Name: Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Erfahren Sie, wie therapeutische siRNA mit kationischen und anionischen Liposomen über die Blut-Hirn-Schranke ins ZNS gelangt. Diese Methode minimiert neuronale Schäden und ermöglicht gezielte Behandlungen neurodegenerativer Erkrankungen.

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Wir möchten uns bei den folgenden Finanzierungsquellen bedanken: dem CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) und dem NIH Research Grant Program (R01 NS075214-01A1). Wir danken dem Labor Telling für die Verwendung ihres monoklonalen Antikörpers PRC5. Wir möchten uns auch beim Dow-Labor für die DOTAP-Liposomen bedanken und dafür, dass sie ihr Know-how bei der Herstellung von Liposomen mit uns geteilt haben.

Alle Mäuse wurden in Labortier Ressourcen gezüchtet und gepflegt, von der Association akkreditiert für Evaluierung und Akkreditierung von Lab Animal Care International, in Übereinstimmung mit den Protokollen von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Colorado State University genehmigt. 1. Herstellung von LSPCs <ol><li> Verwenden Sie ein 1: 1 DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan): Cholesterin-Verhältnis für LSPCs. Für ein 4 nmol Liposom-Zubereitung, Mischung 2 nmol DOTAP und 2 nmol von Cholesterin in 10 ml eines 1: 1 Chloroform: Methanol-Lösung in einem Kolben. </li><li> Verdunsten 9 ml Chloroform: Methanol - Lösung unter Verwendung von N 2 -Gas in einer Abzugshaube. Dampft die letzten 1 ml Lösungsmittel in einem Abzug über Nacht ohne Gas. Beobachten eines dünnen Lipidfilm auf dem Boden des Kolbens. </li><li> Wärme 10 ml einer 10% Saccharose-Lösung auf 55 ° C. </li><li> Gießen Sie die erhitzte 10% Saccharose - Lösung auf die dünne Lipidfilm langsam, dh 1 ml / min, während gently Schwenken des Kolbens. Aufrechterhaltung der 10% Sucrose und Kolben mit Lipiden bei 55 ° C so, dass die Lipidmoleküle in dem Gel-Flüssigkeits-Phase verbleiben. Rehydrierung Ergebnisse in multilamellare Vesikel (MLV) Bildung. </li><li> Erlauben Lipide für mindestens eine Stunde bei 55 ° C rehydriert, bevor die Liposomen Größen. </li><li> Montieren eines Extruders den Anweisungen des Herstellers mit 1,0 &amp; mgr; m-Filter oder verwenden 1,0 um Spritzenfilter für die Dimensionierung. </li><li> 1 ml der erwärmten Liposomensuspension auf eine der Spritzen auf den Extruder, und passieren die Suspension zwischen den zwei Spritzen 11 mal. Stellen Sie sicher, dass die Suspension in die entgegengesetzte Spritze ist als die Ausgangs Spritze nach den 11 verläuft. </li><li> Größe die Liposomen wieder durch 0,45 um dann 0,2 um Filter große unilamellare Vesikel (LUV) zu erzeugen. Halten Sie die Liposomensuspension zur einfacheren Dimensionierung erwärmt. </li><li> Inkubiere 20 ul des 4 nmol Liposom-Suspension (200 &amp; mgr; M) mit 200 &amp; mgr; l einer 20 &amp; mgr; M (4nmol gesamt) Lager siRNA-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubiere 80 ul einer 500 uM (40 nmol Gesamt) stock RVG-9R-Lösung mit der siRNA / Liposom-Lösung für 10 min bei RT. LSPCs sollte so bald wie möglich verwendet werden, sondern kann bis zu mehreren Stunden nach der Herstellung verwendet werden. Store LSPCs bei 4 ° C für mehrere Stunden nach der Zubereitung. </li></ol> 2. Herstellung von PALETS <ol><li> Verwenden, um eine 55: 40: 5 Molverhältnis von entweder DSPE (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin): Cholesterin: DSPE-PEG oder DOTAP: Cholesterin: DSPE-PEG für PALETS. Für ein 4 nmol Liposom-Zubereitung, Mischung 2,2 nmol entweder DSPE oder DOTAP, 1,6 nMol von Cholesterin und 0,2 nmol von DSPE-PEG in 10 ml eines 2: 1 Chloroform: Methanol-Lösung in einem Kolben. </li><li> Bereiten Sie Liposomensuspension genau wie in Schritt 1.1 und 1.2 oben beschrieben. Rehydrieren DSPE-Liposomen in 10 ml 1x PBS erhitzt auf 75ºC, Zugabe von 1 ml / min. Erlauben Lipiden bei 75 ° C rehydriert zuminmindestens 1 Stunde vor dem Kalibrieren. </li><li> Größe der Liposomensuspension genau wie in Schritt 1.6-1.8 beschrieben. </li><li> Pipettieren 20 ul jeder der 4 nmol (200 uM) Liposomensuspensionen in einzelne Aliquots nach DOTAP und DSPE Liposomen Größe gewesen, und für 30 min lyophilisieren ein Benchtop - Gefriertrockner (Abbildung 2). </li><li> Inkubieren 200 ul einer 20 uM (4 nmol Gesamt) stock siRNA-Lösung mit 1,4 ul einer 26,6 &amp; mgr; M Lösung von Protaminsulfat für 10 min bei RT für siRNA, die in DSPE PALETS Liposomen verkapselt werden soll. </li><li> Rehydratisieren die DOTAP PALETS Liposomen mit 200 ul einer 4 nmol Stammlösung von siRNA oder DSPE PALETS Liposomen mit 201,4 &amp; mgr; l der siRNA / Protamin Lösung rehydratisiert. Inkubieren Liposom / siRNA-Lösung für 10 min bei RT. </li><li> Werden 10 ul einer 60 mM 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC) Lösung der Liposomen / siRNA Lösung sowohl DOTAP und DSPE PALETS. </li><li> Werden 10 ul einer 150 mM N-Hydroxysulfosuccinimid (sulfo-NHS) Lösung der Liposomen / siRNA Lösung sowohl DOTAP und DSPE PALETS. </li><li> Inkubieren des EDC und sulfo-NHS mit der siRNA / Liposomen-Suspension für 2 h bei RT. </li><li> Inkubiere 80 ul einer 500 uM (40 nmol Gesamt) stock RVG-9R-Lösung mit der siRNA / Liposom-Vernetzungslösung für 10 min bei RT. HINWEIS: Die EDC / Sulfo-NHS die RVG-9R zu kovalent an die PEG-Lipide ermöglicht. Verwenden Sie PALETS innerhalb von mehreren Stunden nach der Vorbereitung. Store PALETS bei 4 ° C für mehrere Stunden nach der Zubereitung. </li><li> Um siRNA Verkapselungswirksamkeit von PALETS bestimmen: <ol><li> Messen der Konzentration von siRNA vor und nach der Zugabe von Protamin und Liposomen unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 260 nm eingestellt. </li><li> Filtern Sie die nicht eingekapselten siRNA aus dem Liposom / verkapselt siRNA Suspension mit 50 kDa Zentrifugalfilter. Zentrifuge bei 1000 × g für 20 min. </li><li> Messen der Konzentration vonunverkapselte siRNA im Filtrat und der Konzentration an verkapseltem siRNA im Retentat eines Spektrophotometers bei 260 nm verwendet wird. </li></ol></li></ol> 3. Injizierender Mäuse mit LSPCs oder PALETS <ol><li> Expose Mäuse für 5-10 min einer Wärmelampe Gefäß aufzuweiten. </li><li> Anesthetize Maus mit einem 2-3% Isofluran / Sauerstoff fließen 5-10 min vor der Injektion und während der Injektion. Bestätigen anesthetization wenn Tier ist nicht mehr ambulanter und Respiration verlangsamt haben durch eine Zehe Prise zu tun. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken oder der Seite, um die Schwanzvene zugreifen. Verwenden Sie vet Salbe auf die Augen der Maus Austrocknen zu verhindern, während sie unter Narkose. </li><li> Wischen / Spray den Schwanz mit 70% EtOH und injizieren 300 ul LSPCs oder PALETS auf die Schwanzvene der Maus eine 26 G Insulin-Spritze. Beginnen Sie distal in die Schwanzvene Injektion und proximal zu bewegen, wenn die Vene oder Brüche zusammenbricht. </li><li> Bewegen Sie die Maus in einem sauberen Käfig, bis sie Brustlage beibehält. Stellen Sie keine moverwenden, um mit anderen Käfiggenossen, bis sie vollständig erholt hat. Die Mäuse sollten in 5 bis 15 min zu erholen. Sie können auf einem Heizkissen oder unter einer Heizlampe angeordnet werden Körpertemperatur zu halten, wenn Erholung länger braucht. Die Mäuse sollten genau überwacht werden, um Schutz vor Überhitzung. </li><li> Überwachen Sie die Tier mehrere Stunden nach der Injektion, um sicherzustellen, Anästhesie nachlässt, und es gibt keine negativen Auswirkungen der Behandlung. Lassen Sie die LSPCs oder PALETS für mindestens 24 Stunden zirkulieren zu lassen. </li></ol> 4. Analyse der Proteinexpression über Durchflusszytometrie <ol><li> Euthanize Mäuse mit einer 20% CO 2 Durchflussrate für 15 min. </li><li> Präparieren aus einem halben Hemisphäre des Gehirns durch Schneiden der Haut und Schädel der Maus mit einer Schere entfernt. Peel weg halben Hemisphäre des Gehirns aus dem Schädel entfernt Zangen oder das Ende einer Schere. </li><li> Press halben Hemisphäre des Gehirns von jeder Maus durch ein 40 &amp; mgr; m mesh Zellsieb 2,5 ml FACS Puffer (1x; PBS, 1% fötalem Rinderserum, 10 mM EDTA) in einer Petrischale mit dem Kolben einer Spritze. </li><li> Spülen Sie die Zelle Sieb und Petrischale mit einem zusätzlichen 2,5 ml FACS-Puffer. Legen Sie die Einzelzellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis. </li><li> Jeweils 100 ul der 5 ml Einzelzellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiere für 5 Minuten bei 350 x g. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in 1 ml FACS-Puffer. Spin bei 350 xg für 5 min. Wiederholen Sie mit weiteren 1 ml FACS-Puffer. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis. </li><li> Inkubieren der Zellen in 100 ul 1: 100-Verdünnung einer 0,5 mg / ml Ratten-anti-Maus-Fc-Block in FACS-Puffer für 30-60 min auf Eis. Pelletieren, und die Zellen wie in Schritt 4.5 waschen. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis. </li><li> Inkubieren der Zellen in 100 ul einer 20 ug / ml Fluoreszenz - Antikörper gegen Maus - PrP C in 7% Mausserum in FACS - Puffer auf Eis für 30-60 min. Pelletieren, und die Zellen wie in Schritt 4.5 waschen. Halten Sie die Zellsuspensionauf Eis. </li><li> Pellet und die Zellen in 1 ml RBC - Lyse - Puffer (1x PBS, 155 mM NH 4 Cl, 12 mM NaHCO 3, 0,1 mM EDTA) für 1 min resuspendieren. Pellet wie in Schritt 4.5 und die Zellen in 1 ml FACS-Puffer resuspendieren. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis. </li><li> Analysieren PrP C - Ausdruck ein Durchflusszytometer unter Verwendung von wie zuvor 10 beschrieben. Tor lebende Zellen aus Gesamtzellpopulation. Tor PrP C + Zellen von lebenden Zellpopulation MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) zu bestimmen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll, das zwei Systeme zur gezielten Verabreichung zu schaffen, die effizient siRNA zum ZNS transportiert. Frühere Verfahren zur enthalten siRNA zum ZNS Liefern Injizieren siRNA / shRNA Vektoren direkt in das Gehirn, intravenöse Injektion von gezielten siRNA oder intravenöse Injektion von nicht-zielgerichteten Liposomen-siRNA-Komplexe. Injektion von siRNA / shRNA Vektoren in das ZNS verursacht eine Abnahme der Zielprotein-Expressionsniveaus. Jedoch die siRNA / shRNA diffundiert nicht f...

Prionen sind schwere neurodegenerative Erkrankungen, die das ZNS beeinflussen. Prionenkrankheiten ergeben sich aus der Fehlfaltung des normalen zellulären Prionproteins PrP C, durch einen infektiösen Isomer genannt PrP Res. Diese Krankheiten betreffen eine Vielzahl von Arten , einschließlich der bovinen spongiformen Enzephalopathie bei Rindern, Scrapie bei Schafen, Chronic Wasting Disease bei Hirschartigen, und der Creutzfeldt-Jakob - Krankheit beim Menschen 1-3. Prionen verursachen Neurodegeneration, die mit synaptischen Verlust beginnt, und zu Vakuolisation fortschreitet, Gliose, Neuronenverlust und Plaque-Ablagerungen. Schließlich, was zum Tod des Tieres / Einzel - 4. Seit Jahrzehnten haben Forscher untersuchten Verbindungen gemeint, zu verlangsamen oder das Fortschreiten der Prionenerkrankung stoppen. Allerdings haben die Forscher nicht entweder eine erfolgreiche Therapie oder eine wirksame systemische Abgabe Fahrzeug gefunden. Endogenes PrP C Expression für die Entwicklung von Prionenkrankheiten notwendigen 5 </sup&gt;. Daher Verringern oder Eliminieren PrP C - Expression in einer Verzögerung oder Linderung von Krankheiten führen kann. Mehrere Gruppen erstellt transgene Mäuse mit reduzierten Mengen an PrP C oder injiziert lentivectors shRNA direkt in murine Hirngewebe exprimiert die Rolle von PrP C - Expressionsniveaus in Prion - Krankheit zu untersuchen. Diese Forscher Verringerung der Menge an neuronaler PrP C gefunden führte die progressive neuropathology von Prion - Erkrankungen in Anhalten und verlängert die Lebensdauer der Tiere 6-9. Wir haben in der Clearance von PrP Res in Maus - Neuroblastomzellen 10 , dass PrP C siRNA Behandlungsergebnisse berichtet. Diese Studien legen nahe , dass die Verwendung von Therapien PrP C Expressionsniveaus, wie small interfering RNA (siRNA), die spaltet mRNA, ausreichend verzögert das Fortschreiten der Prion - Krankheiten können zu verringern. Allerdings sind die meisten Therapien für Prionenerkrankungen untersucht wurden in einer Weise geliefert, die nicht praktikabel wärein einer klinischen Umgebung. Daher muss ein siRNA-Therapie eine systemische Verabreichungssystem, das an das ZNS intravenös und gezielte geliefert wird. Die Ermittler haben die Verwendung von Liposomen als Abgabevehikel für die Gentherapie Produkte untersucht. Kationische und anionische Lipide zur Bildung von Liposomen verwendet beides. Kationische Lipide sind weiter verbreitet als anionische Lipide verwendet, weil die Ladungsdifferenz zwischen dem kationischen Lipid und DNA / RNA für eine effiziente Verpackung ermöglicht. Ein weiterer Vorteil von kationischen Lipiden ist , dass sie die Zellmembran leichter als andere Lipide 11-14 kreuzen. Jedoch kationische Lipide sind immunogener als anionische Lipide 13,14. Daher haben begonnen Forscher unter Verwendung von kationischen zu verschieben Lipiden in Liposomen anionische. Die Gentherapie Produkte effizient in anionische Liposomen verpackt werden , um die positiv geladenen Peptid Protaminsulfat verwendet, die DNA kondensiert / RNA - Moleküle 15-19. Da anionische lipids sind weniger immunogen als kationische Lipide sie Zirkulationszeiten zugenommen haben kann, und kann in Tiermodellen 13,14 toleriert werden. Liposome werden auf spezifische Gewebe gezielt Peptide unter Verwendung von Targeting, die an die Liposomen gebunden sind. Die RVG-9R Neuropeptid, das an nikotinische Acetylcholin - Rezeptoren bindet, wurde verwendet, siRNA und Liposomen an das ZNS 17-20 abzuzielen. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll drei siRNA Fahrzeuge zu produzieren und zu verpacken und die siRNA zu neuronalen Zellen (Abbildung 1) zu liefern. Liposom-siRNA-Peptid-Komplexe (LSPCs) bestehen aus Liposomen mit siRNA und die RVG-9R Peptid elektrostatisch an der äußeren Oberfläche des Liposoms Targeting. Peptid gerichtet Liposomen therapeutische siRNA (PALETS) eingekapselt sind, bestehend aus siRNA und Protamin im Liposom verkapselt, mit RVG-9R zu Lipid PEG-Gruppen kovalent gebunden sind. die folgenden Methoden verwenden LSPCs und PALET zu erzeugenS, PrP C siRNA verringert PrP C Ausdruck zu 90% in neuronalen Zellen auf, die enorme Versprechen hält das Auftreten von Prion - Krankheit Pathologie zu heilen oder erheblich verzögern.

<table><tbody><tr><td>DOTAP Lipid</td><td>Avanti Lipids</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Avanti Lipide</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>DSPE</td><td>Avanti Lipide</td><td>850715</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG</td><td>Avanti Lipide</td><td>880125</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC268320010</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>EMD Millipore</td><td>113351</td><td></td></tr><tr><td>N2 Gas</td><td>AirGas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti Lipide</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>1,0, 0,4 und 0,2 &#956; m Filter</td><td>Avanti Lipids</td><td>610010, 610007, 610006</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Protaminsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10275205</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>Aliquotiert für den Einmalgebrauch</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td>Aliquotiert für den Einmalgebrauch</td></tr><tr><td>40 &#956; m Zellsieb</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD16/CD32 Fc-Block</td><td>BD Pharmigen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PrP Antikörper (PRC5)</td><td>Proprietär - PRC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

abgabe von therapeutischen sirna an das zns mit kationischen und anionische liposome

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prionenkrankheiten resultieren aus der Fehlfaltung des normalen, zellulären Prionenproteins (PrPC) zu einem abnormalen Protease-resistentenIsomer namens PrP Res. Das Auftreten von Prionenkrankheiten in Wildtierpopulationen und ihre zunehmende Bedrohung für die menschliche Gesundheit haben zu verstärkten Bemühungen geführt, eine Behandlung für diese Krankheiten zu finden. Jüngste Studien haben zahlreiche Anti-Prionen-Verbindungen gefunden, die entweder das infektiöse PrP-Res-Isomer hemmen oder das normale zelluläre Prionenprotein herunterregulieren können. Die meisten dieser Verbindungen überwinden jedoch nicht die Blut-Hirn-Schranke, um die PrP-Res-Bildung im Hirngewebe wirksam zu hemmen, zielen nicht spezifisch auf neuronales PrPC ab und sind oft zu giftig, um sie bei Tieren oder Menschen zu verwenden. 
Wir untersuchten, ob siRNA, die intravaskulär verabreicht wird und auf neuronales PrPC abzielt, eine sicherere und wirksamere Anti-Prionen-Verbindung ist. In diesem Bericht wird ein Protokoll zur Herstellung von zwei liposomalen siRNA-Verabreichungsvehikeln sowie zur Verpackung und Abgabe von PrP-siRNA an neuronale Zellen beschrieben. Die beiden liposomalen Verabreichungsvehikel sind 1) eine komplexierte siRNA-Liposomenformulierung unter Verwendung von kationischen Liposomen (LSPCs) und 2) eine verkapselte siRNA-Liposomenformulierung unter Verwendung von kationischen oder anionischen Liposomen (PALETS). Für die LSPCs wird negativ geladene siRNA elektrostatisch an das kationische Liposom gebunden. Dem Komplex wird ein positiv geladenes Peptid (RVG-9r [Tollwutvirus-Glykoprotein]) zugesetzt, das spezifisch auf die Liposomen-siRNA-Peptid-Komplexe (LSPCs) über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) bis hin zu den Acetylcholin-exprimierenden Neuronen im Zentralnervensystem (ZNS) abzielt. Für die PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA) wurden die kationischen und anionischen Lipide durch die PrP siRNA rehydriert. Dieses Verfahren führt zu einer Verkapselung der siRNA innerhalb der kationischen oder anionischen Liposomen. Auch hier wurde das RVG-9r-Neuropeptid an die Liposomen gebunden, um die siRNA/Liposomen-Komplexe an das ZNS zu leiten. Unter Verwendung dieser Formulierungen haben wir erfolgreich PrP-siRNA an AchR-exprimierende Neuronen abgegeben und diePrP-C-Expression von Neuronen im ZNS verringert.

Um die Effizienz der siRNA Die Verkapselung in anionischer PALETS erhöhen, wurde die siRNA mit Protamin gemischt. Um die beste Protamin Konzentration für die siRNA bestimmen, wurde die siRNA mit verschiedenen Konzentrationen von Protamin gemischt, von 1: 1 bis 2: 1 (3A). Es gab eine 60-65% siRNA Verkapselungseffizienz in anionischen Liposomen ohne Verwendung von Protamin. Proben mit Protamin: siRNA Molverhältnissen von 1: 1 bis 1,5: 1 (133-266 nM) hatten 80-90% siRNA Ver...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, kationische/anionische Liposomen mit einem Neuro-Targeting-Peptid als ZNS-Verabreichungssystem zu verwenden, damit siRNA die BHS passieren kann. Die Optimierung eines Verabreichungssystems für Behandlungen wie siRNA würde mehr Behandlungsoptionen für Prionen und andere neurodegenerative Erkrankungen ermöglichen.

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Abgabesystem zu entwickeln, das kleine Molekülwirkstoffe wie siRNA ins Gehirn befördern kann. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Neurodegeneration beantworten, beispielsweise: Ist siRNA eine vielversprechende therapeutische Option bei Proteinfaltungsstörungen? Und können wir ein zuverlässiges Drug-Delivery-System für das Gehirn entwerfen?Der Hauptvorteil der Herstellung eines liposomalen Drug-Delivery-Systems liegt darin, dass wir unser siRNA intravenös oder über den Blutstrom verabreichen können, anstatt direkt in neuronales Gewebe einzubringen, was zu einer Schädigung der Neuronen führen würde. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie und Diagnostik neurodegenerativer Erkrankungen, da sie eine gezielte Übertragung über die Blut-Hirn-Schranke hinweg ermöglicht, insbesondere zu Acetylcholin-exprimierenden Neuronen. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend, da Injektionen in die Schwanzvene von Mäusen aufgrund der geringen Größe der Venen schwer zu erlernen sind.Beginnen Sie mit der Herstellung eines Liposomenfilms im Verhältnis eins zu eins von DOTAP zu Cholesterin. Für die Herstellung von Liposomen für ausländische Tiere mischen Sie zwei Nanomol DOTAP und zwei Nanomol Cholesterin in zehn Milliliter einer Chloroform-Methanol-Lösung im Verhältnis eins zu eins. Anschließend verdampfen Sie neun Milliliter der Chloroform-Methanol-Lösung unter Verwendung von Stickstoffgas.Verdampfen Sie das letzte Milliliter Lösungsmittel über Nacht im Abzug ohne Gaszufuhr. Am nächsten Tag sollte ein dünner Lipidfilm auf dem Boden des Kolbens sichtbar sein. Erwärmen Sie sowohl diesen Kolben mit dem Lipidfilm als auch zehn Milliliter einer zehnprozentigen Saccharoselösung auf 55 Grad Celsius.Danach langsam die erhitzte Saccharoselösung unter vorsichtigem Schwenken des Kolbens auf den dünnen Lipidfilm pipettieren. Als Nächstes einen Extruder mit Ein-Mikrometer-Filtern gemäß den Herstelleranweisungen zusammenbauen. Danach ein Milliliter der erhitzten Liposomensuspension in eine der Spritzen des Extruders geben.Dann die Suspension elfmal zwischen den beiden Spritzen hin und her geben. Unter Beibehaltung der Erwärmung der Liposomen-Suspension für eine einfachere Größenanpassung die Liposomen nacheinander durch einen 45-Mikrometer- und einen 2-Mikrometer-Filter vergrößern. Um große, unilamelläre Vesikel herzustellen, anschließend 20 Mikroliter der vier-Nanomol-Liposomen-Suspension zu 200 Mikrolitern einer 20-Mikromolar-Stammlösung von siRNA geben und zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach 80 Mikroliter einer 500-Mikromolar-Stammlösung des RVG-9R-Targeting-Peptids zur siRNA-Liposomen-Lösung hinzufügen und zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Stellen Sie eine Suspension fremder tierischer Liposomen her, indem Sie 2,2 Nanomol entweder DSPE oder DOTAP mit 10 Millilitern einer Chloroform-zu-Methanol-Lösung im Verhältnis 2:1, die 1,6 Nanomol Cholesterin und 2 Nanomol DSPE-PEG enthält, vermischen. Anschließend Stickstoffgas zuführen und, sobald das meiste Lösungsmittel verdampft ist, das Gefäß über Nacht im Abzug stehen lassen. Danach langsam 10 Milliliter 1X PBS, erhitzt auf 75 Grad Celsius, auf den dünnen Lipidfilm geben.Lassen Sie die Lipide vor der Größenanpassung mindestens eine Stunde lang bei 75 Grad Celsius rehydrieren. Nach der Größenanpassung der Liposom-Suspension mithilfe eines Extruders wie zuvor beschrieben, pipettieren Sie 20 Mikroliter jeder der vier Nanomol-Liposom-Suspensionen in Einmalportionen und lyophilisieren Sie diese 30 Minuten lang mit einem Labortrockner. Geben Sie anschließend 1,4 Mikroliter einer 26,6-Mikromolar-Lösung von Protaminsulfat zu 200 Mikrolitern einer 20-Mikromolar-Grundlösung an siRNA und inkubieren Sie zehn Minuten bei Raumtemperatur, um die siRNA zu kondensieren.Nach der Inkubation die DSPE-Pellets mit 201,4 µL siRNA-Protamin-Lösung rehydrieren. Die DOTAP-Pellets mit 200 µL einer fremden tierischen siRNA-Stammlösung rehydrieren. Jede Liposomen-siRNA-Lösung zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Fügen Sie danach zehn Mikroliter einer 60 Millimolar EDC-Lösung zu jedem Röhrchen mit rehydrierten Liposomen hinzu. Anschließend geben Sie zehn Mikroliter einer 150 Millimolar Sulfo-NHS-Lösung zu der Liposom-siRNA-Lösung für beide DOTAP- und DSPE-Pellets. Inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur.Als Letztes 80 µL einer 500 µM-Stammlösung des RVG-9R-Peptids zur siRNA-Liposomen-Vernetzungslösung hinzufügen und zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Anästhesie einer Maus mit zwei bis drei Prozent Isofluran in Sauerstoff die Augen der Maus mit Augensalbe abdecken und die Anästhesie durch einen Zehenquetschtest bestätigen. Fortfahren nur, wenn keine Reaktion erfolgt.Während der Aufrechterhaltung der Anästhesie das Tier auf den Rücken oder die Seite legen, um Zugang zur Schwanzvene zu erhalten. Den Schwanz mit 70 Prozentigem Ethanol abwischen und anschließend mit einer 26-Gauge-Insulinspritze 300 Mikroliter LSPCs oder Palets in die Schwanzvene injizieren. Das Injizieren distal beginnen und proximal fortfahren, falls die Vene kollabiert oder reißt.Stellen Sie die Maus in einen sauberen Käfig, bis sie die Brustlage beibehält. Überwachen Sie das Tier mehrere Stunden nach der Injektion, um sicherzustellen, dass die Anästhesie nachlässt und keine negativen Wirkungen der Behandlung auftreten. Nachdem die LSPCs oder Palets mindestens 24 Stunden zirkulieren konnten und die Maus euthanasiert wurde, dissezieren Sie eine halbe Gehirnhemisphäre aus.Danach die halbe Petrischale und 2,5 Milliliter Fax-Puffer auf einen 40-Mikron-Mesh-Zellfilter geben und den Kolben eines Spritzenzylinders verwenden, um das Gewebe durch den Filter in eine Petrischale zu pressen. Die Zellfiltereinheit und die Petrischale mit weiteren 2,5 Millilitern Fax-Puffer spülen. Anschließend die Einzelzell-Suspension in ein 15-Milliliter-Konischglas überführen und auf Eis stellen.Als Nächstes pipettieren Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren fünf Minuten bei 350 × g. Nach dem Verwerfen des Überstandes wird das Zellpellet in einem Milliliter Fax-Puffer resuspendiert und erneut zentrifugiert. Anschließend wird ein weiterer Milliliter Fax-Puffer hinzugegeben, und die Zellsuspension wird auf Eis gestellt. Inkubieren Sie die Zellen nun für 30 bis 60 Minuten auf Eis in 100 Mikrolitern Ratten-Anti-Maus-Fc-Block in Fax-Puffer.Nach dem Zentrifugieren und Waschen wie zuvor werden 100 Mikroliter fluoreszierende primäre Antikörperlösung hinzugefügt und die Probe für 30 bis 60 Minuten auf Eis gestellt. Nach einem abschließenden Waschschritt werden die Zellen in einem Milliliter RVC-Lysepuffer für eine Minute resuspendiert. Anschließend werden die Zellen zentrifugiert.Nach dem Verwerfen des Puffers in einem Milliliter Fax-Puffer resuspendieren und auf Eis stellen. Die Zellen sind nun bereit für die Fax-Analyse. Bei Mäusen, die mit siRNA behandelt wurden, die über LSPCs verabreicht wurde, zeigte sich im Vergleich zur PBS-Kontrolle eine signifikante Abnahme der zellulären Prionproteinlevel, die die zellulären Prionproteinlevel vom Wildtyp zeigen.Mäuse, die mit LSPCs behandelt wurden, wiesen zelluläre Prionproteinspiegel auf, die nahe an denen eines Prionproteinknockout-Maus lagen. In drei Experimenten zeigten Mäuse, die mit LSPCs behandelt wurden, signifikante Abnahmen der zellulären Prionproteinspiegel im Vergleich zu PBS- und Typkontrollen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Liposomen mehrere Monate im Kühlschrank aufbewahrt werden können, die vollständigen LSPCs jedoch innerhalb von 24 Stunden nach der Herstellung verwendet werden müssen.Nach ihrer Entwicklung werden die Erzeugung von LSPCs oder Paletten den Forschern den Weg ebnen, um weitere therapeutische Optionen im Bereich der neurodegenerativen Erkrankungen zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Wirkstoffverkapselung erhöht die Spezifität der Tumorzellen und reduziert die Neurotoxizität.

Konvektionsverstärkte Abgabe von Polyethylenglykol-beschichteten geladenen Liposomen in einen Hirntumor bei Ratten

Quelle: Ullah, I., et.al. Ein Positionierungsgerät für die Platzierung von Mäusen während der intranasalen siRNA-Abgabe an das zentrale Nervensystem. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt eine präzise intranasale Verabreichungstechnik zur Verabreichung von Neuronen-targeting-Peptid-siRNA-Komplexen an das Gehirn von Mäusen unter Verwendung eines speziellen Positionierungsgeräts. Anästhesierte Mäuse werden in einer Kopf-und-Vorwärts-Position fixiert, um die siRNA-Inhalation zu optimieren und...

Intranasale Verabreichung von siRNA an das Gehirn von Mäusen mit Hilfe eines Positionierungsgeräts

Quelle: Bender, H. R., et.al. Verabreichung von therapeutischer siRNA an das ZNS unter Verwendung von kationischen und anionischen Liposomen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die gezielte Verabreichung von Prionprotein (PrP) siRNA an Neuronen unter Verwendung von liposomalen siRNA-Peptid-Komplexen (LSPCs). Kationische Liposomen binden elektrostatisch PrP-zielende siRNA, die durch das RVG-9r-Peptid für den Rezeptor-vermittelten Transport durch die Blut-Hirn-Schranke weiter stabilisiert wird.

Gezielte siRNA-Verabreichung an Neuronen für das Silencing von Prionenproteinen mit liposomalen Komplexen

Wiederholte retroorbitalen Injektionen kationische liposomes/siRNA/ITSN-1s Komplexe in Mäusen, alle 72 Stunden für 24 Tage, effizient die siRNA-Duplex zum Mauslunge Mikrovaskulatur Reduzierung ITSN-1s mRNA und Protein-Expression von 75%. Diese Technik ist in hohem Maße reproduzierbar in einem Tiermodell, hat keine Nebenwirkungen und Todesfälle verhindert.

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Wir beschreiben ein Verfahren, um Medikamente mit dem zentralen Nervensystem Ziel entweder durch Einsetzen eines Katheters oder Durchführen einer Bolus-Injektion in die rechte laterale Ventrikel in Mäusen. Wir konzentrieren uns speziell auf den Transport von Antisense-Oligonukleotiden. Diese Technik ist leicht an andere Medikamente und Ratten.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Lieferung bleibt die größte Herausforderung für die therapeutische Anwendung der small interfering RNA (siRNA). Dieses Protokoll schließt die Verwendung eines multifunktionellen und biokompatibel siRNA Abgabeplattform, bestehend aus Arginin und Polyethylenimin gepfropft porösen Siliciummikropartikel.

Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Generation der kationischen Nanoliposomes, basiert auf der Methode der trocken-Film und eignet sich für die sichere und effiziente Bereitstellung von in-vitro- Boten-RNA transkribiert.

Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA

Hier stellen wir ein Protokoll mit einem Maus-Positionierungsgerät vor, das die angemessene Platzierung von Mäusen für die intranasale Verabreichung einer hirngezielten Peptid-SiRNA-Formulierung ermöglicht, die eine effektive Gen-Silencing im zentralen Nervensystem ermöglicht.

Ein Positionierungsgerät für die Platzierung von Mäusen während der intranasalen siRNA-Lieferung an das Zentrale Nervensystem

Es werden Methoden zur Vorbereitung und Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der Bioaktivität von neutral aufgeladenen, pH-responsiven siRNA-Nanopartikeln vorgestellt. Es werden Kriterien für erfolgreiche siRNA-Nanomedizine wie Größe, Morphologie, Oberflächenaufladung, siRNA-Ladung und Gen-Schweigung diskutiert.

Vorbereitung von Neutral-aufgeladenen, pH-responsiven polymischen Nanopartikeln für zytosolische siRNA Delivery

Hier beschreiben wir eine Methode zur Abgabe von Medikamenten an das zentrale Nervensystem der Ratte, indem wir einen Katheter in den lendenintrathekalen Raum der Wirbelsäule implantieren. Wir konzentrieren uns auf die Lieferung von Antisense-Oligonukleotiden, obwohl diese Methode auch für die Lieferung anderer therapeutischer Modalitäten geeignet ist.

Intrathekale Lieferung von Antisense Oligonukleotiden im Zentralen Nervensystem der Ratte

Erfahren Sie, wie therapeutische siRNA mit kationischen und anionischen Liposomen über die Blut-Hirn-Schranke ins ZNS gelangt. Diese Methode minimiert neuronale Schäden und ermöglicht gezielte Behandlungen neurodegenerativer Erkrankungen.

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

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