Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz In Situ Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in Caenorhabditis elegans

Das übergeordnete Ziel dieser Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik ist es, die Anzahl und Länge der Telomere in C.Elegans prägnant zu analysieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Tumorregenese, zur alternativen Verlängerung der Telomere und zur zellulären Seneszenz zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Verfahren prägnant sind und die Telomere in weniger als 24 Stunden visualisiert und quantifiziert werden können.

Sammeln Sie die trächtigen adulten Würmer mit etwas flüssigem Medium ohne Rückstände in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie nun die Würmer dreimal wie folgt. Fügen Sie M9-Puffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 15 Millilitern zu erhalten.

Drehen Sie dann das Röhrchen drei Minuten lang bei 300 g herunter und verwerfen Sie die Lösung über dem Wurmkorn. Wiederholen Sie dann den Vorgang. Wenn nach der Zentrifugation die Schnecken schwimmen, dann die Bremse an der Zentrifuge leichter machen.

Nach der dritten Wäsche lassen Sie die Würmer mit 5 Millilitern M9 belassen. Fügen Sie dann 6,5 Milliliter destilliertes Wasser, zwei Milliliter Hyperchlorit und einen Milliliter fünf molare Kaliumhydroxide hinzu. Lassen Sie die Würmer drei Minuten lang in dieser Bleichlösung mit 50 U/min Rührwerk inkubieren. Wirbeln Sie dann die Würmer ein, um sie aufzuscheren und ihre Eier zu befreien.

Suchen Sie unter einem Seziermikroskop nach den freigesetzten Eizellen. Wenn sie noch nicht freigegeben sind, setzen Sie die Inkubation oder bis zu acht Minuten fort. Sind die Würmer größtenteils aufgelöst und die Eier frei, fülle die Tube auf 15 Milliliter mit M9 und wasche die Eier dreimal, so wie die Würmer zuvor gewaschen wurden.

Füllen Sie die gewaschenen Eier, wobei der größte Teil des M9 entfernt wurde, füllen Sie das Volumen auf 500 Mikroliter mit PBST und fügen Sie dann 500 Mikroliter 4%PFA hinzu. Laden Sie nun 40 Mikroliter Aliquots Eier in 2%PFA in die Vertiefungen der mit Polylysin beschichteten Objektträger. Dann geben Sie die Objektträger in eine befeuchtete Kammer und lassen sie 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Lassen Sie für dieses Protokoll einen Aluminiumblock auf Trockeneis bei 80 Grad Celsius lagern. Lassen Sie außerdem Methanol und Aceton bei 20 Grad Celsius lagern. Nachdem der Fixierungsschritt abgeschlossen ist, entfernen Sie den größten Teil der PFA-Lösung von den Objektträgern, wobei etwa fünf Mikroliter übrig bleiben.

Legen Sie dann zweite mit Polylysin beschichtete Objektträger über jeden Probenobjektträger, so dass die beiden beschichteten Oberflächen aneinander kleben und das Gewebe in der Vertiefung eingeschlossen wird. Wenn übermäßiges Fixiermittel vorhanden ist, wischen Sie es mit einem Taschentuch auf. Frieren Sie nun die Objektträger ein, indem Sie sie für mindestens 15 Minuten auf den kalten Aluminiumblock legen.

Bereiten Sie in der Zwischenzeit Methanol- und Acetonbäder auf Eis für die Rutschen vor. Sobald die Objektträger eingefroren sind, drehen Sie einen, um die Probe einzufrieren. Entsorgen Sie den oberen Objektträger und weichen Sie den unteren Objektträger fünf Minuten lang in eiskaltem Methanol ein.

Tun Sie dies für alle Proben. Das Freeze-Cracking ermöglicht das Eindringen von Sonden und Antikörpern durch die harte Eierschale. Wenn die Eier erfolgreich eingefroren werden, kann man die Eier auf beiden Rutschen sehen.

Bewegen Sie die Objektträger nach mindestens fünf Minuten in Methanol für fünf Minuten in kaltes Aceton. In weiteren fünf Minuten werden die Proben dreimal für fünf Minuten pro Bad in PBST eingeweicht. Nach den PBST-Waschgängen können die Objektträger mehrere Tage lang in 100%igem Ethanol bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Um fortzufahren, geben Sie 20 Mikroliter RNase-Lösung in die Probenvertiefungen und inkubieren Sie sie in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Waschen Sie die Objektträger anschließend zweimal pro Waschgang 15 Minuten lang in 2x SSCT. Nach den beiden Waschgängen fügen Sie den Proben 20 Mikroliter Hybridisierungslösung hinzu und inkubieren sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer.

Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Sonde für eine doppelsträngige DNA-Sonde vor. Denaturieren Sie es bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten und kühlen Sie es anschließend kurz auf Eis. Nach einer Stunde aspirieren Sie die Hybridisierungslösung und fügen die Sondenlösung hinzu.

Schützen Sie die Probe ab diesem Schritt vor Licht. Decken Sie die Proben nach dem Hinzufügen der Sonde mit Glasabdeckgläsern ab. Stellen Sie dann eine befeuchtete Kammer auf einem 80 Grad Celsius warmen Wärmeblock her.

Wenn sich der Wärmeblock wieder auf 80 Grad Celsius stabilisiert hat, legen Sie die Objektträger in die erwärmte Kammer und lassen Sie sie dann drei Minuten lang denaturieren. Anschließend werden alle verarbeiteten Objektträger über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach der Inkubation über Nacht werden die Proben fünf Minuten lang in PBST bei Raumtemperatur gewaschen.

Zur Vorbereitung erwärmen Sie die Hybridisierungslösung eine Stunde vor dem Waschen auf 37 Grad Celsius. Laden Sie dann die Objektträger in ein Glas mit Hybridisierungswaschlösung und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Um die Hybridisierungslösung zu entfernen, waschen Sie die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBST.

Tun Sie dies dreimal. Nach dem Absaugen des letzten PBST-Waschgangs werden jeder Probe 20 Mikroliter Blockierungslösung zugesetzt und in befeuchteten Kammern bei Raumtemperatur eine Stunde lang im Dunkeln inkubiert. Aspirieren Sie dann die Blockierungslösung und ersetzen Sie sie durch FITC-konjugierte Anti-Digoxigenin-Antikörperlösung bei eins bis 200.

Decken Sie die Objektträger ab und inkubieren Sie sie drei Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Proben nach der Antikörperfärbung zweimal mit PBST für 15 Minuten pro Waschgang im Dunkeln. Als nächstes aspirieren Sie das PBST und ersetzen es durch 10 Mikroliter Einbettlösung, die DAPI enthält.

Tragen Sie ein Deckglas auf und saugen Sie überschüssige Lösung auf. Versiegeln Sie abschließend die Ränder des Deckglases mit Nagellack und fahren Sie mit der Betrachtung der Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop fort. Mit Hilfe der PNA-Sonde wurden die Telomere von Tieren beobachtet, die eine Telomer-hinreichende Mutation überlebt hatten.

In den Gonaden ist die Anzahl der Telomere pro Zellkern quantifizierbar. Das Telomersignal kolokalisierte mit einem TALT1-Signal, was die Annahme unterstützt, dass TALT1 für das Überleben ohne Telomere verantwortlich ist. Die Intensität des Telomersignals wurde mit Hilfe einer Software verglichen.

Das Signal war bei den ALT-Überlebenden stärker als bei den elterlichen Stämmen, die zur Erzeugung der Telomeres-defizienten Mutanten verwendet wurden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd und Formamid äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen von Handschuhen.