Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Verabreichungssystem zu entwickeln, das niedermolekulare Medikamente wie siRNA an das Gehirn abgeben kann. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Neurodegeneration beantworten, wie z.B. Ist siRNA eine praktikable therapeutische Option für Proteinfehlfaltungskrankheiten? und Können wir ein zuverlässiges System zur Verabreichung von Medikamenten an das Gehirn entwickeln?

Der Hauptvorteil der Entwicklung eines liposomalen Wirkstoffverabreichungssystems besteht darin, dass wir unsere siRNA intravenös oder über den Blutkreislauf abgeben können und nicht direkt durch neuronales Gewebe, was zu neuronalen Schäden führt. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapeutik und Diagnostik neurodegenerativer Erkrankungen, da diese Technik eine spezifische Verabreichung über die Blut-Hirn-Schranke ermöglicht, insbesondere an Acetylcholin-exprimierende Neuronen. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die Injektion von Mäuseschwanzvenen aufgrund der geringen Größe der Mausschwanzvene schwer zu erlernen ist.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Eins-zu-Eins-Verhältnisses von DOTAP zu Cholesterin. Für ein fremdes tierisches Liposomenpräparat mischen Sie zwei Nanomol DOTAP und zwei Nanomol Cholesterin in zehn Milliliter einer Eins-zu-Eins-Chloroform-Methanol-Lösung. Verdampfen Sie dann neun Milliliter der Chloroform- und Methanollösung mit Stickstoffgas.

Verdampfen Sie den letzten Milliliter Lösungsmittel in einem Abzug über Nacht ohne Gas. Am nächsten Tag sollte ein dünner Lipidfilm auf dem Boden des Kolbens sichtbar sein. Sowohl dieser Kolben mit dem Lipidfilm als auch zehn Milliliter einer zehnprozentigen Saccharoselösung werden auf 55 Grad Celsius erhitzt.

Pipettieren Sie dann die erhitzte Saccharoselösung langsam auf den dünnen Lipidfilm, während Sie den Kolben vorsichtig schwenken. Montieren Sie anschließend einen Extruder mit Ein-Mikron-Filtern gemäß den Anweisungen des Herstellers. Geben Sie dann einen Milliliter der erhitzten Liposomensuspension in eine der Spritzen am Extruder.

Führen Sie dann die Suspension 11 Mal zwischen den beiden Spritzen hin- und her. Während Sie die Liposomensuspension zur leichteren Größenbestimmung erhitzt halten, dimensionieren Sie die Liposomen durch 45 Mikrometer und einen 2-Mikron-Filter. Um große, unilamellare Vesikel zu erzeugen, fügen Sie als nächstes 20 Mikroliter der vier Nanomol-Liposomensuspension zu 200 Mikrolitern einer 20 Mikromolaren siRNA-Stammlösung hinzu und inkubieren Sie zehn Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 80 Mikroliter eines 500 Mikromolaren Bestands des RVG-9R-Targeting-Peptids in die siRNA-Liposomenlösung und inkubieren Sie zehn Minuten lang bei Raumtemperatur.

Bereiten Sie eine fremde tierische Lipsomo-Suspension vor, indem Sie 2,2 Nanomol DSPE oder DOTAP in zehn Milliliter einer Zwei-zu-Eins-Chloroform-Methanol-Lösung mit 1,6 Nanomol Cholesterin und 2 Nanomol DSPE-Peg mischen. Anschließend wird Stickstoffgas zugegeben, und wenn der größte Teil des Lösungsmittels verdampft ist, den Kolben über Nacht im Abzug belassen. Geben Sie dann langsam zehn Milliliter 1X PBS auf 75 Grad Celsius erhitzte Menge an dünnen Lipidfilmen.

Lassen Sie die Lipide mindestens eine Stunde lang bei 75 Grad Celsius rehydrieren, bevor Sie die Dimensionierung vornehmen. Nachdem Sie die Liposomensuspension wie zuvor mit einem Extruder dimensioniert haben, pipettieren Sie 20 Mikroliter jeder der vier Nanomol-Liposomensuspensionen in Einweg-Aliquote und lyophilisieren Sie 30 Minuten lang mit einem Tischgefriertrockner. Als nächstes fügen Sie 1,4 Mikroliter einer 26,6 mikromolaren Lösung von Protaminsulfat zu 200 Mikrolitern 20 mikromolare siRNA-Stammlösung hinzu und inkubieren zehn Minuten lang bei Raumtemperatur, um die siRNA zu kondensieren.

Nach der Inkubation rehydrieren Sie DSPE-Palets mit 201,4 Mikrolitern siRNA-Protaminlösung. Rehydrieren Sie die DOTAP-Paletten mit 200 Mikrolitern einer fremden tierischen Stammlösung von siRNA. Inkubieren Sie jede Liposomen-siRNA-Lösung zehn Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie als Nächstes zehn Mikroliter einer 60 millimolaren EDC-Lösung in jedes Röhrchen mit rehydrierten Liposomen. Fügen Sie dann zehn Mikroliter 150 millimolare Sulfo-NHS-Lösung zur Liposomen-siRNA-Lösung für DOTAP- und DSPE-Paletten hinzu. Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.

Zum Schluss werden 80 Mikroliter 500 Mikromol RVG-9R-Peptid in die siRNA-Liposomen-Vernetzungslösung gegeben und zehn Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Betäubung einer Maus mit zwei bis drei Prozent Isofluran in Sauerstoff bedecken Sie die Augen der Maus mit apthalmischer Salbe und bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie eine Zehenkneifung durchführen. Fahren Sie nur fort, wenn keine Reaktion vorliegt.

Platzieren Sie die Maus während der Narkose auf dem Rücken oder auf der Seite, um Zugang zur Schwanzvene zu erhalten. Wischen Sie den Schwanz mit 70 Prozent Ethanol ab und injizieren Sie dann mit einer 26-Gauge-Insulinspritze 300 Mikroliter LSPCs oder Palets in die Schwanzvene. Beginnen Sie mit der disalen Injektion und bewegen Sie sich proximal, wenn die Vene kollabiert oder reißt.

Setzen Sie die Maus in einen sauberen Käfig, bis sie die Brustbeinlage beibehält. Überwachen Sie das Tier nach der Injektion mehrere Stunden lang, um sicherzustellen, dass die Anästhesie nachlässt und keine negativen Auswirkungen der Behandlung auftreten. Nachdem Sie die LSPCs oder Palets mindestens 24 Stunden lang zirkulieren ließen und dann die Maus einschläferten, sezieren Sie eine halbe Hemisphäre des Gehirns.

Geben Sie dann die halbe Halbkugel und 2,5 Milliliter Faxpuffer auf ein 40-Mikron-Netzzellensieb und drücken Sie das Gewebe mit dem Kolben einer Spritze durch den Filter in eine Petrischale. Spülen Sie das Zellsieb und die Petrischale mit zusätzlichen 2,5 Millilitern Faxpuffer aus. Dann die einzellige Suspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen und auf Eis legen.

Als nächstes pipettieren Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in das Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 350 mal G. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Faxpuffer und zentrifugieren Sie erneut. Fügen Sie dann einen weiteren Milliliter Faxpuffer hinzu und legen Sie die Zellsuspension auf Eis. Inkubieren Sie nun die Zellen in 100 Mikrolitern Ratten-Anti-Maus-Fc-Block in Faxpuffer für 30 bis 60 Minuten auf Eis.

Nach dem Pelletieren und Waschen wie zuvor 100 Mikroliter fluoreszierende primäre Antikörperlösung hinzufügen und 30 bis 60 Minuten auf Eis legen. Nach einer abschließenden Wäsche resuspendieren Sie die Zellen eine Minute lang in einem Milliliter RVC-Lysepuffer. Pelletieren Sie dann die Zellen.

Nachdem Sie den Puffer verworfen haben, halten Sie ihn in einem Milliliter Faxpuffer wieder auf und legen Sie ihn auf Eis. Die Zellen sind nun bereit für die Faxanalyse. Mäuse, die mit siRNA behandelt wurden, die über LSPCs verabreicht wurde, zeigten eine signifikante Abnahme der zellulären Prionenproteinspiegel im Vergleich zu einer PBS-Kontrolle, die die zellulären Prionenproteinspiegel des Typs zeigt.

Die mit LSPCs behandelten Mäuse zeigten zelluläre Prionenproteinwerte, die denen einer Prionenprotein-Knock-out-Maus nahe kamen. In drei Experimenten zeigten Mäuse, die mit LSPCs behandelt wurden, eine signifikante Abnahme der zellulären Prionenproteinspiegel im Vergleich zu PBS während der Typenkontrollen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass die Liposomen mehrere Monate im Kühlschrank gelagert werden können, aber die vollständigen LSPCs innerhalb von 24 Stunden nach dem Zusammenbau verwendet werden müssen.

Nach seiner Entwicklung wird die Generierung von LSPCs oder Palets den Weg für Forscher ebnen, mehr therapeutische Optionen auf dem Gebiet der neurodegenerativen Erkrankungen zu erforschen.