× Trypsin hinzu. Inkubieren Sie 10 Minuten bei 37 °C. Nach der Inkubation mit Trypsin fügen Sie 400 Mikroliter ESL-Medium hinzu und suspendieren die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.

Die 500 µL große Einzelzell-Suspension aus der 24-Loch-Platte wird anschließend in einen einzelnen Wells einer 6-Loch-Platte übertragen und im 37 °C warmen 5 % CO₂-Inkubator inkubiert, bis die Zellen in der 6-Loch-Platte eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen. Zu diesem Zeitpunkt können Sie entweder mit der Amplifikation der Zellen für Southern-Analysen, Blasten, Injektionen, Teratoma-Assays oder in-vitro-Differenzierungs-Assays fortfahren. Außerdem sollten Sie daran denken, Vorratskulturen dieser Zellen einzufrieren, um diesen wertvollen Vorrat an iPS-Zellen nicht zu verlieren.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Pluripotenz in murinen embryonalen Fibroblasten mithilfe eines induzierbaren antiviralen Systems hervorruft. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.