Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

Hallo, mein Name ist Brad Hamilton. Ich bin Wissenschaftler hier in der Forschungs- und Entwicklungsabteilung hier bei STEM Gen. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, wie man menschliche Fibroblasten mit lentiviral abgegebenen Reprogrammierungsfaktoren umprogrammieren kann.

Dieses Verfahren kann sowohl zur Erzeugung von IPS-Zellen als auch zur Untersuchung des Reprogrammierungsprozesses verwendet werden. IPS-Zellen ähneln ES-Zellen in Morphologie, Proliferation und Differenzierungsfähigkeit sowie allen Gewebetypen des Körpers. Humane IPS-Zellen haben einen deutlichen Vorteil gegenüber ES-Zellen, da sie Schlüsseleigenschaften von ES-Zellen aufweisen, ohne das ethische Dilemma, einen Embryo zu zerstören, um die Zellen zu erhalten.

Die Generierung patientenspezifischer IPS-Zellen umgeht ein wichtiges Hindernis für personalisierte Therapien der regenerativen Medizin, indem sie das Potenzial für eine Immunabstoßung von nicht autologen transplantierten Zellen eliminiert. Also lasst uns loslegen. An mehreren Stellen in diesem Protokoll ersetzen Sie das Medium der sich entwickelnden IPSC- oder induzierten pluripotenten Stammzellen durch Meth-konditioniertes Medium.

Die Herstellung dieses Mediums dauert sechs Tage. Beginnen Sie also mindestens eine Woche, bevor Sie mit Ihrem Experiment beginnen möchten. Zu Beginn säen Sie jede Vertiefung von einer sechs.

Well-Platte mit zweimal 10 bis zum fünften cf einer Meth-Feeder-Zellen in zwei Milliliter Meth-Wachstum geben. Medium über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium auf humane E-S-I-P-S-Zellkultur.

Medium über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Sammeln Sie den Überstand und ersetzen Sie ihn vier Tage lang alle 24 Stunden durch frisches Medium. Filtern Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikrometer-Filter.

Ergänzen Sie den gesammelten Überstand mit 15 Nanogramm pro Milliliter BFGF basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor. Du wirst am Ende etwa 16 Milliliter Meth konditioniertes Medium haben, lagere jeden Tag den gesammelten Überstand separat bei vier Grad SIUs. Meth-konditioniertes Medium kann ein bis zwei Wochen bei vier Grad Celsius oder mehrere Monate bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Jetzt, da Du sicher bist, dass Dein mit Meth konditioniertes Medium bereit ist, wenn Du es brauchst, lass uns über die Vorbereitung der Zellen sprechen. Die erste Aufgabe bei der Generierung von IPSC besteht darin, Lentiviren zu verwenden, um menschliche Vorhaut-Fibroblastenzellen oder BJ-Zellen mit vier Transkriptionen zu transduzieren, die für Stammzellen charakteristisch sind. Zur Vorbereitung der Transduktion säen BJ-Zellen mit einer Dichte von eins mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und Kultur.

Die Zellen wachsen in zwei Millilitern, Medium über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid am selben Tag. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Meth-Feeder-Platten, indem Sie zwei Milliliter 0,1 % Gelatine, in Wasser verdünnt, auf eine Sechs-Well-Platte geben und über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Die Gelatine bedeckt die Vertiefungen und dient als Matrix für diese.

Nun sind die BJ-Zellen bereit für die lentivirale Transduktion, um das Virus für die Transduktion vorzubereiten. Ergänzen Sie zwei Milliliter frisches Medium mit sechs Mikrogramm pro Milliliter Polyhirn und vier Lentiviren, die jeweils einen der menschlichen Transkriptionsfaktoren exprimieren. T vier, SO zwei nanog und lin 28, so dass beide die gleiche Multiplizität der Infektion oder MOI aufweisen.

Diese Lentiviren sind alle im Lentivirus-Set des humanen Reprogrammierungsfaktors enthalten. Um die Transduktion durchzuführen, ersetzen Sie einfach das BJ-Zellwachstumsmedium durch das virushaltige Medium. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, damit das Medium den Boden gleichmäßig bedeckt.

Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid am selben Tag. Nehmen Sie ein Fläschchen mit cf one Meth-Feederzellen aus dem flüssigen Stickstoff und tauen Sie es auf. Entferne die Gelatinelösung von den Meth-Feeder-Platten, die nun mit Gelatine überzogen sind.

Nun, fügen Sie 0,2 mal 10 zu den fünften Zellen in zwei Milliliter Meth-Wachstum hinzu. Mittel. Inkubieren Sie das MES über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag lösen Sie die BJ-Zellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA ab und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 200 g.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand aspiriert und die Zellen in Wachstumsmedium resuspendiert. Entferne das Medium von der Meth-Feeder-Platte und füge zwei Milliliter der BJ-Zellsuspension pro Vertiefung hinzu. Die BJ-Zellkonzentration sollte ungefähr fünfmal 10 bis zur vierten Zelle pro Vertiefung betragen.

Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. 24 Stunden nach dem Rückzug der BJ-Zellen auf der Meth-Feeder-Platte das Medium durch humanes E-S-I-P-S ersetzen, d. h. eine embryonale Stammzellkultur oder eine induzierte pluripotente Stammzellkultur. Mittel. Wechseln Sie das Medium sieben Tage lang alle 24 Stunden.

Ersetzen Sie am siebten Tag das ES-Zellkulturmedium durch zwei Milliliter Meth-konditioniertes Medium. Die Meth-Feeder-Zellen liefern die löslichen Faktoren, die für das Wachstum von IPS-Zellen benötigt werden. Aber jetzt müssen wir weitere dieser Faktoren hinzufügen, um die Kultur gesund zu halten.

Meth-konditioniertes Medium enthält alle löslichen Faktoren, die von Meth-Feeder-Zellen sezerniert werden, die über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubiert werden. Durchsuchen Sie den Bereich und wählen Sie eine Zellkolonie aus. Gekennzeichnet durch ein kleines, kompaktes, kuppelartiges Erscheinungsbild in einer frischen 24-Well-Platte, der Sie 24 Stunden zuvor mit ccf one Meth-Feeder-Zellen vorausgegangen sind, ziehen sich die ausgewählte Kolonie in humaner E-S-I-P-S-Kultur zurück.

Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren Stammmolekülen Y 2 7 6 3 2. Ein abhängiger Kinase-Inhibitor. Wechseln Sie das Kulturmedium ohne Zugabe mit dem Stammmolekül Y 2 7 6 3 2 alle 24 Stunden in den ersten sieben Tagen.

Nach sieben Tagen wechseln Sie das Medium zu Meth. Bedingung zu Medium setzt die Passage der Zellen fort, bis sie eine typische humane ES-Zellmorphologie aufweisen. Halte Ausschau nach kleinen, kompakten, kuppelartigen Kolonien mit scharfen Kanten.

Die Kolonien sollten gleichmäßig sein und ein hohes Verhältnis von Zellkern zu Zytoplasma aufweisen. Zu diesem Zeitpunkt haben Sie Kolonien entwickelt, die die Morphologie von ES-Zellen haben, aber exprimieren sie auch Gene, die für ES-Zellen charakteristisch sind? Um dies herauszufinden, färben Sie die Kolonien auf Marker der Pluripotenz wie TRA 180 1 TRA one 60 SSEA vier s, SE, a drei T vier sox, zwei Nanog und SSEA one Um die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS zu waschen.

Fixieren Sie anschließend die Zellen mit 500 Mikrolitern 4% Paraform, Aldehyd oder einem anderen Fixiermittel für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen nach 20 Minuten weitere Male mit PB S3, um überschüssiges Fixiermittel zu entfernen. Als nächstes blockieren Sie die unspezifische Bindung, indem Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 500 Mikrolitern Blockpuffer pro Vertiefung inkubieren. Nach dem Blockierungsschritt fügen Sie jeweils 250 Mikroliter Primärantikörper, verdünnt einen bis 100 in Blockierungspuffer

Inkubieren Sie die Zellen am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius in Primärantikörpern. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, um ungebundene Primärantikörper zu entfernen. Inkubieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern Sekundärantikörper, verdünnt um eins bis 300 und Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur, wobei Sie sich von Licht fernhalten sollten, um Photobleichen nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper zu vermeiden.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS bis zur dritten Wäsche. Fügen Sie DPI in einer Menge von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu, um die Zellkerne zu färben. Analysieren Sie schließlich die Genexpression Ihrer IPS-Zellen.

Unter dem Mikroskop wurden bereits am vierten Tag nach der Transduktion morphologische Veränderungen bei menschlichen Vier-Haut-Fiberblastenzellen beobachtet, bei denen cot mit T, vier SOX, zwei Nanog und lin 28 transduziert wurde, und der Zellcluster wurde am Tag 17 dichter gepackt, wenn die Expression von Plurry-Potenzmarkern vorhanden war. Um die isolierten IPS-Zellkolonien weiter zu charakterisieren, suchten wir nach dem Vorhandensein von gemeinsamen Pluripotenzmarkern, die in ES-Zellen exprimiert werden. Die Kolonien zeigten eine starke alkalische Phosphatase-Aktivität.

Zusätzlich wurde die Immunchemie oder ICC an den IPS-Zellkolonien mit einer Reihe von Pluripotenzmarker-spezifischen Antikörpern durchgeführt, darunter die Oberflächenmarker TA 180, 1, TRA eins, 60, SSEA vier und SS EEA drei sowie die nuklearen Marker, T vier, SOX zwei und Nanog. Die isolierten IPS-Kolonien waren für alle Marker positiv. Die ICC-Ergebnisse zeigen, dass die IPS-Zellen das entsprechende Expressionsmuster für Pluripotenzmarker aufwiesen, was zeigt, dass diese IPS-Zellen undifferenzierten menschlichen E-es-Zellen sehr ähnlich sind.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie IPS-Zellen erzeugen können, indem Sie menschliche Fibroblasten mit Stammgenerationen umprogrammieren. Menschlicher Reprogrammierungsfaktor Lentivirus gesetzt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, mehrere Faktoren zu berücksichtigen.

Zunächst muss das Verhältnis von aktivem Virus zu Ziel während des primären Transduktionsschritts möglicherweise modifiziert werden, um eine optimale Transduktionseffizienz zu erreichen. Zweitens kann sich der Wachstumszustand der Zielzellen auswirken. Die Reprogrammierung gesunder und proliferativer Zellen ist für eine Reprogrammierung empfänglicher.

Drittens wird empfohlen, wenn das Protokoll für verschiedene Zellzahlen modifiziert wird, dass die Zielzellzahlen proportional zur Oberfläche der Kulturschale angepasst werden. Schließlich sollte die Anwendung von Gesteinsinhibitoren wie Y 2 7 6 3 2 in Betracht gezogen werden, um eine erfolgreiche Reprogrammierung zu gewährleisten, da neuere Studien ihren Nutzen bei der Verbesserung des Überlebens der menschlichen Kolonie gezeigt haben. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.