Name: Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines 3-D-Organotyp-Modells der menschlichen Darmschleimhaut unter Mikrogravitation mit Rotationswand-Bioreaktoren. Diese Methode ermöglicht realistische Zellkulturen für Gesundheits- und Krankheitsforschung.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch NIAID, NIH, DHHS Bundesforschungszuschüsse R01 AI036525 und U19 AI082655 (CCHI) an MBS und durch NIH Zuschüsse DK048373 an AF. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of Allergy And Infectious Diseases oder der National Institutes of Health wieder.

Ethik Aussage: Alle Blutproben wurden von Freiwilligen gesammelt , die in der Protokollnummer HP-00040025-1 teilgenommen. Die University of Maryland Institutional Review Board genehmigt dieses Protokoll und ermächtigt, die Sammlung von Blutproben von gesunden Freiwilligen für die Studien in diesem Manuskript enthalten. Der Zweck dieser Studie an Freiwilligen wurde erklärt, und alle Freiwilligen gab informiert unterzeichnete Zustimmung vor Ende der Blutentnahme. Hinweis: Siehe Tabelle 1 für mittlere Ergänzung Vorbereitung. Siehe Tabelle 2 für die Herstellung der 3-D - Kulturmedien. 1. Vorbereitung der Kulturgefäße <ol><li> Schrauben Sie den Deckel der Einfüllöffnung des 50 ml-Gefäß füllen und mit 50 ml sterilem Kulturmedium (z. B. RPMI). Führen Sie alle unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Haube. </li><li> Setzen Sie die Kappe und wischen Sie verschüttete Medium auf jeder Oberfläche mit 70% Ethanol. </li><li> Lassen Sie das Schiff zu incubmindestens 15 min O / N bei RT aßen. </li><li> Verwenden Sie die Einfüllöffnung des Kulturmediums zu verwerfen und 30 ml 3-D-Kulturmedium. </li><li> Wischen Sie verschüttete Medium auf jeder Oberfläche mit 70% Ethanol. </li></ol> 2. Herstellung der Zellen <ol><li> Humanen epithelialen Zelllinie (HCT-8) 24,40. <ol><li> Kulturzellen in RPMI, ergänzt mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 50 ug / ml Gentamicin, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES-Puffer und 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS ) (Beilage 1). Bei 70% Konfluenz, geteilte Zellen in einem Verhältnis von 1: 5. </li></ol></li><li> Menschliche Kolon - Fibroblasten (CCD-18Co - Zellen) 24,41. <ol><li> Kulturzellen in Basal Eagle-Medium , angereichert mit Beiblatt 1 Bei Konfluenz, geteilte Zellen in einem Verhältnis von 1:. 3. </li></ol></li><li> Nabelvene des Menschen Endothelial (HUVEC - Zellen) <sup&gt; 24,42. <ol><li> Kulturzellen in Endothelial Basal Medium (EBM) Medium mit 100 ug angereichert / ml Heparin, 3 ug / ml Endothelzellwachstums Supplement (EKGs) und 1 ergänzen Bei 70% Konfluenz, geteilte Zellen in einem Verhältnis von 1:. 2. </li></ol></li><li> Lymphozyten / Monozyten <ol><li> Isolieren Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) aus dem Blut durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Standardtechniken 43. <ol><li> Kurz gesagt, eine 10 ml-Pipette vorsichtig 30 ml verdünntem Blut (1: 1 Blut: Phosphat-gepufferte Saline (PBS)) in einem 50 ml konischen Röhrchen 10 ml Dichtezentrifugation Medien enthält. Nach dem Zentrifugationsschritt, Lymphozyten und Monozyten werden zwischen den Dichtezentrifugation Medien und Plasma-Schichten in der &quot;weißen&quot; Schicht befinden. </li><li> Sammeln Sie die weiße Schicht eine Transferpipette. Vermeiden Sie Granulozytkontaminierung durch die Sammlung von Dichtezentrifugation Medien zu begrenzen. Nach 43 Waschen, use PBMC wie oder kryokonserviert in flüssigem N 2. Hinweis: Es ist wichtig zu betonen, dass PBMC besteht im Wesentlichen aus Lymphozyten und Monozyten, mit einem kleinen Anteil von dendritischen Zellen und anderen Zelltypen. </li></ol></li></ol></li><li> Wachsen alle Zellen unter Standardkulturbedingungen bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2. </li></ol> 3. Herstellung von Kollagen-eingebetteten Zellen <ol><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Einsätze auf die Zahlen von experimentellen Bedingungen benötigt Basis-Set-up zu werden. Legen Sie die entsprechende Anzahl von Einsätzen in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte. </li><li> Eine Suspension von HUVEC und Fibroblasten: <ol><li> Waschen Sie die Kolben zweimal in PBS und lösen die Zellen unter Verwendung von Trypsin, 0,25% (1x) mit 0,05% Trypsin-Tetranatriumethylendiamintetraacetat (Trypsin-EDTA). Fügen Sie genug Trypsinlösung die Gesamtheit der Zellkulturoberfläche zu bedecken. Detachment erfolgt in der Regel innerhalb von 5 bis 15 min </li><li> Sammelnabgelösten Zellen in einer 50 ml-Rohr 30 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) -30% FBS Medium enthält. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 500 g für 10 min. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 30 ml DMEM-30% FBS-Medium. </li><li> Zählen der Gesamtzahl der lebenden Zellen durch Verdünnen von 20 &amp; mgr; l der resuspendierten Zellen mit 20 ul Trypan-Blau-Farbstoff. Legen Sie das Hämozytometer mit dem Zellgemisch. Tragfähige PBMCs wird weiß klar; nonviable PBMC wird der Farbstoff und werden blau erwerben. <ol><li> Resuspendieren jeden Zelltyp in DMEM-30% FBS - Medium bei einer Konzentration von 5 - 8 x 10 &amp; sup7 ; Zellen ml - 1. </li></ol></li></ol></li><li> Bereiten Sie zellhaltigen Collagengele Hinweis: Jeder Behälter wird die Herstellung von ~ 5 ml zellhaltigen Kollagengel erfordern. <ol><li> In einem 50 ml-konischen Röhrchen durch Zugabe von 1 x DMEM-Medium, das Kollagen-Mischung herzustellen, ergänzt mit 50 ug / ml Gentamicin, 2 mM L-Glutamin und 10% hitze inactivated FBS plus 3 mg / ml bovinem Kollagen-I, 10 ug / ml Laminin, 40 ug / ml Collagen IV, 10 ug / ml Fibronektin, 2 ug / ml Heparinsulfat-Proteoglykan und 15 mM NaOH (den physiologischen pH zu erreichen). </li><li> Schließen Sie den Schlauch und mischen mehrmals durch Umdrehen, bis die Mischung vollständig homogenisiert. Vermeiden Sie Blasenbildung. Wichtig: Halten Sie die Mischung auf Eis Gelieren zu verhindern. <ol><li> Critical Schritt: Wenn die Mischung ein saures Aussehen (gelbliche Farbe) entwickelt, ein paar Tropfen steriler 1 N NaOH das Gemisch zu neutralisieren. </li></ol></li><li> Konzentrierte HUVEC und Fibroblasten in einer Dichte von 1,0 bis 1,2 und 1,5 bis 2,0 x 10 6 Zellen / ml, jeweils mit dem angereicherten Kollagen-Mischung (oben beschrieben). Schließen Sie die Rohre und mischen mehrmals durch Umdrehen, bis die Mischung vollständig homogenisiert. Vermeiden Sie Blasenbildung. Wichtig: Halten Sie die Mischung auf Eis Gelieren zu verhindern. </li><li> Hinzufügen von 4 bis 5 ml des zellhaltigen KollagenGel nach jedem Einsatz, die zuvor in eine 6-Well-Platte geladen ist, und in der Haube mit wenig oder keiner Bewegung für 1 h zu gelieren gelassen. </li><li> Nach 1 Stunde, übertragen Sie die 6-Well - Platte auf einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 1 - 2 zusätzliche Stunden. </li><li> Bringen Sie den 6-Well-Platte mit der Haube und mit Hilfe einer sterilen Pinzette und Skalpell aseptisch abgeschnittene die Membran von dem Einsatz Lösen der zellhaltigen Gels aus der Membran. Schneiden Sie das freistehende Gel in kleine Quadrate (~ 5 x 5 mm). </li><li> Fügen Sie die kleinen Zellen enthaltende Quadrate in ein 50-ml HARV mit der Füllöffnung. </li></ol></li><li> Eine Suspension von HCT-8-Epithelzellen: <ol><li> Waschen Sie die Kolben zweimal in PBS und lösen die Zellen unter Verwendung von Trypsin, 0,25% (1x) mit Trypsin-EDTA-Behandlung. Fügen Sie genug Trypsinlösung die Gesamtheit der Zellkulturoberfläche zu bedecken. Detachment erfolgt in der Regel innerhalb von 10 bis 15 Minuten. </li><li> Sammeln abgelösten Zellen in 30 ml DMEM-30% FBS-Medium. </li><li> Zentri- fugalkrUGE DMEM-30% FBS-Medium Rohr bei 500 xg für 10 min enthält. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 30 ml DMEM-30% FBS-Medium. </li><li> Zählen der Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen, wie in 3.2.5 beschrieben. </li><li> Resuspendieren der HCT-8 - Epithelzellen in DMEM-30% FBS - Medium bei einer Konzentration von 10 7 Zellen ml - 1. </li><li> 1 ml der konzentrierten HCT-8-Epithelzellen in die 50-ml HARV mit der Füllöffnung. </li></ol></li><li> Durch die Verwendung der Einfüllöffnung, fügen Sie weitere 3-D-Kulturmedium, bis der Behälter fast voll ist (~ 20 ml). </li><li> Setzen Sie die Kappe und wischen Sie die Lippe der Einfüllöffnung mit 70% Ethanol. </li><li> Legen Sie eine Spritze in jeder Spritze Port des RWV: Ort, um eine 5 ml-Spritze mit 3 bis 4 ml 3-D-Kulturmedium in einem Hafen und eine 5 ml-leere Spritze in den anderen Port. </li><li> Entfernen Sie alle sichtbaren Blasen, die durch in die leere Spritze ziehen, während etwa das gleiche Volumen des Mediums durch den anderen Spritzenkanal injiziert wird. </li><li> Legen Sie die vesSels im Bioreaktor, schalten Sie das Gerät und stellen Sie die Geschwindigkeit auf etwa 13 bis 14 Umdrehungen pro Minute. Hinweis: Critical Schritt: Rotation Rate müssen möglicherweise einige Male während eines Experiments eingestellt werden , um die Zellen zu halten innerhalb des Behälters umlaufenden, um dadurch die Vermeidung von Kontakt mit den Gefäßwänden. </li><li> Kulturzellen bei 37 ° C, 5% CO 2 unter Schwerelosigkeit, durch den RWV Bioreaktor vorgesehen. </li><li> Ändern Kulturmedium alle 3 - 4 Tage durch das Ersetzen ca. 30 ml mit frischem 3-D-Kulturmedium. </li><li> Nach 4 Tagen (± 1 Tag), die Gefäße aus dem Bioreaktor zu entfernen und Lymphozyten / Monozyten zu den Gefäßen (2 x 10 7 / Schiff) hinzuzufügen. </li><li> Platzieren der Gefäße wieder in dem Bioreaktor bei 37 ° C, 5% CO 2 für weitere 5 Tage (± 1 Tag). </li><li> Nach den weiteren 5 Tagen (Tag 9 der Kultur), Lymphozyten / Monozyten zu den Gefäßen (2 x 10 7 / Gefäß) hinzuzufügen und die Kulturen für 12 weitere Tage fortgesetzt. </li&gt; <li> Ändern Kulturmedium alle 3 - 4 Tage durch das Ersetzen ca. 30 ml mit frischem 3-D-Kulturmedium. </li></ol> 4. Ernten 3-D-Kulturen für die Histologie <ol><li> Mit Hilfe einer Transferpipette Ernte jeder kleine Gelfragment, jetzt genannt &quot;Konstrukt&quot;, in einem Sechs-Well-Platte, enthaltend 10 ml 10% Formalin-Puffer. Verlassen 3 h bei RT oder für 12 bis 16 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie die Gewebeverarbeitung und Einbettkassetten durch Markierung und das Hinzufügen von zwei Stücke von Biopsie Schaumstoffpolster in jeder Kassette. </li><li> Tauchen Sie die Kassetten in 10% Formalin-Puffer. </li><li> Mit Hilfe der Zange stellen die Fest Konstrukten zwischen den beiden Schaumstoffpolster. </li><li> Tauchen Sie die Kassetten in 10% Formalin-Puffer. </li><li> Fahren Sie mit dem Standardverfahren für die Einbettung, Schneiden und Färben 44. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass eine US-Patentanmeldung beim US-Patent- und Markenamt eingereicht wurde (Nummer: 13/360,539).

In diesem Manuskript beschreiben wir die Entwicklung eines biotechnologisch - Modell der menschlichen Schleimhaut Darm von Multiples Zelle besteht Typen , einschließlich primären humanen Lymphozyten, Fibroblasten und Endothelzellen, sowie Darmepithel - Zelllinien 24. In diesem 3-D - Modell werden die Zellen in einem Kollagen-reiche extrazellulären Matrix unter Schwerelosigkeit 24 kultiviert. Wie bereits beschrieben, sind die wichtigsten Merkmale dieses Modells: ...

Der erste Durchbruch beim Aufbau eines 3-D - Modell wurde in den frühen der 1980er Jahre berichtet , als die Wissenschaftler verschiedene Arten des Gerüsts (z. B. Laminin, Kollagen Typ I, Kollagen IV und Fibronektin) und Cocktails von Wachstumsfaktoren zu untersuchen begann zu verbessern Zelle-zu-Zelle und ECM - Wechselwirkungen von &quot;statischen&quot; 3-D - Modelle 1-7. Seitdem hat das Hauptproblem bei diesen Modellen Einschränkungen waren bei der Übertragung von Nährstoffen und Sauerstoff in dem Medium und Gewebekonstrukten 8. Im Gegensatz zu den Zellen in der in vivo Umgebung , die von umgebenden Netzen von Blutgefäßen einen stetigen Fluss von Nährstoffen und Sauerstoff erhält, behindert die statische Natur dieser Modelle , um die effektive Verteilung von ihnen zu den Zellen. Zum Beispiel Zellaggregate in in - vitro - statische Modelle erzeugt , die ein paar Millimeter groß überschreiten wird unweigerlich hypoxischen, nekrotischen Kerne 9 entwickeln. Die RWV Bioreaktoren könnte dieses Problem zu umgehendurch fluid dynamics , vorausgesetzt die effiziente Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff 10-12 ermöglichen. Doch bis heute, die Arbeit mit RWV Bioreaktoren wurden auf die Aufnahme von ein oder zwei Zelltypen 13-17 begrenzt. Außerdem kann anstelle eines räumlichen Orientierung ähnlich zu nativem Gewebe bildeten die Zellen Zellaggregate. Der Hauptgrund für diese Einschränkung ist das Fehlen eines Gerüst Lage, Zellen in einer integrierten Weise zu integrieren. Die Gerüste in den RWV Bioreaktoren bisher verwendet werden , bestehen, mit wenigen Ausnahmen 16-18, vor allem von synthetischen Mikrokügelchen, rohrförmigen Zylinder oder kleine Blätter 13-15,19-23. Diese sind steife Materialien, deren Zusammensetzung und Flexibilität nicht manipuliert werden können, und an die Zellen an ihre Oberfläche gebunden. Somit ist es unwahrscheinlich , dass diese Modelle ein System , in dem bieten wird zu bewerten, in einer integrierten Weise, die verschiedenen Zellkomponenten wie Stromazellen (z. B. Fibroblasten, Immun- und Endothelzellen) , dass should im Gerüst verteilt werden, um eng menschlichem Gewebe nachahmen. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines mehrzelligen 3-D organotypischen Modell der menschlichen Darmschleimhaut , bestehend aus einer intestinalen epithelialen Zelllinie und primären humanen Lymphozyten, Endothelzellen und Fibroblasten 24. Diese Zellen wurden unter Schwerelosigkeit zur Verfügung stellen von der RWV Bioreaktor 13,25-30. Im 3-D - Modell besitzt die ECM viele verschiedene Eigenschaften, wie beispielsweise eine Osmolalität ähnlich dem Kulturmedium (z. B. vernachlässigbaren Diffusionsbeschränkungen während der Kultur) und die Fähigkeit , Zellen und anderen relevanten extrazelluläre Matrixproteine, sowie die einzuarbeiten entsprechende Steifigkeit in Bioreaktoren 24 verwendet werden. Biologische Systeme sind sehr komplex, und in den letzten Jahren hat mit der Umgebung eher eine Verschiebung des Fokus von Schleimhaut Forschung in Richtung auf die Untersuchung von Zell-Wechselwirkungen war, als sie in isolatio Studiumn. Insbesondere wird die Bedeutung der Zell-Zell - Wechselwirkungen bei der Beeinflussung intestinale Zellüberlebens und der Differenzierung gut 31-34 dokumentiert. Insbesondere weist die Verbindung zwischen Epithelzellen und ihre Nische einen profunden Einfluss auf die Epithelzelle Expansion und Differenzierung 35. Tatsächlich ist es allgemein anerkannt, dass nicht nur die Zelle-zu-Zelle, sondern auch Zell-ECM-Wechselwirkungen sind für die Wartung und die Differenzierung von Epithelzellen in 3-D Kulturmodellen. Frühere Studien haben gezeigt, dass gut ECM - Proteine ​​wie Kollagen zeigte ich 24,36,37, Laminin 38 und Fibronektin 39 instrumental sind in intestinalen Epithelzellen beeinflussen räumliche Orientierung ähnlich der nativen Schleimhaut zu erwerben. So kann die Entwicklung neuer Technologien, wie unsere 3-D - Modell 24, dass imitieren die phänotypische Vielfalt des Darms ist erforderlich, wenn die Forscher die komplexe zelluläre und strukturelle Architektur neu zu erstellen beabsichtigenund die Funktion des Darms Mikroumgebung. Diese Modelle stellen ein wichtiges Instrument bei der Entwicklung und Evaluierung von neuen oralen Medikamenten und Impfstoff-Kandidaten.

<table><tbody><tr><td>Quad-Rotator/unabhängiger rotierender Behälter (RWV) Bioreaktor&nbsp;</td><td>Synthecon</td><td>RCCs-4DQ</td><td>Für bis zu 4 Gefäße. Es sind auch Modelle mit mehr oder weniger Gefäßen erhältlich.</td></tr><tr><td>Einweg 50 ml-Gefäß</td><td>Synthecon</td><td>D-405</td><td>Box mit 4 Gefäßen</td></tr><tr><td>HCT-8 Epithelzellen&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-244</td><td></td></tr><tr><td>CCD-18Co Fibroblasten&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzellen der menschlichen Nabelvene</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td>HUVEC</td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumsfaktor-basisch</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>bFGF</td></tr><tr><td>Stammzellfaktor&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7901</td><td>SCF</td></tr><tr><td>Hepatozyten-Wachstumsfaktor&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1404</td><td>HGF</td></tr><tr><td>Endothelin 3</td><td>Sigma</td><td>E9137</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td></td><td>Sigma L2020</td><td>Isoliert aus Maus Engelbreth-Holm-Swarm-Tumor</td></tr><tr><td>Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V7259</td><td>VEGF</td></tr><tr><td>Leukämie-Hemmfaktor&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-4377</td>(<td>LIF</td></tr>: <tr><td>Adenin</td><td></td><td>Sigma A2786</td><td></td></tr>, <tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-trijod-L-thyronin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-6397</td><td>T3</td></tr><tr><td>Choleratoxin</td><td>Sigma</td><td>C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>BD</td><td>354008</td><td>Isoliert aus humanem Plasma</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T-1147</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Heparansulfat&nbsp; Proteoglykan</td><td>Sigma</td><td>H4777</td><td>Isoliert aus der Basalmembran der Maus&nbsp; Engelbreth-Holm-Swarm-Tumor</td></tr><tr><td>Kollagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Isoliert aus menschlicher Plazenta</td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM, Pulver</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin&ndash; PBS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen vom Rind Typ I&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomincin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle</td><td>Invitrogen</td><td>21010-046</td><td>BME</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Endothel Basalmedium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>EBM-2</td></tr><tr><td>Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td>EKGS</td></tr></tbody></table>

entwicklung eines unter schwerelosigkeits vielzellige dreidimensionale organotypischen modell des menschlichen darmschleimhaut grown

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Da die Zellen in einem dreidimensionalen (3-D) Umwelt haben das Potenzial wachsen viele Lücken der Zellkultivierung zu überbrücken , in 2-D - Umgebungen (z. B. Flaschen oder Geschirr). In der Tat ist es allgemein anerkannt, dass in Flaschen oder Geschirr neigen gezüchtete Zellen zu dedifferenzieren und spezielle Funktionen der Gewebe verliert, aus dem sie abgeleitet wurden. Derzeit gibt es im Wesentlichen zwei Arten von 3-D-Kultursysteme, wo die Zellen in Gerüste geimpft werden die native extrazelluläre Matrix (ECM) nachahmt: Bioreaktoren (a) statische Modelle und (b) Modellen. Der erste Durchbruch war die statischen 3-D-Modelle. 3-D-Modelle Bioreaktoren wie der rotierenden Wandgefäß (RWV) Bioreaktoren sind eine neuere Entwicklung verwendet wird. Das ursprüngliche Konzept der RWV Bioreaktoren wurde am NASA Johnson Space Center in den frühen 1990er Jahren entwickelt und wird angenommen, dass die Grenzen der statischen Modelle wie die Entwicklung von hypoxischen, nekrotischen Kerne zu überwinden. Die RWV Bioreaktoren könnten umgehen thist Problem durch Bereitstellung fluid dynamics, die die effiziente Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff erlauben. Diese Bioreaktoren bestehen aus einem Rotator Basis, und drehen Sie zwei verschiedene Formate der Kulturgefäße zur Unterstützung dient , die durch ihre Belüftungsquellentyp unterscheiden: (1) langsames Drehen Lateral Vessels (STLVs) mit einer koaxialen Oxygenator in der Mitte, oder (2 ) Hohe Seitenverhältnis Vessels (HARVs) mit Sauerstoffversorgung über einen flachen, Silikonkautschuk Gasübertragungsmembran. Diese Gefäße ermöglichen eine effiziente Gastransfer während der Blasenbildung und damit Turbulenzen zu vermeiden. Diese Bedingungen führen zu einer laminaren Strömung und minimale Scherkraft, die Modelle der Schwerkraft (Schwerelosigkeit) reduziert im Inneren des Kulturgefäßes. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines vielzelligen 3-D organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut besteht aus einer intestinalen Epithelzellen Zelllinie und primären humanen Lymphozyten, Endothelzellen und Fibroblasten gezüchtet unter Schwerelosigkeit durch den RWV Bioreaktor zur Verfügung gestellt. &lt;/ P&gt;

<html> Bisher haben wir einen mehrzelligen 3-D organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut bestehend aus einer Darmepithel - Zelllinie und primären humanen Lymphozyten, Endothelzellen und Fibroblasten unter Schwerelosigkeit 24 (1) kultiviert entwickelt. Fibroblasten und Endothelzellen wurden in einer Kollagen - Matrix mit zusätzlichen I gut Basalmembranproteine ​​45 (dh., Laminin, Kollagen IV, Fibronectin und Heparinsulfat - Prot...

Zellen in einem dreidimensionalen (3-D) -Umgebung wachsenden stellen eine deutliche Verbesserung gegenüber der Zellkultivierung in 2-D - Umgebungen (beispielsweise Kolben oder Geschirr). Hier beschreiben wir die Entwicklung eines vielzelligen 3-D organotypischen Modell der menschlichen Schleimhaut Darm unter Schwerelosigkeit kultiviert, die von rotierenden Wandgefäß (RWV) Bioreaktoren.

Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Entwicklung eines multizellulären, dreidimensionalen organotypischen Modells der menschlichen Darmschleimhaut zu beschreiben, das unter Mikrogravitation gezüchtet wird, die durch rotierende Wandgefäß-Bioreaktoren bereitgestellt wird. Diese Methode bietet ein breites Potenzial als Werkzeug für Entdeckungen im Bereich der Gesundheit sowie der Krankheitsforschung, einschließlich der Untersuchung von Wechselwirkungen mit Krankheitserregern, des Antigen-Transports und der entzündlichen Prozesse.Die Hauptvorteile dieser Technik liegen in der Nachbildung der phänotypischen Vielfalt der Katze und der Verwendung von D-12-Bioreaktoren, die eine effiziente Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff ermöglichen. Beginnen Sie damit, die Kappe vom Befüllstutzen des Kulturgefäßes abzuschrauben und 50 Milliliter unseres PMI hinzuzufügen. Sobald das Gefäß voll ist, setzen Sie die Kappe wieder auf und wischen Sie jegliches verschüttetes Medium mit 70 %igem Ethanol ab.Lassen Sie das Gefäß mindestens 15 Minuten bis über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Wenn Sie fortfahren möchten, verwenden Sie den Befüllstutzen, um das Kulturmedium zu entsorgen und 30 Milliliter des 3-D-Kulturmediums dem Gefäß hinzuzufügen. Setzen Sie die Kappe auf den Befüllstutzen wieder auf und wischen Sie erneut verschüttetes Medium mit 70 % Ethanol ab.Entfernen Sie nahezu konfluente Kolben mit humanen Nabelvenenendothelzellen und humanen kolonischen Fibroblasten aus dem Inkubator und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Lösen Sie anschließend die Zellen ab, indem Sie sie mit einer 0,25 %igen Trypsinlösung mit 0,05 % Trypsin-EDTA bedecken. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, sammeln Sie sie in einem 50-Milliliter-Röhrchen, das vorab mit 30 Milliliter DMEM mit 30 % FBS beladen wurde.Zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang, um die Zellen zu pelletieren. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in 30 Milliliter DMEM, das 30 % FBS enthält. Danach verdünnen Sie 20 Mikroliter der resuspendierten Zellen mit 20 Mikrolitern Trypanblau-Färbung.Beladen Sie das Hämozytometer mit der Zellmischung und zählen Sie die Konzentration lebensfähiger Zellen. Anschließend resuspendieren Sie jeden Zelltyp in DMEM mit 30 % FBS bei einer Konzentration von 50 bis 80 Millionen Zellen pro Milliliter. Platzieren Sie zunächst die entsprechende Anzahl an Kultur-Inseraten in die Vertiefungen einer 6-Loch-Platte.Bereiten Sie als Nächstes die Kollagenmischung vor, indem Sie zunächst 10x DMEM, 10x Rekonstitutionsmedium, 200 Millimolar L-Glutamin und hitzeinaktiviertes FBS in ein 50-Milliliter-Konischgefäß geben. Fügen Sie dann bovines Kollagen Typ I, Laminin, Kollagen Typ IV, Fibronectin, Heparinsulfatproteoglycan und abschließend Natriumhydroxid hinzu, um den pH-Wert der Lösung zu neutralisieren. Falls die Mischung zu irgendeinem Zeitpunkt eine gelbliche, saure Färbung annimmt, geben Sie einige Tropfen steriles 1 normales Natriumhydroxid hinzu, um die Mischung zu neutralisieren.Schließen Sie das Röhrchen und mischen Sie die Lösung durch mehrmaliges Vorsichtiges Umstülpen, wobei die Bildung von Blasen vermieden werden sollte. Wenn die Lösung nicht gemischt wird, stellen Sie sie zur Verhinderung einer Polymerisation auf Eis. Nach dem Mischen fügen Sie die Zellsuspensionen der Kollagenpräparation hinzu und mischen die Röhrchen durch mehrmaliges vorsichtiges Umstülpen, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.Bringen Sie sie anschließend wieder auf Eis. Geben Sie vier bis fünf Milliliter der Zellen enthaltenden Kollagenlösung in jeden Insert und lassen Sie das Kollagen eine Stunde lang im Sicherheitswerkbank bei geringer oder keiner Bewegung gelieren. Nach einer Stunde überführen Sie die 6-Loch-Platte in einen Inkubator für eine bis zwei zusätzliche Stunden.Als Nächstes bringen Sie die Platte zurück in die Zellkulturfume und verwenden Sie eine sterile Pinzette und ein Skalpell, um die Membran aseptisch aus dem Insert herauszuschneiden. Lösen Sie das Zellen enthaltende Gel von der Membran und schneiden Sie das freigesetzte Gel in kleine Quadrate. Fügen Sie die kleinen, Zellen enthaltenden Kollagenquadrate über die Befüllungsöffnung einem der vorbefüllten 50-Milliliter-Gefäße hinzu.Bereiten Sie anschließend eine Suspension von HCT-8-humanen Epithelzellen wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben vor. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Milliliter in DMEM, das 30 % FBS enthält. Geben Sie dann ein Milliliter der HCT-8-Zellsuspension über den Befüllanschluss in das 50-Milliliter-Gefäß.Nachdem die Zellen hinzugefügt wurden, weitere 20 Milliliter 3-D-Kulturmedium in das Gefäß geben, sodass es nahezu voll ist. Die Kappe wieder aufsetzen und den Rand der Befüllöffnung mit 70 %igem Ethanol benetzen. Anschließend eine 5-Milliliter-Spritze, die drei bis vier Milliliter 3-D-Kulturmedium enthält, in einen Port des Gefäßes einsetzen und eine leere 5-Milliliter-Spritze in den anderen Port.Entfernen Sie sichtbare Blasen, indem Sie in die leere Spritze ziehen, während etwa das gleiche Volumen Medium durch die andere Spritze in das Gefäß injiziert wird. Nachdem nun sämtliche Luft entfernt ist, stellen Sie die Gefäße in den Bioreaktor, schalten Sie die Stromzufuhr ein und stellen Sie die Drehzahl auf 13 bis 14 Umdrehungen pro Minute ein. Passen Sie die Drehzahl bei Bedarf an, um zu verhindern, dass die Zellen mit den Gefäßwänden in Kontakt kommen.Kultivieren Sie die Zellen unter Mikrogravitation und wechseln Sie das Kulturmedium alle drei bis vier Tage. Zum Mediumwechsel ersetzen Sie mithilfe der Doppelspritzenmethode etwa 30 Milliliter des verbrauchten Mediums durch frisches 3-D-Kulturmedium. Isolieren Sie nach drei bis fünf Tagen der Kultivierung periphere mononukleäre Blutzellen, wie in der begleitenden Textanleitung beschrieben.Entfernen Sie dann das Gefäß aus dem Bioreaktor und geben Sie etwa 20 Millionen Zellen, bestehend aus Lymphozyten und Monozyten, über die Befüllungsöffnung in die Gefäße. Stellen Sie die Gefäße zurück in den Bioreaktor und kultivieren Sie sie weitere vier bis sechs Tage. Etwa am neunten Tag der Kultur fügen Sie weitere 20 Millionen Zellen, bestehend aus Lymphozyten und Monozyten, in das Gefäß hinzu und führen die Kulturen bis zu 12 weitere Tage fort.Am Ende des Experiments verwenden Sie eine Transferpipette, um jedes kleine Gelelement, das nun als Konstrukt bezeichnet wird, zu gewinnen, und legen Sie diese in die Vertiefungen einer 6-Loch-Platte, die 10 Milliliter 10 % Formalin-Puffer enthält. Fixieren Sie die Konstrukte drei Stunden bei Raumtemperatur und fahren Sie anschließend mit den standardmäßigen histologischen Einbettungs-, Schnitt- und Färbeprotokollen fort. Die in diesem Video vorgestellten Methoden erzeugen ein mehrzelliges dreidimensionales organotypisches Modell der menschlichen Darmschleimhaut.Bei der Kultur unter Mikrogravitation differenzieren sich die Zellen gut aus und bilden bis zum Tag 20 geordnete, villusähnliche Strukturen aus. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in sechs Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die richtigen Zellkulturrichtlinien einzuhalten.Es ist entscheidend, die Zellen systematisch auf Vitalität, Mykoplasmenkontamination und Veränderungen im Zellwachstumsverhalten zu kontrollieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um Marker für die Zelllinie und Differenzierung zu identifizieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein mehrzelliges, dreidimensionales organotypisches Modell der menschlichen Darmschleimhaut entwickelt, das unter Mikrogravitation kultiviert wird.

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Verbesserte Bildgebungstechnologie ermöglicht die dreidimensionale Bildgebung von Organen während der Entwicklung. Hier beschreiben wir ein ganzes Organkultursystem, das eine Live-Bildgebung der sich entwickelnden Zotten im fötalen Mausdarm ermöglicht.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur Ex-vivo- Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur menschlichen Kultur Enteroid oder Colonoid Monolagen, die intakten Barrierefunktion, Wirt epithelialen Mikrobiota Interaktionen auf die zelluläre und biochemische Ebene zu studieren.

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Organoid-abgeleiteten intestinalen Epithel-Monolayern zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion, Permeabilität und des Transports. Da Organoide die ursprüngliche Reaktion des Epithelgewebes auf äußere Reize darstellen, kombinieren diese Modelle die Vorteile der Erweiterbarkeit von Zelllinien und die Relevanz und Komplexität von Primärgewebe.

Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

Hier stellen wir zwei Protokolle vor, die die Modellierung von intestinalen apikal-spezifischen Interaktionen ermöglichen. Organoid-abgeleitete intestinale Monoschichten und Air-Liquid-Interface (ALI)-Kulturen erleichtern die Erzeugung von gut differenzierten Epithelien, die sowohl von luminaler als auch von basolateraler Seite zugänglich sind, während polaritätsinvertierte Darmorganoide ihre apikale Seite freilegen und für Hochdurchsatz-Assays zugänglich sind.

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

Biopsie-abgeleitete Darmorganoide und Organ-on-a-Chips-Technologien werden zu einer mikrophysiologischen Plattform kombiniert, um die regionsspezifische Darmfunktionalität zu rekapitulieren.

Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung eines murinen Kolonorganoidsystems zur Untersuchung der Aktivität und Funktion von Kolonstammzellen in einem Claudin-7-Knockout-Modell.

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von murinen Dünndarmkrypten und kultivieren intestinale 3D-Organoide aus den Krypten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Generierung von Organoiden aus einer einzelnen intestinalen Stammzelle in Abwesenheit einer subepithelialen zellulären Nische.

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Darmorganoide von Ratten zu generieren und sie in verschiedenen Downstream-Anwendungen zu verwenden. Ratten sind oft ein bevorzugtes präklinisches Modell, und das robuste intestinale Organoidsystem erfüllt den Bedarf an einem In-vitro-System zur Begleitung von In-vivo-Studien.

Generierung und Manipulation von Ratten-Darm-Organoiden

Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

Die Integration von caninen Darmorganoiden und einem mikrofluidischen Gut-on-a-Chip-System bietet relevante translationale Modelle für menschliche Darmerkrankungen. Die vorgestellten Protokolle ermöglichen eine 3D-Morphogenese und eine dynamische In-vitro-Modellierung des Darms und helfen so bei der Entwicklung wirksamer Behandlungen für Darmerkrankungen bei Hunden und Menschen mit One Health.

Dreidimensionale Morphogenese im Darm-on-a-Chip von Hunden unter Verwendung von Darmorganoiden, die von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen stammen

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Erfahren Sie die Entwicklung eines 3-D-Organotyp-Modells der menschlichen Darmschleimhaut unter Mikrogravitation mit Rotationswand-Bioreaktoren. Diese Methode ermöglicht realistische Zellkulturen für Gesundheits- und Krankheitsforschung.

Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown (Video) | JoVE Journal

Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

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