Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Entwicklung eines multizellulären 3-D-Organotypmodells der menschlichen Darmschleimhaut zu beschreiben, das unter Mikrogravitation kultiviert wurde und von Bioreaktoren mit rotierenden Wänden bereitgestellt wird. Diese Methode hat ein breites Potenzial als Werkzeug für Entdeckungen sowohl bei Gesundheit als auch bei Krankheit. Dazu gehören Wechselwirkungen mit Krankheitserregern, Antigentransport und die Entzündungsprozesse.

Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Nachahmung der phänotypischen Vielfalt der Katze und die Verwendung von D-12-Gefäßbioreaktoren, die eine effiziente Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff ermöglichen. Schrauben Sie zunächst den Deckel von der Einfüllöffnung des Kulturgefäßes ab und fügen Sie 50 Milliliter unseres PMI hinzu. Sobald das Gefäß voll ist, setzen Sie die Kappe wieder auf und wischen Sie das verschüttete Medium mit 70 % Ethanol ab.

Lassen Sie das Gefäß mindestens 15 Minuten lang inkubieren, um über Nacht bei Raumtemperatur zu bleiben. Wenn Sie fortfahren möchten, verwenden Sie die Einfüllöffnung, um das Nährmedium zu entsorgen, und geben Sie 30 Milliliter des 3D-Kulturmediums in das Gefäß. Setzen Sie die Kappe wieder auf die Einfüllöffnung und wischen Sie verschüttetes Medium erneut mit 70 % Ethanol auf.

In der Nähe von konfluenten Kolben, die menschliche Nabelvenen-Endothelzellen und humane Dickdarmfibroblasten enthalten, aus dem Inkubator nehmen und zweimal mit PBS waschen. Trennen Sie dann die Zellen, indem Sie sie mit einer 0,25%igen Trypsinlösung mit 0,05%iger Trypsin-EDTA bedecken. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, sammeln Sie sie in einem 50-Milliliter-Röhrchen, das mit 30 Millilitern DMEM mit 30 % FBS vorgeladen ist.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang, um die Zellen zu pelletieren. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 30 Millilitern DMEM, die 30 % FBS enthalten. Als nächstes verdünnen Sie 20 Mikroliter der resuspendierten Zellen mit 20 Mikrolitern Trypanblau-Farbstoff

Beladen Sie das Hämozytometer mit der Zellmischung und zählen Sie die Konzentration lebensfähiger Zellen. Dann re-suspendieren Sie jeden Zelltyp bei 50 bis 80 Millionen Zellen pro Milliliter in DMEM, das 30 % FBS enthält. Platzieren Sie zunächst die entsprechende Anzahl von Kultureinsätzen in den Vertiefungen einer Platte mit sechs Vertiefungen.

Als nächstes bereiten Sie die Kollagenmischung vor, indem Sie zuerst 10x DMEM, 10x Rekonstitutionsmedium, 200 Millimolare L-Glutamin und hitzeinaktiviertes FBS in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen geben. Fügen Sie dann Rinderkollagen Typ eins, Laminin, Kollagen Typ vier, Fibronektin, Heparinsulfat-Proteoglykan und schließlich Natriumhydroxid hinzu, um den pH-Wert der Lösung zu neutralisieren. Wenn die Mischung zu irgendeinem Zeitpunkt ein gelbliches, säuerliches Aussehen entwickelt, fügen Sie einige Tropfen steriles 1 normales Natriumhydroxid hinzu, um die Mischung zu neutralisieren.

Schließen Sie das Röhrchen und mischen Sie die Lösung, indem Sie es mehrmals umdrehen, ohne Blasenbildung zu vermeiden. Wenn Sie nicht mischen, halten Sie die Lösung auf Eis, um zu verhindern, dass sie polymerisiert. Nach dem Mischen die Zellsuspensionen zum Kollagenpräparat geben und die Röhrchen mischen, indem Sie die Röhrchen mehrmals vorsichtig umdrehen, um Blasenbildung zu vermeiden.

Lege sie dann wieder auf das Eis. Geben Sie vier bis fünf Milliliter der zellhaltigen Kollagenlösung in jede Einlage und lassen Sie das Kollagen in der Haube mit wenig oder keiner Bewegung eine Stunde lang gelieren. Nach einer Stunde stellen Sie die Sechs-Well-Platte für ein bis zwei weitere Stunden in einen Inkubator um.

Setzen Sie die Platte anschließend wieder in die Gewebekulturhaube ein und schneiden Sie die Membran mit einer sterilen Pinzette und einem Skalpell aseptisch aus dem Einsatz. Lösen Sie das zellhaltige Gel von der Membran und schneiden Sie dann das abgelöste Gel in kleine Quadrate. Geben Sie die kleine Zelle mit den Kollagenquadraten mit der Füllöffnung in eines der vorgefüllten 50-Milliliter-Gefäße.

Bereiten Sie anschließend eine Suspension von HCT-8-humanen Epithelzellen vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Milliliter in DMEM, das 30 % FBS enthält. Geben Sie dann einen Milliliter der HCT-8-Zellsuspension über die Füllöffnung in das 50-Milliliter-Gefäß.

Geben Sie nach der Zugabe der Zellen weitere 20 Milliliter 3D-Kulturmedium in das Gefäß, so dass es fast voll ist. Setzen Sie die Kappe wieder auf und befeuchten Sie die Lippe der Einfüllöffnung mit 70 % Ethanol. Als nächstes setzen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit drei bis vier Millilitern 3-D-Kulturmedium in einen Anschluss des Gefäßes und eine leere Fünf-Milliliter-Spritze in den anderen Anschluss ein.

Entfernen Sie alle sichtbaren Blasen, indem Sie sie in die leere Spritze ziehen, während ungefähr das gleiche Volumen des Mediums durch die andere Spritze in das Gefäß injiziert wird. Nachdem die gesamte Luft entfernt ist, stellen Sie die Gefäße in den Bioreaktor, schalten Sie den Strom ein und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 13 bis 14 Umdrehungen pro Minute ein. Passen Sie die Geschwindigkeit nach Bedarf an, um zu verhindern, dass die Zellen mit den Gefäßwänden in Berührung kommen.

Kultivieren Sie die Zellen unter Schwerelosigkeit und wechseln Sie das Kulturmedium alle drei bis vier Tage. Um das Medium zu wechseln, verwenden Sie die Doppelspritzenmethode, um etwa 30 Milliliter des verwendeten Mediums durch frisches 3D-Kulturmedium zu ersetzen. Nach drei bis fünf Tagen in Kultur isolieren Sie mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Entfernen Sie dann das Gefäß aus dem Bioreaktor und geben Sie etwa 20 Millionen Zellen, bestehend aus Lymphozyten und Monozyten, durch die Füllöffnung in die Gefäße. Stellen Sie die Gefäße wieder in den Bioreaktor und kultivieren Sie sie für weitere vier bis sechs Tage. Um den neunten Tag der Kultur herum fügen Sie weitere 20 Millionen Zellen, bestehend aus Lymphozyten und Monozyten, in das Gefäß hinzu und setzen Sie die Kulturen für bis zu 12 weitere Tage fort.

Am Ende des Experiments entnehmen Sie mit einer Transferpipette jedes kleine Gelfragment, das jetzt als Konstrukt bezeichnet wird, und geben Sie es in die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte, die 10 Milliliter 10%igen Formalinpuffer enthält. Fixieren Sie die Konstrukte drei Stunden lang bei Raumtemperatur und fahren Sie dann mit den üblichen histologischen Einbettungs-, Schnitt- und Färbeprotokollen fort. Die in diesem Video vorgestellten Methoden erzeugen ein mehrzelliges 3-D-Organotypisches Modell der menschlichen Darmschleimhaut.

In der Schwerelosigkeit werden die Zellen gut differenziert und bilden bis zum 20. Tag geordnete, zottenähnliche Merkmale. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sich an gute Richtlinien für Zellkulturen zu halten.

Es ist entscheidend, die Zellen systematisch auf Lebensfähigkeit, Mykoplasmenkontamination und Veränderungen im Zellwachstumsverhalten zu kontrollieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um Marker für die Abstammung und Zelldifferenzierung zu identifizieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein mehrzelliges 3-D-Organotypisches Modell der menschlichen Darmschleimhaut entwickelt, das unter Mikrogravitation kultiviert wird.