Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz

Das übergeordnete Ziel dieser Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik besteht darin, die Anzahl und Länge von Telomeren in C. elegans präzise zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Tumorneubildung, zur alternativen Verlängerung der Telomere und zum zellulären Altern zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Verfahren präzise sind und die Telomere innerhalb von weniger als 24 Stunden sichtbar gemacht und quantifiziert werden können.

Sammeln Sie die befruchteten erwachsenen Würmer mit etwas flüssigem Medium ohne Rückstände in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Würmer nun dreimal wie folgt: Geben Sie M9-Puffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 15 Millilitern zu erreichen.

Danach die Probe bei 300 G drei Minuten lang zentrifugieren und die Lösung über dem Pellet mit den Würmern verwerfen. Anschließend den Vorgang wiederholen. Falls nach der Zentrifugation die Würmer schwimmen, verringern Sie die Bremse der Zentrifuge.

Nach der dritten Wäsche belassen Sie die Würmer mit 5 Milliliter M9. Geben Sie dann 6,5 Milliliter destilliertes Wasser, zwei Milliliter Hyperchlorit und ein Milliliter fünf molarer Kaliumhydroxid hinzu. Lassen Sie die Würmer drei Minuten lang in dieser Bleichlösung unter 50 U/min Rühren inkubieren. Anschließend wirbeln Sie die Würmer vortexartig, um sie aufzubrechen und ihre Eier freizusetzen.

Unter einem Stereomikroskop nach den freigesetzten Eiern suchen. Falls sie noch nicht freigesetzt wurden, die Inkubation bis zu acht Minuten lang fortsetzen. Wenn die Würmer weitgehend aufgelöst sind und die Eier frei liegen, das Gefäß mit M9 auf 15 Milliliter auffüllen und die Eier dreimal waschen, wie zuvor die Würmer gewaschen wurden.

Zu den gewaschenen Eiern, bei denen das meiste M9 entfernt wurde, das Volumen mit PBST auf 500 Mikroliter auffüllen und dann 500 Mikroliter 4 % PFA hinzufügen. Anschließend 40-Mikroliter-Aliquote der Eier in 2 % PFA in die Vertiefungen von mit Polylysin beschichteten Objektträgern geben. Danach die Objektträger in eine befeuchtete Kammer überführen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen.

Für dieses Protokoll sollte eine Aluminiumplatte auf Trockeneis bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Außerdem sollten Methanol und Aceton bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Nach Abschluss der Fixierungsschritt entfernen Sie den größten Teil der PFA-Lösung von den Objektträgern, wobei etwa fünf Mikroliter verbleiben.

Danach eine zweite mit Polylysin beschichtete Deckglas über jede Probe legen, sodass sich die beiden beschichteten Flächen verbinden und das Gewebe in der Vertiefung eingeschlossen wird. Bei überschüssigem Fixansatz dieses mit einem Tuch aufsaugen. Anschließend die Objektträger einfrieren, indem sie mindestens 15 Minuten lang auf einen kalten Aluminiumblock gelegt werden.

Bereiten Sie in der Zwischenzeit Methanol- und Acetonbäder auf Eis für die Objektträger vor. Sobald die Objektträger eingefroren sind, drehen Sie einen leicht, um die Probe aufzuspalten. Entsorgen Sie den oberen Objektträger und legen Sie den unteren Objektträger fünf Minuten lang in eiskaltes Methanol ein.

Führen Sie dies für alle Proben durch. Durch das Einfrieren und Aufbrechen wird es ermöglicht, dass Sonden und Antikörper durch die harte Eischale eindringen. Wenn die Eier erfolgreich eingefroren und aufgebrochen wurden, können Sie die Eier auf beiden Objektträgern sehen.

Nach mindestens fünf Minuten in Methanol die Objektträger für fünf Minuten in kaltes Aceton überführen. Weitere fünf Minuten später die Proben dreimal für jeweils fünf Minuten in PBST einweichen. Nach den PBST-Spülungen können die Objektträger mehrere Tage lang bei vier Grad Celsius in 100 % Ethanol aufbewahrt werden.

Fahren Sie fort, indem Sie 20 µL RNase-Lösung zu den Probenmulden hinzufügen und diese eine Stunde lang in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C inkubieren. Anschließend spülen Sie die Objektträger zweimal für jeweils 15 Minuten mit 2x SSCT. Nach den beiden Waschungen geben Sie 20 µL Hybridisierungslösung zu den Proben hinzu und inkubieren sie eine Stunde lang bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer.

Unterdessen bereiten Sie die Sonde für eine doppelsträngige DNA-Sonde vor. Denaturieren Sie sie bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten und kühlen Sie sie anschließend kurz auf Eis ab. Nach einer Stunde saugen Sie die Hybridisierungslösung ab und geben die Sondenlösung hinzu.

Ab diesem Schritt die Probe vor Licht schützen. Nach dem Hinzufügen der Sonde die Proben mit Deckgläsern abdecken. Anschließend eine befeuchtete Kammer auf einem Wärmeblock bei 80 Grad Celsius herstellen.

Wenn der Heizblock wieder bei 80 Grad Celsius stabilisiert ist, stellen Sie die Probenpräparate in die vorgewärmte Kammer und lassen Sie sie drei Minuten lang denaturieren. Anschließend inkubieren Sie alle aufbereiteten Präparate über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius. Nach der Übernacht-Inkubation waschen Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in PBST.

Bereiten Sie die Hybridisierungslösung vor, indem Sie sie eine Stunde vor dem Waschen auf 37 Grad Celsius erwärmen. Danach laden Sie die Objektträger in ein Gefäß mit Hybridisierungswaschlösung und inkubieren sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Um die Hybridisierungslösung zu entfernen, waschen Sie die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur mit PBST.

Wiederholen Sie dies dreimal. Nachdem die letzte PBST-Waschung abgesaugt wurde, geben Sie 20 Mikroliter Blockierungslösung zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln in feuchten Kammern. Saugen Sie dann die Blockierungslösung ab und ersetzen Sie sie durch eine mit FITC konjugierte Anti-Digoxigenin-Antikörperlösung im Verdünnungsverhältnis 1 zu 200.

Bedecken Sie die Objektträger und inkubieren Sie sie drei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Antikörperfärbung waschen Sie die Proben zweimal mit PBST, jeweils 15 Minuten lang, im Dunkeln. Danach saugen Sie das PBST ab und ersetzen es durch 10 Mikroliter Eindecklösung, die DAPI enthält.

Bringen Sie einen Deckglaser auf und saugen Sie überschüssige Lösung ab. Versiegeln Sie abschließend die Ränder des Deckglases mit Nagellack und beobachten Sie die Proben anschließend unter einem Fluoreszenzmikroskop. Mithilfe der PNA-Sonde wurden die Telomere von Tieren, die eine telomer-suffiziente Mutation überlebt hatten, beobachtet.

In den Gonaden ist die Anzahl der Telomere pro Kern quantifizierbar. Das Telomer-Signal zeigte eine Kolokalisation mit einem TALT1-Signal, was die Vorstellung unterstützt, dass TALT1 für das Überleben ohne Telomere verantwortlich ist. Die Intensität des Telomer-Signals wurde mithilfe von Software verglichen.

Das Signal war stärker in den ALT-Überlebenden als in den ursprünglichen Stämmen, die zur Erzeugung der telomerdefizienten Mutanten verwendet wurden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd und Formamid äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.