Name: Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung kationischer Nanoliposome nach der Dry-Film-Methode für die effiziente mRNA-Transfektion. Diese Technik ermöglicht schnelle Produktion stabiler Vesikel mit definierter Größe und schützt die gekapselte mRNA vor Degradation.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Generation der kationischen Nanoliposomes (Abbildung 1)
<ol><li>Lösen Sie die Lipide DC-Cholesterin (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-Carbamoylproxyl] Cholesterin Hydrochlorid) und Schmiere (Dioleoyl Phosphatidylethanolamine), geliefert als Pulver, in Chloroform, eine Endkonzentration von 25 mg/mL zu erreichen. Hinweis: Bewahren Sie die gelösten Lipide bei-20 ° C.</li>
	<li>Arbeiten Sie mit 25 mg/mL Stammlösung sowohl Lipide. Mix-40 µL der gelösten DC-Cholesterin und 80 µL die gelösten Schmiere in einem Glaskolben. Hinweis: Das gesamte Lipid beträgt 3 mg. Um schnelle Verdunstung der Chloroform zu vermeiden, legen Sie die Lipide auf Eis beim Pipettieren.</li>
	<li>Chloroform für 15 min unter einem Argon-Gasstrom zu verdampfen. Anschließend füllen Sie ein Exsikkator mit Kieselgel, legen Sie die offene Glaskolben innen und wenden Sie ein Vakuum über Nacht an, um sicherzustellen, dass die verbleibenden Chloroform verdampft wird und ein Lipid-Film innerhalb der Glaskolben entsteht. Hinweis: Arbeiten Sie schnell und vermeiden Sie unnötigen O2 Kontakt.</li>
	<li>Rehydrieren Sie die gebildeten Lipid-Film mit 1 mL Nuklease-freies Wasser und Wirbel die Suspension für 15 min (Abbildung 2A). Danach legen Sie die Aussetzung in ein Ultraschall-Bad für 1 h (Abb. 2 b). Hinweis: Das Fahrwerk wird leicht bewölkt sein.</li>
	<li>Montieren Sie den Mini-Extruder gemäß den Anweisungen des Herstellers, füllen Sie eine Spritze mit der Lipid-Aufhängung und legen Sie die Fertigspritze und eine leere Spritze auf beiden Seiten des Extruders. Drücken Sie die Lipid-Federung durch die Membran aus einer Spritze auf die andere, 20 x-25 X zu extrudieren Sie die Suspension (Abbildung 2). Hinweis: Die Größe des NLps richtet sich nach der Porengröße der Membran verwendet.</li>
	<li>Speichern Sie die NLps in einem Glaskolben bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung. Hinweis: Nach längerer Lagerzeit sollte die NLps in der Beschallung Badewanne wieder für 15 min von 35 kHz, Komplexbildung zu umgehen platziert werden.</li>
</ol>2. in-vitro- Transkription von synthetischen mRNA
<ol><li>Bereiten Sie die eGFP-Codierung mRNA nach dem Protokoll veröffentlicht früheren34.</li>
	<li>Verstärken die eGFP-Sequenz aus dem Plasmid mit 0,7 µM der vorn (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') und rückwärts (5'-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3 ") Primer und die Polymerase kit mit PCR.<ol>
<li>Mischen Sie 20 µL einer kommerziellen Pufferlösung wechselndes das Schmelzverhalten von DNA (Table of Materials), sowie 20 µL des 5 X-Mix aus dem Polymerase-Kit. Fügen Sie 7 µL jedes Primers (vorwärts und rückwärts).</li>
		<li>Fügen Sie 25 ng des Plasmids eGFP, die Mischung und 2 µL der Polymerase von der Polymerase-Kit. Hinweis: Halten Sie die Polymerase auf dem Eis vor zur Lösung pipettieren.</li>
		<li>Fügen Sie Nuklease-freie H2O, die Mischung bis zu einem Volumen von 100 µL.</li>
		<li>Führen Sie die PCR-Zyklen in den Thermocycler nach dem Protokoll in Tabelle 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinigen Sie die eGFP-Kodierung DNA-Sequenz mit dem PCR-Reinigung-Kit.<ol>
<li>Deshalb mischen Sie die PCR-Lösung mit 500 µL Bindung Puffer aus dem Kit und Reinigung Spalten füllen verwenden.</li>
		<li>Die Spalten mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min Zentrifugieren und das Filtrat verwerfen.</li>
		<li>Fügen Sie 750 µL Waschpuffer ich auf die Spalte, Zentrifuge wieder auf die maximale Geschwindigkeit für 1 min, und das Filtrat verwerfen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Zentrifuge Schritt 1 X um den Puffer aus der Spaltenfilter zu entfernen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Spalte auf ein frisch 1,5-mL-Tube.</li>
		<li>Fügen Sie 20 µL Nuklease-freie H2O auf die Spalte, inkubieren 1 min und Zentrifuge für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit. Wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
		<li>Messen Sie die Konzentration der DNA mit einem Photometer und speichern Sie es bei-20 ° C.</li>
		<li>Analysen der DNA-Qualität mit Gelelektrophorese. 0,5 g Agarose in Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer und erwärmen Sie es in der Mikrowelle auf hoher Hitze, bis die Agarose komplett aufgelöst ist.</li>
		<li>Die flüssige Agarose 5 µL Gel-Färbelösung hinzu, füllen Sie die Lösung in die Gel-Kammer, und warten Sie, bis das Gel polymerisiert wird.</li>
		<li>Mix 200 ng DNA mit 2 µL 6 x laden Farbstoff und füllen Sie es bis zu einem Ende Volumen von 12 µL Pipette ein DNA-Leiter sowie die DNA-Probe in die Gel-Brunnen und laufen die Elektrophorese für 1 h bei 100 V.</li>
		<li>Analysieren Sie das Gel mit einem Gel-Analyse Station unter UV-Licht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die in-vitro- Transkription um mRNA aus der DNA-Sequenz mit einem in-vitro- Transkription-Kit mit T7-Polymerase zu generieren und ersetzen Sie NUK UTP und CTP mit Ψ-UTP und Methyl-CTP zu.<ol>
<li>Mischen Sie für die in-vitro- Transkription die Zutaten nach Tabelle 2. Hinweis: Ersetzen Sie 1,5 µL Methyl-CTP mit 01:10 Cy3-CTP verdünnt in Nuklease-freie H2O während der in-vitro- Transkription von eGFP mRNA Cy3-Kennzeichnung der mRNA zu erreichen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die IVT-Reaktion-Mischung für 4 h bei 37 ° c</li>
		<li>Fügen Sie 1 µL der DNase I von die T7-Polymerase kit und inkubieren 15 min von 37 ° C, das DNA-Template zu verdauen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die mRNA zu reinigen, verwenden Sie das RNA-Aufräumarbeiten-Kit.<ol>
<li>Füllen Sie die IVT-Mischung, um das Volumen von 100 µL mit Nuklease-freie H2O.</li>
		<li>Fügen Sie 350 µL der Lyse Puffer und Mix durch Pipettieren rauf und runter.</li>
		<li>Fügen Sie 250 µL 100 % Ethanol und nochmals mixen. Die Mischung in die Bereinigung Spalten Pipette.</li>
		<li>Zentrifuge für 15 s bei 8.000 x g und entsorgen das Filtrat.</li>
		<li>Fügen Sie 500 µL des Puffers waschen in einer Spalte, Zentrifuge wieder für 15 s bei 8.000 x g, und entfernen Sie das Filtrat.</li>
		<li>Waschen Sie die Spalte 1 X mit 500 µL Waschpuffer und Zentrifuge für 2 min bei 8.000 X g.</li>
		<li>Verschieben Sie die Spalte in eine frische 1,5 mL Reaktionsgefäß. Eluieren mRNA 2 X von einer 1-min Inkubation von 20 µL der Nuklease-freie H2O auf der Spalte Membran, gefolgt von einer 1-min Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie die Phosphatgruppen aus der mRNA mit einem Dephosphorylation-Kit. Die mRNA 4,5 µL 10 X Phosphatase Puffer und 1 µL Phosphatase hinzufügen und 1 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Reinigen Sie die mRNA wiederum folgende Schritte 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	<li>Gemessen Sie die mRNA Konzertierung mit einem Photometer.</li>
	<li>Verwenden Sie Gelelektrophorese, um die Reinheit und die Größe der mRNA zu analysieren. Daher bereiten Sie eine Agarosegel wie 2.3.9 - 2.3.10 beschrieben.<ol>
<li>Mix-3.3 µL Formamid, 1 µL 37 % Formaldehyd, 1 µL 10 x Männer und 1,7 µL 6 x laden Farbstoff mit 200 ng der mRNA und füllen Sie ihn bis zu 10 µL mit Nuklease-freie H2O für jede Probe und RNA-Marker.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Mischung für 10 min bei 65 ° C für mRNA Denaturierung. Laden Sie die Brunnen des Gels mit der mRNA und RNA-Marker und führen Sie das Gel für 1 h bei 100 V.</li>
		<li>Analysieren Sie das Gel mit einem Gel Doc Station mit UV-Licht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Komplexierung von synthetischen mRNA
<ol><li>Tauen Sie die synthetischen mRNA auf Eis, Strudel, und Zentrifuge kurz vor dem Öffnen der Tube.</li>
	<li>Mischung 10 µL des synthetischen mRNA (mRNA-Konzentration ist 100 ng/µL) mit 1 µL, 2,5 µL, 5 µL, 10 µL oder 20 µL der NLp-Suspension (NLp-Konzentration beträgt 3 mg/mL). Zentrifugieren Sie kurz und inkubieren Sie für 20 min bei Raumtemperatur (RT) für Nanolipoplex Bildung. Hinweis: Verwechseln Sie nicht durch pipettieren. Dies kann zum Verlust des Bandes führen. Vortex kurz für eine gute Durchmischung.</li>
	<li>Die Nanolipoplexes 1 mL normale Zelle Medium hinzu und mischen Sie sie von oben und unten pipettieren.</li>
</ol>4. Analyse der Kapselung Effizienz der Nanoliposomes
<ol><li>Um die Kapselung Experimente durchzuführen, verwenden Sie das RNA Quantifizierung Kit.</li>
	<li>Bereiten Sie die Arbeitslösung durch Verdünnung der Fluoreszenzfarbstoff 1: 200 für Hochton- und 1:2,000 für einen Low-Range-Assay. Hinweis: Tauen Sie Fluoreszenzfarbstoff auf Eis auf. Bereiten Sie die Arbeitslösung direkt vor dem Gebrauch.</li>
	<li>Bereiten Sie die Hochton- und Low-Range Standardkurven mit 1 mL einer 2 µg/mL Stammlösung von eGFP mRNA in Nuklease-freie H2O. Hinweis: Verwenden Sie für die standard Kurven die mRNA, die in die Kapselung Experimente verwendet werden.</li>
	<li>Tabelle 3 für die Vorbereitung der Hochton-Standard (20 ng/mL - 1 µg/mL) verwenden.</li>
	<li>Verdünnen Sie für den Low-Range-Standard die 2 µg/mL eGFP mRNA-Stammlösung 01:20 um eine Endkonzentration von 100 ng/mL zu erreichen. Bereiten Sie einen Low-Range-Standard (1 ng/mL - 50 ng/mL), wie in Tabelle 4beschrieben.</li>
	<li>Kombinieren Sie 1 µg eGFP mRNA (10 µL) und 7,5 µg des NLps (2,5 µL) und 20 min bei RT inkubieren Hinweis: Halten Sie die mRNA auf Eis um Verschlechterung zu vermeiden.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der Nuklease-freie H2O Form Nanolipoplexes und Mix von Pipettieren rauf und runter.</li>
	<li>Die gekapselte Proben und Standards 1 mL 1: 200 oder 1:2,000 RNA Fluoreszenzfarbstoff Arbeitslösung hinzufügen und 5 min bei RT im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Pipette die Standards und Proben in Duplikate in einem schwarzen 96-Well-Platte und messen die Fluoreszenz bei 530 nm auf einer Mikrotestplatte Reader (Abbildung 3).</li>
</ol>5. Vorbereitung der Zellen zur Transfektion
<ol><li>Platte 1,5 x 105 A549 Zellen/gut von einem 12-Well-Platte 1 d vor Transfektion.</li>
	<li>24 h vor Transfektion der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 in regelmäßige Zelle Medium (DMEM/hohe Glukose mit 10 % fötalen Rinderserum [FBS], 2 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin) inkubieren.</li>
</ol>6. die Transfektion von Zellen
<ol><li>Waschen Sie die vorbereiteten Zellen 1 X mit 1 mL/PBS (ohne Ca2 + /Mg2 +).</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der vorbereiteten Nanolipoplex Mischung, mit 1 µg eGFP mRNA in 1 µL, 2.5 µL, 5 µL, 10 µL oder 20 µL NLps, eine gut vorbereitete Platte mit A549 Zellen gekapselt.</li>
	<li>Hinzufügen der Nanolipoplex Aussetzung zu den Zellen und inkubieren Sie bei normalen Bedingungen 24 Stunden Transfektion Wirksamkeit zu analysieren oder für 24 h und 72 h nach Transfektion der Zellviabilität analysieren. Hinweis: Transfektion mit NLps erfordert keine mittlere Änderung.</li>
</ol>7. Analyse der Zelle Transfection Wirksamkeit mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenz-Mikroskopie
<ol><li>Den Überstand zu entfernen und waschen Sie die Zellen mit 1 mL/gut PBS (ohne Ca2 +/Mg2 +), um die restlichen NLps zu entfernen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Zellen für die Durchflusszytometrie.<ol>
<li>Trypsinize der Zellen mit 500 µL/Well Trypsin/EDTA (0,05 %) bei 37 ° C für 3 min. Stop den Prozess und die Trypsin zu inaktivieren, indem man die gleiche Menge regelmäßige FBS-haltigen Medium (500 µL/Well).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 400 X g und entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne Berührung der Zelle Pellet.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit 1 mL PBS (ohne Ca2 + /Mg2 +).</li>
		<li>Aufschwemmen der Zellen in 300 µL 1 X Fixierung Lösung und übernehmen die Zellen in Flow Cytometry Röhren.</li>
		<li>Analysieren Sie die Zellen bei 488 nm in einem Durchflusszytometer (Abb. 4A). Hinweis: Vortex Zellen 1 x direkt vor der Messung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie.<ol>
<li>Befestigen Sie die Zellen mit 1 mL/gut 100 % Methanol, die zuvor bei-20 ° c gelagert wurde</li>
		<li>Hinzufügen von 500 µL/Well 300 nM DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole) aufgelöst in PBS (ohne Ca2 +/Mg2 +) und 5 Minuten im Dunkeln inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen wieder mit 100 % Methanol bei-20 ° c gelagert</li>
		<li>Analysieren Sie die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop (Abb. 4 b). Hinweis: Verwenden Sie die folgende Anregung/Emission Wellenlängen: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm und Cy3 550/570 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(8) Zelle Lebensfähigkeit Assay
<ol><li>5 mg MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid) in 1 mL RPMI (ohne Phenol rot) auflösen. Hinweis: Die gelösten MTT muss weiter verwässerte 01:10 (Endkonzentration: 0,5 mg/mL) in RPMI vor Gebrauch.</li>
	<li>Waschen Sie die transfizierten Zellen 3 X mit 1 mL/PBS (ohne Ca2 +/Mg2). Hinweis: Die Überreste des Mediums regelmäßige Zelle sollte vollständig entfernt werden.</li>
	<li>Hinzufügen von 500 µL/Well von 01:10 verdünnt MTT-Lösung für die Zellen und 4 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Entfernen Sie die MTT-Lösung aus den Zellen nach Inkubation und fügen Sie 500 µL/Well DMSO (Dimethyl Sulfoxid hinzu). Erneut für 10 min bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Pipette die DMSO-Lösung in Triolen in eine 96-Well Clear-Bodenplatte und messen die Adsorption bei 540 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.</li>
	<li>Die Lebensfähigkeit der unbehandelte Zelle auf 100 % gesetzt und berechnen die Zellviabilität der anderen Fraktionen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen (Abbildung 5).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die vorgestellte Protokoll beschreibt die Generation des NLps mit hohen Kapselung Wirksamkeit für synthetisch veränderte mRNA, sowie die zuverlässige Transfektion von Zellen in Vitro. Darüber hinaus garantieren die NLps die Freisetzung von mRNA, die wiederum in ein funktionsfähiges Protein in der Zelle übersetzt ist. Zusätzlich die Transfektionen mit NLps in regelmäßige Zelle Medium durchgeführt werden kann, was zu hohen Zelle künstliche während Transfektion, und dauern bis zu drei Tage nach Transfektion.
<p...

Die Verwendung von modifizierten mRNA für therapeutische Anwendungen hat großes Potenzial in den letzten Jahren gezeigt. In Herz-Kreislauf-, Entzündungs- und monogenetischen Krankheiten, sowie bei der Entwicklung von Impfstoffen ist mRNA eine vielversprechende therapeutische Mittel1.
Protein-Ersatz-Therapie mit mRNA bietet mehrere Vorteile gegenüber der klassischen Gentherapie, die auf DNA-Transfektion in die Ziel-Zellen2basiert. Die mRNA-Funktion startet direkt in das Zytosol. Obwohl das Plasmid DNA (pDNA), ein Konstrukt der doppelsträngigen, Rundschreiben kann DNA mit einem Promotor-Region und die Sequenz eines Gens, die Codierung der therapeutische Protein3, auch Handlungen im Zytosol, es nur in Zellen aufzunehmen die Mitose durchlaufen zum Zeitpunkt der Transfektion. Dies reduziert die Anzahl von transfizierten Zellen im Gewebe1,4. Insbesondere ist die Transfektion von Geweben mit schwachen Mitose Aktivität, z. B. Herzzellen, schwieriges5. Im Gegensatz zu pDNA treten die Transfektion und Übersetzung von mRNA in mitotischen und nicht mitotischen Zellen im Gewebe1,6. Die virale Integration von DNA in das Wirtsgenom kann mit mutagenen Effekte oder Immunreaktionen7,8, aber nach der Transfektion von Zellen mit einer Protein-Codierung mRNA, die de-Novo -Synthese des gewünschten Proteins kommen. startet autonom9,10. Darüber hinaus kann die Proteinsynthese genau auf den Patienten müssen durch Einzeldosen, ohne zu stören das Genom und riskieren mutagenen Effekte11eingestellt werden. Das Immunsystem aktivierende Potential der synthetisch erzeugten mRNA konnte drastisch gesenkt werden, mithilfe von Pseudo-Uridin und 5'-Methylcytidine anstelle von Uridin und Cytidin12. Pseudo-Uridin modifizierte mRNA auch gezeigt hat, haben eine erhöhte biologische Stabilität und eine deutlich höhere translationale Kapazität13.
Um die vielversprechenden Eigenschaften der mRNA-basierte Therapie in der klinischen Anwendung profitieren zu können, ist es wichtig, ein geeignetes Fahrzeug für den Transport von mRNA in die Zelle zu schaffen. Dieses Fahrzeug sollte nicht toxischen Eigenschaften in Vitro und in Vivozu tragen, schützen die mRNA gegen Nuklease-Abbau und bieten ausreichend zelluläre Aufnahme für eine längere Verfügbarkeit und Übersetzung der mRNA14.
Zwischen allen möglichen Träger für in Vivo Drug-Delivery, wie Kohlenstoff-Nanoröhren, Quantenpunkte und Liposomen, letztere wurden studierte am meisten15,16. Liposomen sind Vesikel bestehend aus einer Lipid Bilayer10. Sie sind amphiphil mit einer hydrophoben und einen hydrophilen Teil, und durch die selbständige Anordnung dieser Moleküle ist eine kugelförmige Doppelschicht gebildeten17. Im Inneren der Liposomen können Therapeutika oder Drogen gekapselt und somit geschützt von enzymatischen Abbau18. Mit N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium-Chlorid (DOTMA)19, Liposomen [1,2-Bis (Oleoyloxy)-3-Propan (Trimethylammonio)] (DOTAP)20und Dioctadecylamidoglycylspermine (Hunde)21, oder DC-Cholesterin22, gut charakterisiert sind und häufig für zelluläre Transfektion mit DNA oder RNA.
Kationische Liposomen umfassen eine positiv geladene Lipid und einer ungeladenen Phospholipid-23. Transfektion durch kationische Liposomen gehört zu den am häufigsten verwendeten Methoden für den Transport von Nukleinsäuren in Zellen24,25. Die kationischen Lipid-Partikel bilden komplexe mit den negativ geladenen Phosphatgruppen in das Rückgrat der Nukleinsäure-Moleküle26. Diese sogenannten Lipoplexes befestigen Sie an der Oberfläche der Zellmembran und geben Sie die Zelle durch Endozytose oder Endozytose ähnliche Mechanismen27.
Im Jahr 1989 Malone Et Al. erfolgreich beschrieben kationischen Lipid-mediated mRNA Transfektion28. Jedoch fand mit einer Mischung von DOTMA und 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (Schmiere), die Gruppe, dass DOTMA zytotoxische Effekte28manifestiert. Zohra Et Al. zeigten darüber hinaus, dass DOTAP (1,2-Dioleoyloxy-3-Trimethylammonium-Propan-Chlorid) als ein mRNA Transfektion Reagenz29genutzt werden kann. Allerdings sollte für die effiziente Transfektion von Zellen, DOTAP in Kombination mit anderen Reagenzien, wie Fibronektin29 oder Schmiere30verwendet werden. Bisher wurde DOTMA die erste kationische Lipid auf dem Markt für die gen-Lieferung-31verwendet. Andere Fette dienen als therapeutische Träger oder in verschiedenen Phasen der klinischen Studien getestet (z. B. EndoTAG-I, mit DOTAP als Lipid-Carrier), wird derzeit in einer Phase-II-klinische Studie32untersucht.
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Generation des NLps mit DC-Cholesterin und Schmiere. Diese Methode ist einfach durchzuführen und ermöglicht die Erzeugung von NLps in verschiedenen Größen. Das allgemeine Ziel der NLp-Generation mit der trocken-Film-Methode ist die Schaffung von Liposomen für mRNA Komplexierung, wodurch effizient und biokompatible Zelle Transfektion in-vitro-14,33.

<table><tbody><tr><td>(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)</td><td>AppliChem, Darmstadt, Deutschland</td><td>A2231</td><td></td></tr><tr><td>(3&beta;-[N-(N&prime;,N&prime;-dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterinhydrochlorid (DC-Cholesterin)</td><td>Avanti, Alabama, USA</td><td>700001</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; &prime;,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>BD FACScan System</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Fix (10x)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland</td><td>340181</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>20385.02</td><td></td></tr><tr><td>Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE)</td><td>Avanti, Alabama, USA</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss Axio, Oberkochen, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extruder</td><td>Avanti, Alabama, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>PBS-Puffer (ohne Ca2+/Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Ribo Green RNA Reagenzienkit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (ohne Phenolrot)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland</td><td>11835030</td><td></td></tr><tr><td>Kieselgel</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>P077</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA (0,05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>28104<</td><td></td></tr><tr><td>br/> Pseudouridin-5'-triphosphat (&psi;-UTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>5-Methylcytidin-5'-triphosphat (Methyl-CTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, USA</td><td>N-1014</td><td></td></tr><tr><td>Cyanin 3-CTP</td><td>PerkinElmer, Baesweiler, Deutschland</td><td></td><td></td>NEL580001EA</tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transkriptionskit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')pp(5')G RNA Cap Structure Analog</td><td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>Antarktische Phosphatase</td><td>Neu England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Deutschland</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium, Fremont, USA</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>peqGOLD DNA-Leitermischung</td><td>VWR, Pennsylvania, USA</td><td>25-2040</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen 0,5-10kb RNA-Leiter</td><td>Fisher Scientific, G&ouml; Teborg, Schweden</td><td>11528766</td><td></td></tr></tbody></table>

generation von kationischen nanoliposomes für die effiziente bereitstellung von in-vitro- transkribiert boten-rna

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Die Entwicklung der Boten-RNA (mRNA)-basierten Therapeutika für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten mehr und mehr an Bedeutung aufgrund der positiven wird Eigenschaften von in Vitro (IVT) mRNA transkribiert. Mit Hilfe von IVT mRNA kann die de-Novo -Synthese des gewünschten Proteins induziert werden, ohne den physiologischen Zustand der Zielzelle. Darüber hinaus kann Protein-Biosynthese durch die vorübergehende Wirkung der IVT mRNA exakt gesteuert werden.
Für die effiziente Transfektion von Zellen kann Nanoliposomes (NLps) eine sichere und effiziente Transportvehikel für therapeutische mRNA darstellen. Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur sicheren und effizienten kationischen NLps bestehend aus DC-Cholesterin und 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (Schmiere) als Lieferung Vektor für IVT mRNA zu generieren. NLps haben eine definierte Größe, eine homogene Verteilung und eine hohe Komplexierung Kapazität und kann mit der trocken-Film-Methode erzeugt werden. Darüber hinaus präsentieren wir unterschiedliche Testsysteme zu analysieren, ihre Komplexierung und Transfektion Ähnlichkeit mit synthetischen verstärkt grünes fluoreszierendes Protein (eGFP) mRNA, sowie ihre Auswirkungen auf die Zellviabilität. Insgesamt bietet der vorgestellte Protokoll einen effektiven und sicheren Zugang für mRNA Komplexierung, die Weiterentwicklung und Verbesserung die Verwaltung des therapeutischen mRNA kann.

Unter Verwendung des Protokolls wie beschrieben, wurden NLps bestehend aus den Lipiden DC-Cholesterin und Schmiere vorbereitet mit der trocken-Film-Methode (Abbildung 1). Während der Vorbereitung zeigt die Nanoliposome Lösung verschiedene Stufen der Trübung (Abbildung 2).
Die Kapselung Wirksamkeit des NLps kann dann nach der Kapselung von 1 µg eGFP-Codierung mRNA analys...

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Generation der kationischen Nanoliposomes, basiert auf der Methode der trocken-Film und eignet sich für die sichere und effiziente Bereitstellung von in-vitro- Boten-RNA transkribiert.

Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung sicherer und effizienter Nanoliposomen, die als Transfektionsvehikel für therapeutische Boten-RNA verwendet werden können. Diese Nanoliposomen erleichtern die mRNA-Aufnahme in Zellen, was zu einer erhöhten Proteinexpression führt, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die schnelle und einfache Erzeugung stabiler Nanoliposomen mit definierter Größe und homogener Verteilung.Darüber hinaus schützen sie die gekapselte mRNA vor Abbau und führen zu einer längeren Translation. Demonstriert wird das Verfahren von Antonia Link, einer Doktorandin aus unserem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie Lagerlösungen für die Lipide, DC-Cholesterin und DOPE durch Auflösen jeder in Chloroform auf eine endgültige Konzentration von 25 Milligramm pro Milliliter.40 Mikroliter des gelösten DC-Cholesterins mit 80 Mikrolitern des gelösten DOPE in einem Glaskolben vermischen. Verdampfen Sie das Chloroform unter einem Argongasstrom für 15 Minuten. Als nächstes füllen Sie einen Trockenbau mit Kieselgel.Legen Sie den offenen Glaskolben innen und tragen Sie über Nacht ein Vakuum auf, um sicherzustellen, dass die verbleibende Chloroform verdampft ist. Der resultierende Lipidfilm bildet sich im Inneren des Glaskolbens. Am nächsten Tag einen Milliliter Nuklease-freies Wasser hinzufügen, um den Lipidfilm zu rehydrieren.Und wirbeln Sie die Federung für 15 Minuten. Legen Sie die Suspension für eine Stunde in ein Beschallungsbad. Montieren Sie anschließend den Miniextruder gemäß den Anweisungen des Herstellers.Füllen Sie eine Spritze mit der Flüssigkeitssuspension und legen Sie sie eine Seite des Extruders. Legen Sie eine leere Spritze auf die andere Seite. Drücken Sie die Lipidsuspension durch die Membran von einer Spritze zur anderen, etwa 20-25 Mal, um die Suspension zu extrudieren.Dann lagern Sie die Nanoliposomen in einem Glaskolben bei vier Grad Celsius, bis sie einsatzbereit sind. Zuerst tauen Sie die synthetische mRNA auf Eis auf. Wirbeln Sie die gefrorene mRNA und zentrifugieren Sie sie dann kurz vor dem Öffnen des Rohres.Mischen Sie dann ein Mikrogramm der synthetischen mRNA mit verschiedenen Mengen an Nanoliposomensuspension. Zentrifugieren Sie kurz und inkubieren bei Raumtemperatur für 20 Minuten für Nanolipoplex Bildung. Dann fügen Sie Milliliter reguläres Zellmedium zu den Nanolipoplex es und mischen Durch Pipettieren nach oben und unten.Bereiten Sie die Zellen einen Tag vor der Transfektion vor. Daher Platte 150, 000 A549 Zellen in jeden Brunnen einer 12 WellPlatte einen Tag vor der Transfektion. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und regulärem Zellmedium für 24 Stunden.Dann am nächsten Tag, waschen Sie jeden Brunnen von vorbereiteten Zellen einmal mit einem Milliliter PBS. Fügen Sie einen Milliliter einer vorbereiteten Nanolipoplex-Mischung in einen der Brunnen, die die A549-Zellen enthalten. Inkubieren Sie unter regelmäßigen Bedingungen für 24 Stunden, um die Transfektionseffizienz zu analysieren, oder für 24-72 Stunden, um die Zelllebensfähigkeit nach der Transfektion zu analysieren.Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie jeden Brunnen mit einem Milliliter PBS, um die restlichen Nanoliposomen zu entfernen. Um die Zellen auf die Zytometrie vorzubereiten, fügen Sie zunächst 500 Mikroliter Trypsin EDTA zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren sie bei 37 Grad Celsius für drei Minuten, um die Zellen zu trypsinisieren. Als nächstes fügen Sie 500 Mikroliter reguläres FBS-haltiges Medium hinzu, um den Prozess zu stoppen und das Trypsin zu inaktivieren.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 mal G für fünf Minuten. Und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS.Dann setzen Sie die Zellen in 300 Mikroliter zellfixierungslösung wieder auf und übertragen sie in Durchflusszytometrieröhrchen. Verwenden Sie ein Durchflusszytometer, um die Zellen mit 488 Nanometern zu analysieren. Um die Zellen auf die Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten, fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter gekühltes Methanol hinzu, um die Zellen zu fixieren.Fügen Sie 500 Mikroliter einer 300 Nanomolaren-Lösung von DAPI in PBS gelöst zu jedem Brunnen. Fünf Minuten im Dunkeln bebrüten. Danach entfernen Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen erneut mit 100% Methanol, das zuvor bei minus 20 Grad Celsius gelagert wurde.Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen anhand der hier gezeigten Anregungs- und Emissionswellenlängen zu analysieren. In dieser Studie werden Nanoliposomen mit hoher Verkapselungswirksamkeit für synthetisch modifizierte mRNA erzeugt. Mit Hilfe des RNA-Quantifizierungskits kann die Verkapselungswirksamkeit der Nanoliposomen nach der Verkapselung eines Mikrogramms eGFP-Codierung mRNA analysiert werden, indem die freie Menge an mRNA analysiert wird, die nicht gekapselt ist.Nach der Verkapselung von EGFP mRNA in verschiedenen Mengen von Nanoliposomen können die gebildeten Nanolipoplexe mit Zellen in vitro inkubiert und der Prozentsatz der eGFP-exemitten Zellen mit Durchflusszytometrie 24 Stunden nach der Transfektion analysiert werden. Wie hier zu sehen, reicht sogar nur ein Mikroliter der Nanoliposomenlösung aus, um eine hohe Transfektion der Zellen invitro zu erreichen. Wenn die Zellen mit Nanoliposomen transfiziert werden, die Cy3-markierte eGFP mRNA enthalten, kann das Vorhandensein der eGFP mRNA im Zytoplasma sowie des bereits produzierten eGFP-Proteins visualisiert werden.Da die Transfektion von Zellen mit Nanolipoplexen nachteilige Auswirkungen auf Zellen haben kann, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen nach 24 Stunden und 72 Stunden nach der Transfektion getestet. Bei der Behandlung der Zellen mit 2,5 oder fünf MikroliterN Nanolipoplexen konnten keine Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit nachgewiesen werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die ganze Zeit in einer ethanolfreien Umgebung zu arbeiten, da dies die Nanolipominstabilität beeinträchtigen könnte.Beim Vorbereiten und Mischen des DC-Cholesterins mit DOPE sollten Sie eine Glaspipette verwenden, um eine Kontamination der gelösten Lipide mit löslichen Komponenten von Kunststoffpipettenspitzen zu vermeiden. Nach diesem Protokoll können die erzeugten Nanoliposomen während oder nach der Zubereitung leicht manipuliert werden. Beispielsweise würde die Einbeziehung von PEG-Molekülen oder spezifischen Antikörpern zu erhöhter Stabilität führen oder aktivegewebe-Targeting initiieren.Die erzeugten Nanoliposomen erfüllen die notwendigen Sicherheitsaspekte und erleichtern die mRNA-Aufnahme in die Zielzellen. Nanoliposomen, die mit einer spezifischen therapeutischen nRNA komplex iert sind, können einen wesentlichen Beitrag zur Entwicklung neuartiger mRNA-basierter Therapeutika beispielsweise im Bereich der Gewebetechnik oder Ersatztherapie leisten.

generation-cationic-nanoliposomes-for-efficient-delivery-vitro

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wiederholte retroorbitalen Injektionen kationische liposomes/siRNA/ITSN-1s Komplexe in Mäusen, alle 72 Stunden für 24 Tage, effizient die siRNA-Duplex zum Mauslunge Mikrovaskulatur Reduzierung ITSN-1s mRNA und Protein-Expression von 75%. Diese Technik ist in hohem Maße reproduzierbar in einem Tiermodell, hat keine Nebenwirkungen und Todesfälle verhindert.

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Das Ziel dieses Protokolls ist es, kationische/anionische Liposomen mit einem Neuro-Targeting-Peptid als ZNS-Verabreichungssystem zu verwenden, damit siRNA die BHS passieren kann.  Die Optimierung eines Verabreichungssystems für Behandlungen wie siRNA würde mehr Behandlungsoptionen für Prionen und andere neurodegenerative Erkrankungen ermöglichen.

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Wir beschreiben eine Methode der Verwendung von Polyethyleneimine (PEI)-superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln für transfecting Makrophagen mit SiRNA beschichtet. Diese Nanopartikel können effizient SiRNA zu Makrophagen in Vitro und in Vivo und Stille Ziel Genexpression liefern.

Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

Es werden Methoden zur Vorbereitung und Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der Bioaktivität von neutral aufgeladenen, pH-responsiven siRNA-Nanopartikeln vorgestellt. Es werden Kriterien für erfolgreiche siRNA-Nanomedizine wie Größe, Morphologie, Oberflächenaufladung, siRNA-Ladung und Gen-Schweigung diskutiert.

Vorbereitung von Neutral-aufgeladenen, pH-responsiven polymischen Nanopartikeln für zytosolische siRNA Delivery

Lipid-Nanopartikel werden mit einem mikrofluidischen Mischplattformansatz für die mRNA- und DNA-Verkapselung entwickelt.

Formulierung und Charakterisierung von Lipid-Nanopartikeln für die Genabgabe mit einer mikrofluidischen Mischplattform

Mikrofluidik-basierte Lipid-Nanopartikel (LNP) Produktionsmethoden haben Aufmerksamkeit in Drug-Delivery-Systemen (DDSs) erregt, einschließlich der RNA-Delivery. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung, die LNP-Produktion (siRNA-loaded LNP) und die LNP-Auswertungsprozesse unter Verwendung unseres ursprünglichen mikrofluidischen Geräts namens iLiNP.

Herstellung von siRNA-beladenen Lipid-Nanopartikeln mit einem mikrofluidischen Gerät

Unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) produzierten wir lentivirale Partikel für die stabile Expression von shRNAs in H9-humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und transienten H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) mit hoher Effizienz.

Lentiviral vermittelte Abgabe von shRNAs an hESCs und NPCs unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI)

Ein selbstorganisiertes Peptid-Poloxamin-Nanopartikel (PP-sNp) wird unter Verwendung einer mikrofluidischen Mischvorrichtung entwickelt, um in vitro transkribierte Boten-RNA zu verkapseln und zu liefern. Die beschriebene mRNA/PP-sNp konnte kultivierte Zellen in vitro effizient transfizieren.

Effiziente Transfektion von in vitro transkribierter mRNA in kultivierten Zellen mit Peptid-Poloxamin-Nanopartikeln

Hier wird ein Protokoll zur Formulierung von Lipid-Nanopartikeln (LNPs) vorgestellt, die mRNA verkapseln, die für Glühwürmchen-Luziferase kodiert. Diese LNPs wurden in vitro in HepG2-Zellen und in vivo in C57BL/6-Mäusen auf ihre Wirksamkeit getestet.

Prüfung der In-vitro- und In-vivo-Effizienz von mRNA-Lipid-Nanopartikeln, die durch mikrofluidisches Mischen formuliert wurden

Es wird ein detailliertes Protokoll für die Synthese von Lipid-Nanopartikeln (LNPs) unter Verwendung von Confined Impinging Jet (CIJ)-Mischertechnologien demonstriert, einschließlich eines zweistrahligen CIJ und eines vierstrahligen Multi-Inlet-Vortex-Mischers (μMIVM). Die CIJ-Mischer erzeugen reproduzierbare, turbulente Mikromischumgebungen, die zur Produktion von monodispersen LNPs führen.

Synthese von Lipid-Nanopartikeln durch turbulente Strömung in geschlossenen Aufprallstrahlmischern

Erfahren Sie die Herstellung kationischer Nanoliposome nach der Dry-Film-Methode für die effiziente mRNA-Transfektion. Diese Technik ermöglicht schnelle Produktion stabiler Vesikel mit definierter Größe und schützt die gekapselte mRNA vor Degradation.

Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA

Weitere Videos entdecken