Name: Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz In Situ Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Erfahren Sie eine präzise FISH-Methode zur Analyse von Telomerlänge und -anzahl in Caenorhabditis elegans. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung repetitiver Sequenzen in weniger als 24 Stunden.

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Mutierte Wurmstämme wurden freundlicherweise vom Caenorhabditis Genetics Center zur Verfügung gestellt. Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss des Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI) unterstützt, das vom Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt der Republik Korea finanziert wurde (Fördernummer: HI14C1277).

1. Markierung von Sonden mit Digoxigenin-dUTP durch PCR <ol><li> Führen Sie die PCR - Markierung mit 10x dNTP - Mix enthält Digoxigenin-dUTP wie zuvor 13 beschrieben. </li><li> Reinige PCR-Produkt mit Spin-Säulenreinigung nach Herstelleranleitung. <ol><li> Wenn die Sonde kürzer als 200 bp ist, entfernen freie Digoxigenin-dUTP mit Spin-Säulenchromatographie aus der Reaktionsmischung statt Spin-Säulenreinigung. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung Polylysin beschichteten Objektträger Anmerkung: Die gesamte Prozedur dauert etwa 2 Stunden. Die meisten Schritte werden bei Raumtemperatur mit Ausnahme der Trocknungsschritt durchgeführt. <ol><li> Die Reinigung der Folien <ol><li> Legen Sie die Folien in einem Plastikbehälter und spülen Sie die Objektträger kurz mit destilliertem Wasser (DW). Entfernen Sie das Wasser und füllen Sie den Behälter mit DW 1% Glasreiniger enthalten. </li><li> Agitieren die Objektträger für 15 min bei 50 UpM bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie die Folien mit DW 3mal für 5 min bei RT jeweils. </li><li> Waschen der Objektträger mit 70% Ethanol für 15 min unter Rühren. Entsorgen Sie 70% Ethanol und Objektträger auf einem 65 ° C trocken Block und der Luft trocknen für 15 min. </li></ol></li><li> Polylysin Beschichtung von Multi-Well-Objektträger aus Glas Hinweis: Polylysin Beschichtung von Glasobjektträger ist ein wichtiger Schritt, da es die Probe Adhäsion während des gesamten Färbeverfahrens liefert. Unzureichend beschichtete Folie in der Probenverlust führen wird. <ol><li> Verdünne die Polylysin-Stammlösung auf 0,01% (w / v) in destilliertem Wasser. Geben Sie 20 &amp; mgr; l der verdünnten 0,01% (w / v) Polylysin in die Vertiefungen einer sauberen Glasobjektträger. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger aus Glas für 5 min bei RT. </li><li> Legen Sie die Dias auf einer 65 ° C trocken Block und der Luft trocknen für 1 Stunde. </li><li> Bewahren Sie die Polylysin Folien in der staubfreien Feld. </li></ol></li></ol> 3. Fixierung von Worms auf dem Folie-Glas (Abbildung 1) <ol><li> Vorbereiten von Embryonen für FISH Hinweis: Ernte Würmer vor allem ter bakterielle Nahrung wird durch die Beobachtung der Wachstumsmedien unter dem Mikroskop verbraucht. Starvation reduziert Eierproduktion von erwachsenen Würmer und erhöht Ei schlüpft. Detaillierte Verfahren sind in 14,15 beschrieben. <ol><li> Wachsen die Würmer in 50 mm Petrischale nach Standardverfahren 14. </li><li> Nachdem das gesamte bakterielle Nahrung verbraucht wird, schneiden Sie die Agar-Medien in Quartal mit Spachtel. Sterilisieren Sie den Spachtel vor dem Schneiden eine Kontamination zu verhindern. </li><li> Legen Sie die gesamte Stück Agar auf der 100 mm Nematoden Nährmedien (NGM) Platte. Drehen Sie den Agar Stück den Kopf für die Würmer die frische Bakterien Nahrung zu erreichen. </li><li> Nach 48 bis 72 Stunden, die Würmer mit M9-Puffer zu sammeln. In 3 bis 5 ml M9-Puffer auf der NGM-Platte. Pipette M9-Puffer auf der Oberfläche der NGM die Würmer zu waschen. </li><li> Sammeln Sie die Flüssigkeit mit Würmern und fügen Sie in ein 15-ml-Tube. Hinweis: Wenn es Agar Trümmer nach der Ernte, Zentrifuge die Würmer in einer 30% igen Saccharoselösung. Während Trümmer pelletiert werden, Würmer schwimmen aufdie Oberfläche. </li><li> In M9 Puffer um das Volumen auf 15 ml zu bilden. Pellet die Würmer durch Zentrifugation bei 300 g für 3 Minuten und entfernen Sie die meisten der M9-Puffer. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male. Hinweis: Wenn die Würmer noch nach dem Zentrifugieren schwimmend, stellen die Bremse Niveau der Zentrifuge = 1 zu bewerten. </li><li> Absaugen M9-Puffer. Hinzufügen Bleichlösung auf die Würmer. Pro 0,5 ml Würmer, 6,5 ml DW, 2 ml Hypochlorit, 1 ml 5 M KOH hinzu. </li><li> Inkubiere die Würmer mit 3 min bei 50 Upm bei RT rocking. Vortex Würmer für 15 Sekunden, um mechanisch die Würmer abzuscheren und die Eier aus. </li><li> Beachten Sie die Röhre unter einem Präpariermikroskop während der Bleiche. Stellen Sie sicher, dass Würmer in zwei Hälften geschnitten und Eier freigesetzt werden. Wenn die meisten der erwachsenen Körper gelöst ist, fügen M9 Puffer das Volumen auf 15 ml zu bilden. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 3 min. Aspirieren die meisten der M9 und fügen Sie frisches M9 Puffer um das Volumen auf 15 ml zu bilden. Wiederholen Waschschritt 3 mal. Hinweis:Vermeiden Sie übermäßige Menge an Würmer verwenden, da sie den Bleichprozess behindern. Halten Sie die Gesamtreaktionszeit von weniger als 8 Minuten, bis die Wäsche. Über gebleichten Eier produzieren starke Autofluoreszenz. </li><li> In phosphatgepufferter Salzlösung mit Polysorbat-20 (PBST) bis zu 200 &amp; mgr; l und 200 &amp; mgr; l von 4% Paraformaldehyd (PFA) 2% PFA zu machen. Achtung: Da PFA krebserregend ist, tragen Schutzkleidung, Handschuhe und Augenschutz vor PFA. </li><li> In 40 ul der Eier in 2% PFA auf den gut Polylysin beschichteten Folie. </li><li> Legen Sie die Folien in einer feuchten Kammer und Inkubation für 15 min bei RT. Schließen Sie die feuchte Kammer direkt nach dem die Dias nach innen gesetzt werden. Hinweis: Die Eier an der Unterseite des Schlittens absetzen, während fixiert wird. </li></ol></li><li> Vorbereiten seziert Gonaden für FISH <ol><li> Ernte erwachsenen Würmer auf 50 mm NGM Platte gewachsen durch Pipettieren 1 ml M9-Puffer. Ernte Würmer vor Bakterien Nahrung ist erschöpft. </li><li> Waschen Sie die Würmer aus allen Bakterien Witzh M9-Puffer, 2 Mal. Hinweis: Rest Anhaften von Bakterien an Polylysin beschichteten Objektträger mit den seziert Gonaden stören können. </li><li> Pellet die Würmer durch Zentrifugation bei 300 x g. Entfernen M9 und übertragen Sie die Würmer auf die leere NGM Platte von Mikropipette. </li><li> In 30 ul M9-Puffer, der 2 mM Levamisol auf einem gut Polylysin behandelten Folie. </li><li> Hinzufügen 500 ul M9-Puffer auf eine 1-ml-Röhrchen. Verwenden Sie diese Puffer die Würmer durch den Mund Pipette zu übertragen. </li><li> Füllen Sie die Spitze des Mundpipette mit M9-Puffer durch eine Kapillare in der 1-ml-Röhrchen Platzieren der M9-Puffer enthält. </li><li> Unter Binokular, legte die Spitze Mund Pipette direkt vor dem Kopf der erwachsenen Wurm und ziehen Mund Pipette so dass der Kopf von Würmern die Pipette den Mund gelangt. Sobald der Kopf von Würmern in die Spitze eintritt, wird der gesamte Körper der Wurm in die Spitze gezogen werden. </li><li> Übertragen Sie die Würmer an die Polylysin beschichteten Objektträger mit Mund Pipette. </li><li> Mit einer Rasierklinge geschnitten vonf den Kopf oder die Spitze des Schwanzes von Würmern auf der Folie. Wenn der Wurm geschnitten wird, erscheint die Gonaden aus. Gonaden wird auf den Folien kleben. <ol><li> Bereiten Sie mindestens 30 Würmer in einem gut. Weitere Brunnen kann für weitere 30 Würmer verwendet werden. </li></ol></li><li> Legen Sie die Folie in der feuchten Kammer und absaugen M9-Puffer mit Mund Pipette aus. </li><li> Fixieren Sie die Probe durch Zugabe von 20 ul 2% PFA bei RT für 15 min in der feuchten Kammer. </li></ol></li></ol> 4. Fixierung und Permeabilisierung <ol><li> Platzieren Sie ein Aluminiumblock auf Trockeneis und speichern sie in einem Tiefkühlschrank (-80 ° C). Store Methanol und Aceton in -20 ° C. </li><li> Nach PFA Fixierung Schritt 3.1.15 oder 3.2.11, entfernen Fixiermittel mit Mikro verlassen ~ 5 ul des Fixiermittel. </li><li> Mit anderen Polylysin beschichtete Folie auf dem Probenträger. Entfernen Sie die Fixiermittel mit einem Papiertuch, wenn die Lösung zu hoch ist. Sie nicht, die Dias zu bewegen, sobald sie aneinander haften. </li><li> Frieren Sie die Folienauf dem Aluminiumblock mindestens 15 min. Hinweis: Die Proben können für mindestens 2 gelagert werden - 3 Tage. </li><li> Während die Folien eingefroren werden, setzen die Gläser kaltes Methanol und Aceton auf Eis enthält. </li><li> Nehmen Sie die Folien aus und drehen sie die Probe zu gefrier knacken. Entsorgen Sie die obere Folie. einweichen sofort die Folie in die eiskalten Methanol für 5 min. </li><li> Die Objektträger in eiskaltem Aceton für 5 min. </li><li> Waschen Sie die Folien 3-mal mit PBST für 5 min Rest Fixiermittel zu entfernen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt oder speichern Sie die Folien in 100% Ethanol bei 4 ° C. Hinweis: Die Proben können für mindestens 2 gelagert werden - 3 Tage. </li></ol> 5. Die Hybridisierung von fixierten Zellen <ol><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l RNase-Lösung (PBST 10 ug / ml RNase A enthält). Inkubiere die Folie in der feuchten Kammer bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Waschen Sie die Folie zweimal in 2x Kochsalzlösung und mit Natriumcitrat Polysorbat-20 (2x SSCT) für 15 min jeweils. </li><li> In 20ul Hybridisierungslösung und setzen Sie die feuchte Kammer in den Inkubator 37 ° C. Nach 1 Stunde, entfernen Sie die Hybridisierungslösung durch Pipettieren. </li><li> Vor Hybridisierungslösung zu entfernen, bereiten Sie die Sonde. Wenn die Sondendoppelstrang-DNA ist, denaturieren die Sonden durch Erhitzen bei 95 ° C für 5 min auf einer trockenen Block. Nach dem Erhitzen kühlen, um die Sonde auf Eis kurz. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Hybridisierungslösung Sonden an die Probe enthält. Für PNA-Sonde, Einsatzkonzentration bei einem Verhältnis von 1: 2000 und für die DIG-markierte Sonde, Einsatzkonzentration bei einem Verhältnis von 1: 200. Decken Sie die Probe mit Deckglas. </li><li> Setzen Sie ein Papiertuch mit Wasser auf dem Wärmeblock getränkt (80 ° C). Legen Sie eine Kunststoff-Box Abdeckung auf dem Wärmeblock die Feuchtigkeit und die Temperatur zu erhalten. </li><li> Nachdem die Temperatur des Wärmeblocks (bis 80 ° C) stabilisiert hat, stellen Sie den Probenträger auf dem erhitzten Papiertuch und decken die Proben mit dem Kunststoff-Box-Abdeckung. Denaturieren die Probe für 3 min. </li><li> IncUbate die Folien in einer feuchten Kammer über Nacht bei 37 ° C. </li></ol> 6. Wäscht und Immunofluoreszenz <ol><li> Warm up der Hybridisierungswaschlösung (2 × SSC, 50% Formamid) bis 37 ° C. </li><li> Waschen Sie die Probe in dem PBST zweimal bei RT für 5 min. Entfernen Sie das Deckglas. </li><li> Waschen Sie die Probe in Hybridisierungswaschlösung bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Waschen Sie die Probenträger in PBST 3 mal bei RT. Hinweis: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in feuchten Kammer bei RT. </li><li> In 20 ul Blockierungslösung und Inkubation für 1 h bei RT in der feuchten Kammer. </li><li> Entfernen Blockierungslösung und fügen FITC konjugiertem anti-Digoxigenin-Antikörper-Lösung (1: 200) für 3 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> 7. Montage und Beobachtung <ol><li> Waschen Sie den Probenträger mit PBST 2-mal für jeweils 15 min. </li><li> In 10 ul Lösung mit DAPI Montage. Legen Sie das Deckglas und drücken Sie vorsichtig. Entfernen Sie überschüssige Lösungmit einem Papiertuch. </li><li> Zum Verdampfen von Montagelösung, die Ränder des Deckglases mit Nagellack verhindern. </li><li> Beobachten Sie unter konfokalen Mikroskop. Ausschließen Embryonen mit hohem Hintergrund. Konzentrieren Sie sich auf ein Feld mit 4 - 20 Kernen. </li><li> Nehmen Sie Bilder nach den Anweisungen des Herstellers mit 100X Objektiv. Hinweis: Excite Probe mit 405-nm-Laser für DAPI, mit 555-nm-Laser für cy3, mit 488-nm-Laser für FITC. </li></ol> 8. Quantifizierung der Telomere Signal Anmerkung: Die Quantifizierung erfolgte wie zuvor beschrieben 16. Alle Bilder, die verglichen werden sollte mit derselben Einstellung einschließlich Belichtungszeit und Lichtquelle genommen werden. <ol><li> Exportieren Sie das Bild in .tif-Format. </li><li> Downloaden und die Bildanalyse-Software zu installieren. </li><li> Führen Sie die Bildanalyse-Software und klicken Sie stimmen Taste. </li><li> Klicken Sie auf Öffnen-Taste. Öffnen Sie die Bilder mit Telomer FISH durch einen Doppelklick auf die Bilddatei. </li><li> Klicken[Bearbeiten] - [select Verarbeitungsbereich], wählen Sie eine Region von Interesse mit der linken Maustaste und ziehen. Ausschließen alle die nicht-spezifische Färbung. </li><li> Klicken Sie auf [Maßnahme] - [optischen Dichten vor Ort], wählen Sie den Kanal mit Telomer-Signal und geben Sie den Dateinamen, um die Ergebnisse in TXT-Datei zu speichern. Hinweis: Die Spalte der Ergebnisse sind in der folgenden Reihenfolge: Fluoreszenz von Spot, Hintergrund-Intensität von Spot und Bereich der Stelle. </li><li> Kopieren Sie die Werte und subtrahieren Hintergrund Intensität der Spot von Fluoreszenz von Spot. Die Werte können nun statistisch ausgewertet werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der Hauptvorteil unserer Protokolls ist die Einfachheit des Verfahrens ohne nennenswerte Beschädigung der Morphologie der Zellstruktur. Wurden mehrere Schritte für C optimiert elegans FISH in diesem Protokoll. Die entscheidenden Schritte für eine erfolgreiche FISH umfassen Kennzeichnung von Sonden, die Fixierung von Embryonen und Penetration. Digoxigenin-dUTP Markierungsverfahren bietet eine einfach zu bedienende Markierungsverfahren durch PCR oder Nick-Translation. Zur Kennzeichnung wird lange Zielseq...

Telomere schützt Chromosomenenden von anomalen Fusion und Abbau. Mammalian Telomer besteht aus G-reichen hexameren wiederholt, TTAGGG und Shelterin Komplexe. Die telomere Wiederholungssequenz des Nematoden ist ähnlich zu denen von Säugetieren (TTAGGC). Die meisten Eukaryoten nutzen Telomerase Telomerwiederholungen zu ihrer chromosomalen Enden hinzufügen. Allerdings, 10 - 15% der Krebszellen nutzen Telomerase unabhängigen Mechanismus, bekannt als Alternative Verlängerung von Telomeren (ALT) 3. Zuvor berichteten wir , dass Telomerwiederholungen und die damit verbundenen Folgen, wie TALT genannt, in den Telomeren der Telomerase Mutantenlinien verstärkt wurden , die zwei kritische Sterilität überlebt. Telomerlänge wurde durch quantitative PCR oder durch Southern - Blot gemessen, die 4,5,6,7 durchschnittliche Länge von insgesamt Telomere zur Verfügung stellt. Lesen Anzahl der Telomer - Repeat in Genomsequenzierungsdaten ist auch ein Indikator für insgesamt Telomer Inhalt 8. Obwohl Single Telomerlänge Analysis (STELA) könnte die Länge eines einzelnen Telomere liefern, es 9 räumliche Informationen der Telomere nicht zur Verfügung stellen kann. Während POT-1 :: mCherry Reporterprotein die räumliche Information der Telomere in vivo liefert, kann sie nicht Längen von doppelsträngigen Telomere darstellen, als POT-1 ein Einzelstrang ist Telomer - bindendes Protein 10. Während zuvor genannten Verfahren der gemittelten Daten von repetitiven Sequenzen bereitzustellen, Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ermöglicht , die Menge und räumlichen Muster von individuellen Sequenzen von Interesse auf einer chromosomalen Skala zu beobachten. Anstelle der Reinigung von DNA werden Gewebe oder Zellen fixiert die native räumliche Informationen in FISH zu bewahren. Somit ist FISH eine sowohl quantitative als auch qualitative Werkzeug zur Beobachtung der einzelnen Wiederholungssequenzen, wie beispielsweise Telomerwiederholungen. Dieses Protokoll liefert ein effizientes Verfahren zur gleichzeitigen Nachweis beider teloC. bloße und andere Wiederholungen von zuvor beschriebenen Methoden 11,12 auf Verbesserungen basieren. elegans Larven oder Erwachsene sind vielzelligen Organismus mit hoch differenzierten Zellen. Die Heterogenität von Zellen hemmt auf die quantitative Analyse einer großen Anzahl von Telomer Flecken. Um die Anzahl der analysierten Zellen zu maximieren, Embryonen isoliert und verteilt auf die Polylysin-beschichteten Objektträger für die Fische. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch mit Immunofluoreszenz kombiniert werden. Als Beweis dafür, dass das Protokoll funktioniert, zeigen wir, dass es möglich ist, zwei unterschiedliche repetitive Sequenzen zu beobachten und zu quantifizieren. DNA-Sonde gegen TALT1 wurde erzeugt mit einfachen PCR-Digoxigenin-dUTP enthält. Dann ist diese TALT1 Sonde und Fluoreszenz-markierten Telomere PNA-Sonde wurden gleichzeitig hybridisiert. Anschließend wurde Digoxigenin durch kanonische Immunofluoreszenz Methoden nachgewiesen. Wir stellen Ihnen hier die repräsentativen Bilder , in denen TALT1 mit der Telomere in trt-1 kolokalisiert </em&gt; Überlebenden.

<table><tbody><tr><td>PNA-Sonde</td><td>PANAGENE</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab-Fragmente</td><td>Roche</td><td>11207741910</td><td>Verwendung 1:200 verdünnt in PBST</td></tr><tr><td>Digoxigenin-dUTP</td><td>Roche</td><td>11573152910</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-6148</td><td>4% Paraformaldehyd durch Erhitzen in DW mit wenigen Tropfen NaOH herstellen. 0,1 Lautstärke von 10x PBS hinzufügen.</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungslösung</td><td></td><td></td><td>3x SSC, 50 % Formamid, 10 % (w/v) Dextransulfat, 50 &#956; g/ml Heparin, 100 &#956; g/ml Hefe-tRNA , 100 &#956; g/ml beschallte Lachsspermien DNA</td></tr><tr><td>Hybridizaiton Waschlösung</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 50% Formamid</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>BIONEER</td><td>C-9012</td><td>toxisches</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>machen 10 mg/ml zur Stammlösung</td></tr><tr><td>Dextransulfat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>67578</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td>für 1 L DW : 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27 g Na2HPO4&#8226; 7H2O, 2,4 g KH2PO</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>Polysorbat 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-2287</td><td>Handelsname ist Tween-20</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-Lösung (0,1 % w/v)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8920</td><td>frische 0,01 % w/v-Lösung vor Gebrauch herstellen</td></tr><tr><td>M9</td><td></td><td></td><td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O auf 1 l</td></tr><tr><td>Bleichlösung</td><td></td><td></td><td>20%iger Natriumhypochlorit, 0,5 M KOH</td></tr><tr><td>Antikörperpuffer</td><td></td><td></td><td>1x PBST, 1 mM EDTA, 0,1 % BSA, 0,05 % Natriumazid (toxisch)</td></tr><tr><td>Blockierungslösung</td><td></td><td></td><td>Antikörperpuffer mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA)</td></tr><tr><td>illustra Microspin G-50</td><td>GE healthcare</td><td>27-53310-01</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td></td><td></td><td>Zur Herstellung von 1 L, 175,3 g NaCl, 88,2 g Natriumcitrat, H2O bis 1 L, pH-Wert auf 7,0</td></tr><tr><td>einstellen 2x SSCT</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>10x Digoxigenin-dUTP-Mix</td><td></td><td></td><td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,65 mM dTTP, 0,35 mM DIG-11-dUTP PCR-Aufreinigungssäulen</td></tr><tr><td></td><td>Cosmo genetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>Glasreiniger / ULTRA CLEAN</td><td>Dukssan pure chemicals</td><td>8AV721</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell-Glasobjektträger</td><td>MP biomedizinisch</td><td></td><td></td>96041205</tr><tr><td>Nematoden-Wachstumsmedium</td><td></td><td></td><td>Zur Herstellung von 1 L, 3 g NaCl, 17 g Agar, 2,5 g Pepton, H2O auf 974 ml. Den Kolben autoklavieren und abkühlen. 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 4 mg/ml Cholesterin in Ethanol, 1 ml 1 M MgSO4, 25 ml 1 M KPO4 zugeben.</td></tr>Als Objektiv wurde <tr><td>Levamisol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>196142</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>Feather</td><td>Klinge Nr. 11</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Enzynomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>EC Plan-Neofluar 100X verwendet.</td></tr><tr><td>Feuchtkammer</td><td></td><td></td><td>Kunststoffbox, gefüllt mit Papiertuch, das in der DW</td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware getränkt ist&nbsp;</td><td>Dr. Peter Landsdorp</td><td>TFL-telo</td><td><a href="http://www.flintbox.com/public/project/502">http://www.flintbox.com/public/project/502</a></td></tr></tbody></table>

beobachtung und quantifizierung der telomere und repetitiver sequenzen mittels fluoreszenz<em&gt; in situ</em&gt; die hybridisierung (fish) mit pna-sonden in<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomer ist eine Ribonukleoproteinstruktur, die die Chromosomenenden vor aberranter Fusion und Abbau schützt. Die Telomerlänge wird durch die Telomerase oder einen alternativen Signalweg aufrechterhalten, der als alternative Verlängerung der Telomere (ALT)1 bekannt ist. In jüngster Zeit hat sich C. elegans als mehrzelliger Modellorganismus für die Erforschung von Telomern und ALT2 herauskristallisiert. Die Visualisierung repetitiver Sequenzen im Genom ist entscheidend für das Verständnis der Biologie der Telomere. Während die Telomerlänge mittels Telomerrestriktionsfragment-Assay oder quantitativer PCR gemessen werden kann, liefern diese Methoden nur die gemittelte Telomerlänge. Im Gegenteil, die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kann die Information der einzelnen Telomere in Zellen liefern. In dieser Arbeit stellen wir Protokolle und repräsentative Ergebnisse der Methode zur Bestimmung der Telomerlänge von C. elegans durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Verfügung. Diese Methode bietet ein einfaches, aber leistungsstarkes In-situ-Verfahren, das die Morphologie nicht merklich schädigt. Durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierter Peptid-Nukleinsäure (PNA) und Digoxigenin-dUTP-markierter Sonde konnten wir zwei verschiedene repetitive Sequenzen sichtbar machen: Telomer-Wiederholungen und Template von ALT (TALT) in C. elegans-Embryonen und -Gonaden.

Es wurde bereits berichtet , dass ALT Überlebende von Telomerase-defiziente Mutante entstehen kann, trt-1 (ok410), in niedriger Frequenz durch Replizieren intern lokalisierte &#39;Vorlage von ALT (TALT) Sequenzen für Telomererhaltung 2. Mit PNA - Sonde konnten wir Telomere in den sezierten Gonaden (2A) zu visualisieren. Das schwache Telomer - Signal wurde sowohl in trt-1 (ok410) und ALT Überlebende entdeckt. Die Fuzzy-Signal wurde überlappt n...

Wir berichten über ein prägnantes Verfahren der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) in der Gonade und den Embryonen von Caenorhabditis elegans zur Beobachtung und Quantifizierung repetitiver Sequenzen. Wir haben erfolgreich zwei verschiedene repetitive Sequenzen beobachtet und quantifiziert, Telomerwiederholungen und Template der alternativen Verlängerung von Telomeren (TALT).

Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Das übergeordnete Ziel dieser Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik besteht darin, die Anzahl und Länge von Telomeren in C. elegans präzise zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Tumorneubildung, zur alternativen Verlängerung der Telomere und zum zellulären Altern zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Verfahren präzise sind und die Telomere innerhalb von weniger als 24 Stunden sichtbar gemacht und quantifiziert werden können.Sammeln Sie die befruchteten erwachsenen Würmer mit etwas flüssigem Medium ohne Rückstände in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Würmer nun dreimal wie folgt: Geben Sie M9-Puffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 15 Millilitern zu erreichen.Danach die Probe bei 300 G drei Minuten lang zentrifugieren und die Lösung über dem Pellet mit den Würmern verwerfen. Anschließend den Vorgang wiederholen. Falls nach der Zentrifugation die Würmer schwimmen, verringern Sie die Bremse der Zentrifuge.Nach der dritten Wäsche belassen Sie die Würmer mit 5 Milliliter M9. Geben Sie dann 6,5 Milliliter destilliertes Wasser, zwei Milliliter Hyperchlorit und ein Milliliter fünf molarer Kaliumhydroxid hinzu. Lassen Sie die Würmer drei Minuten lang in dieser Bleichlösung unter 50 U/min Rühren inkubieren. Anschließend wirbeln Sie die Würmer vortexartig, um sie aufzubrechen und ihre Eier freizusetzen.Unter einem Stereomikroskop nach den freigesetzten Eiern suchen. Falls sie noch nicht freigesetzt wurden, die Inkubation bis zu acht Minuten lang fortsetzen. Wenn die Würmer weitgehend aufgelöst sind und die Eier frei liegen, das Gefäß mit M9 auf 15 Milliliter auffüllen und die Eier dreimal waschen, wie zuvor die Würmer gewaschen wurden.Zu den gewaschenen Eiern, bei denen das meiste M9 entfernt wurde, das Volumen mit PBST auf 500 Mikroliter auffüllen und dann 500 Mikroliter 4 % PFA hinzufügen. Anschließend 40-Mikroliter-Aliquote der Eier in 2 % PFA in die Vertiefungen von mit Polylysin beschichteten Objektträgern geben. Danach die Objektträger in eine befeuchtete Kammer überführen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen.Für dieses Protokoll sollte eine Aluminiumplatte auf Trockeneis bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Außerdem sollten Methanol und Aceton bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Nach Abschluss der Fixierungsschritt entfernen Sie den größten Teil der PFA-Lösung von den Objektträgern, wobei etwa fünf Mikroliter verbleiben.Danach eine zweite mit Polylysin beschichtete Deckglas über jede Probe legen, sodass sich die beiden beschichteten Flächen verbinden und das Gewebe in der Vertiefung eingeschlossen wird. Bei überschüssigem Fixansatz dieses mit einem Tuch aufsaugen. Anschließend die Objektträger einfrieren, indem sie mindestens 15 Minuten lang auf einen kalten Aluminiumblock gelegt werden.Bereiten Sie in der Zwischenzeit Methanol- und Acetonbäder auf Eis für die Objektträger vor. Sobald die Objektträger eingefroren sind, drehen Sie einen leicht, um die Probe aufzuspalten. Entsorgen Sie den oberen Objektträger und legen Sie den unteren Objektträger fünf Minuten lang in eiskaltes Methanol ein.Führen Sie dies für alle Proben durch. Durch das Einfrieren und Aufbrechen wird es ermöglicht, dass Sonden und Antikörper durch die harte Eischale eindringen. Wenn die Eier erfolgreich eingefroren und aufgebrochen wurden, können Sie die Eier auf beiden Objektträgern sehen.Nach mindestens fünf Minuten in Methanol die Objektträger für fünf Minuten in kaltes Aceton überführen. Weitere fünf Minuten später die Proben dreimal für jeweils fünf Minuten in PBST einweichen. Nach den PBST-Spülungen können die Objektträger mehrere Tage lang bei vier Grad Celsius in 100 % Ethanol aufbewahrt werden.Fahren Sie fort, indem Sie 20 µL RNase-Lösung zu den Probenmulden hinzufügen und diese eine Stunde lang in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C inkubieren. Anschließend spülen Sie die Objektträger zweimal für jeweils 15 Minuten mit 2x SSCT. Nach den beiden Waschungen geben Sie 20 µL Hybridisierungslösung zu den Proben hinzu und inkubieren sie eine Stunde lang bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer.Unterdessen bereiten Sie die Sonde für eine doppelsträngige DNA-Sonde vor. Denaturieren Sie sie bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten und kühlen Sie sie anschließend kurz auf Eis ab. Nach einer Stunde saugen Sie die Hybridisierungslösung ab und geben die Sondenlösung hinzu.Ab diesem Schritt die Probe vor Licht schützen. Nach dem Hinzufügen der Sonde die Proben mit Deckgläsern abdecken. Anschließend eine befeuchtete Kammer auf einem Wärmeblock bei 80 Grad Celsius herstellen.Wenn der Heizblock wieder bei 80 Grad Celsius stabilisiert ist, stellen Sie die Probenpräparate in die vorgewärmte Kammer und lassen Sie sie drei Minuten lang denaturieren. Anschließend inkubieren Sie alle aufbereiteten Präparate über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius. Nach der Übernacht-Inkubation waschen Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in PBST.Bereiten Sie die Hybridisierungslösung vor, indem Sie sie eine Stunde vor dem Waschen auf 37 Grad Celsius erwärmen. Danach laden Sie die Objektträger in ein Gefäß mit Hybridisierungswaschlösung und inkubieren sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Um die Hybridisierungslösung zu entfernen, waschen Sie die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur mit PBST.Wiederholen Sie dies dreimal. Nachdem die letzte PBST-Waschung abgesaugt wurde, geben Sie 20 Mikroliter Blockierungslösung zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln in feuchten Kammern. Saugen Sie dann die Blockierungslösung ab und ersetzen Sie sie durch eine mit FITC konjugierte Anti-Digoxigenin-Antikörperlösung im Verdünnungsverhältnis 1 zu 200.Bedecken Sie die Objektträger und inkubieren Sie sie drei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Antikörperfärbung waschen Sie die Proben zweimal mit PBST, jeweils 15 Minuten lang, im Dunkeln. Danach saugen Sie das PBST ab und ersetzen es durch 10 Mikroliter Eindecklösung, die DAPI enthält.Bringen Sie einen Deckglaser auf und saugen Sie überschüssige Lösung ab. Versiegeln Sie abschließend die Ränder des Deckglases mit Nagellack und beobachten Sie die Proben anschließend unter einem Fluoreszenzmikroskop. Mithilfe der PNA-Sonde wurden die Telomere von Tieren, die eine telomer-suffiziente Mutation überlebt hatten, beobachtet.In den Gonaden ist die Anzahl der Telomere pro Kern quantifizierbar. Das Telomer-Signal zeigte eine Kolokalisation mit einem TALT1-Signal, was die Vorstellung unterstützt, dass TALT1 für das Überleben ohne Telomere verantwortlich ist. Die Intensität des Telomer-Signals wurde mithilfe von Software verglichen.Das Signal war stärker in den ALT-Überlebenden als in den ursprünglichen Stämmen, die zur Erzeugung der telomerdefizienten Mutanten verwendet wurden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd und Formamid äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Biologie

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Die Einfachheit in der Pflege und Verbreitung des...

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Hier beschreiben wir eine Technik, die zur Visualisierung genomischer DNA in fixierten, intakten Nematoden verwendet wird. Das Video enthält ein Beispielprotokoll zur Zählung von Chromatin in unbefruchteten C. elegans-Eizellen.

Ethanolfixierung und DAPI-Färbung: Eine Methode zur Visualisierung von DNA in C. elegans

Quelle: Pigazzini, M. L., et. al. Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Alter C. Elegans mittels Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung. J. Vis. Exp. (2020). Dieses Video zeigt die Verwendung der Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) zur Beurteilung der PolyQ-Proteinaggregation in C. elegans Neuronen und vergleicht Kontroll- und Chaperonprotein-defiziente Würmer. Eine erhöhte Aggregation bei Chaperon-defizienten Würmern fördert den Energietransfer zwischen geclusterten...

Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung der PolyQ-Proteinaggregation in Caenorhabditis elegans-Neuronen

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Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Hier beschreiben wir Protokolle, die speziell zur Überwachung morphogener Defekte entwickelt wurden, die während der frühen und späten Phasen der embryonalen Elongation des Fadenwurms Caenorhabditis elegans auftreten. Letztendlich sind diese Protokolle darauf ausgelegt, Gene zu identifizieren, die diese Phasen regulieren, und ihre unterschiedlichen Anforderungen entlang der antero-posterioren Achse des Embryos zu charakterisieren.

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Erfahren Sie eine präzise FISH-Methode zur Analyse von Telomerlänge und -anzahl in Caenorhabditis elegans. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung repetitiver Sequenzen in weniger als 24 Stunden.

Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz In Situ Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal

Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz

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