Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor Schlauchseescheide

Das übergeordnete Ziel transienter Transfektionstechniken in Ciona-Embryonen ist es, die Genregulation und -funktion zu untersuchen, die erforderlich sind, um kaulquappenähnliche Larven zu bilden, wobei ihre invariante zelluläre Abstammung und ihr kompaktes Wirbellosengenom genutzt werden, um Einblicke in die Herkunft der wirbellosen Chordatiere zu gewinnen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Molekulargenetik zu beantworten, wie z.B. die konservierten Mechanismen des Chordat-Entwicklungsprogramms, die für die Stammzellforschung und für die Wirkstoffforschung relevant sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie mit der Embryo-Elektroporation Hunderte oder Tausende von synchronisierten Embryonen an einem Tag behandeln können.

Im Allgemeinen werden Einzelpersonen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da der empfindliche Embryo dechorioniert ist und es schwierig ist, eine effiziente Mikroinjektionstechnik zu entwickeln. Beginnen Sie mit der Präparierung von erwachsenen Ciona in einem bei 18 Grad Celsius gekühlten Embryoraum. Machen Sie mit einer kleinen Schere einen Schnitt am gegenüberliegenden Ende der Siphons und an der Seite des kürzeren Siphons, unter dem der Eileiter und der Samenleiter verlaufen.

Verlängern Sie den Schnitt, um den Eileiter freizulegen. Dann machst du mit der Spitze der Schere einen präzisen Schnitt in den Eileiter. Mit der geschlossenen Schere vorsichtig auf den Eileiter drücken und die Eier abstreifen.

Lassen Sie die Eier direkt in eine Platte mit sechs Vertiefungen fallen, die künstliches Meerwasser mit HEPES enthält. Verwenden Sie eine mit ASWH vorgespülte Pasteurpipette, um die restlichen Eier zu sammeln und zu übertragen. Um Sperma zu sammeln, schneiden Sie den Samenleiter mit der Schere auf, verwenden Sie dann eine separate Pasteurpipette, um konzentriertes Sperma zu sammeln, und geben Sie es in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Aktivieren Sie die Spermien, indem Sie einen Milliliter ASWH und 50 Mikroliter Tris in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen kombinieren. Fügen Sie dann 20 Mikroliter konzentriertes Sperma hinzu, schließen Sie die Kappe und mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen umdrehen oder eine Pasteurpipette verwenden. Geben Sie dann 100 bis 200 Mikroliter der aktivierten Samenlösung in jede Vertiefung der Eizellen und mischen Sie sie gut, indem Sie auf und ab pipettieren, so dass die Eier im Medium schwimmen.

Beginnen Sie mit der Dechorionierung, indem Sie die Zygoten sammeln und in Glasröhrchen abfüllen. Drehen Sie die Zygoten mit der Handzentrifuge etwa 20 Sekunden lang mit dem Zwölfhundertfachen G und stoppen Sie dann langsam die Zentrifuge. Entfernen Sie das ASWH mit einer Pasteurpipette aus den Pellets.

Geben Sie vier Milliliter aktivierte Dechorionierungslösung in jedes Röhrchen in das Pellet. Hängen Sie die Zygoten auf, indem Sie sie vorsichtig mit einer mit Leitungswasser behandelten Pasteurpipette auf und ab pipettieren und mit einer kleinen Gummibirne belegen. Die Lösung sollte sich nach 1 bis 3 Minuten gelblich verfärben.

Während der Dechorionierung wird ein kleines Aliquot der dechorionierenden Suspension mit der Pasteurpipette entfernt. Geben Sie einen Tropfen auf einen Objektträger und betrachten Sie ihn unter dem Präpariermikroskop. Pipettieren Sie die Zygotenaufhängung auf und ab und überprüfen Sie den Objektträger alle 20 bis 30 Sekunden.

Zuerst lösen sich die Follikelzellen ab, dann wird das Chorion gelb und undurchsichtig und schließlich löst es sich von den Zygoten. Rosa dechorionierte Zygoten sinken auf den Boden der Glasröhre. Sobald mehr als 50% der Zygoten dechorioniert sind, füllen Sie das Röhrchen mit ASWH.

Zentrifugieren Sie sehr vorsichtig für etwa 10 bis 15 Sekunden, gerade genug, um die dechorionierten Zygoten zu sedimentieren. Stoppen Sie die Zentrifuge langsam. Entfernen Sie fast die gesamte Flüssigkeit aus dem Glasrohr, einschließlich des schwimmenden Materials, und ersetzen Sie es durch ASWH.

Pipettieren Sie zum Waschen langsam auf und ab und zentrifugieren Sie dann vorsichtig wie zuvor. Erneut waschen, bis keine Chorionreste mehr übrig sind. Durch die Schwerkraft wird die Wäsche zu dechorionierten Zygoten in silikonisierten 1,5-Milliliter-Röhrchen sedimentiert.

Entfernen Sie nach der Sedimentation das ASWH bis zur 100-Mikroliter-Markierung auf dem Röhrchen. Verwenden Sie nun eine Pasteurpipette, um 250 Mikroliter zuvor vorbereitete DNA in Mannitollösung in ein Röhrchen mit Zygoten zu geben. Mischen Sie vorsichtig und geben Sie die Mischung sofort in eine vier Millimeter große Elektroporationsküvette.

Legen Sie die Küvette in den Elektroporationshalter und geben Sie einen einzelnen Impuls von 16 Millisekunden bei 50 Volt ab. Entfernen Sie dann die Zygoten mit derselben Pasteurpipette aus der Küvette und geben Sie sie in eine Kulturschale mit frischem, gefiltertem ASWH. Rühren Sie das Gericht um, um die Zygoten zu verteilen.

Spülen Sie die Pipette in einem Becherglas mit ASWH und fahren Sie dann mit der nächsten Probe fort. Nachdem Sie alle Zygoten elecropoiert haben, kultivieren Sie die Zygoten bei 15 bis 20 Grad Celsius. Stellen Sie den Mikromanipulator in einem 18 Grad Celsius gekühlten Raum auf.

Verbinden Sie den Kunststoffschlauch und den Nadelhalter mit einer mit Mineralöl gefüllten 10-Milliliter-Glasspritze. Füllen Sie den Schlauch und den Nadelhalter mit Öl und stoßen Sie alle Luftblasen aus. Führen Sie die Injektionsnadel ein, die 0,5 Mikroliter Injektionslösung mit grünem Vitalfarbstoff in den Nadelhalter enthält.

Und positionieren Sie den Halter auf dem Mikromanipulator. Stellen Sie den Nadelhalter so ein, dass er sich entlang einer geraden Linie in einem Winkel von 45 Grad relativ zur Oberfläche bewegt. Richten Sie die dechorionierten Eier in einer kleinen mit Agarose beschichteten Kulturschale entlang einer Vertiefung aus, so dass die Eier nacheinander unter dem Präpariermikroskop injiziert werden können.

Brechen Sie bei Bedarf die Nadelspitze, indem Sie die Nadel vorsichtig gegen ein Stück Glasabdeckglas drücken, das auf die Agarose gelegt wurde. Üben Sie leichten Druck aus, um zu überprüfen, ob die Nadelspitze geöffnet ist. Injizieren Sie die unbefruchteten Eier nacheinander, indem Sie zuerst die Nadel in das Ei einführen und leicht einziehen, um die Eimembran zu durchbrechen.

Injizieren Sie dann die grüne Injektionslösung in die Mitte des Eies bis zu einem Maximum von einem Drittel des Zelldurchmessers. Nachdem Sie alle Eier injiziert haben, entfernen Sie die Nadel, geben Sie die injizierten, unbefruchteten Eier in eine frische Kulturschale und inkubieren Sie sie bei 15 bis 18 Grad Celsius bis zur Befruchtung. Die Mikroinjektion wurde verwendet, um die Regulation des Myelin-Transkriptionsfaktors (MyT) von Ciona intestinalis im Gastrula-Stadium von Ciona-Embryonen zu untersuchen.

Überwacht durch insitu-Hybridisierung wird eine endogene Expression in den Vorläufern der Neuralplatte der sechsten Reihe im Wildtyp beobachtet. Die Mikroinjektion von Morpholinos, um frühe embryonale Faktoren wie Forkhead Box A, einen Transkriptionsfaktor, auszuschalten, eliminiert die gesamte MyT-Expression. Umgekehrt wird die MyT-Expression ektopisch aktiviert, wenn der Knoten herunterreguliert wird, was darauf hindeutet, dass der Knoten normalerweise die MyT-Expression in diesen lateralen Nervenstrangvorläufern unterdrückt.

Der Transkriptionsfaktor GATAa wurde mit einem Venus-Tag markiert und mit einem pfog-Treiber in ektodermale Blastomere elektroporiert. Wie hier zu sehen ist, ist GATAa hauptsächlich in Zellkernen lokalisiert, wie es für einen Transkriptionsfaktor zu erwarten ist. Während die Venusexpression allgegenwärtig ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine vorübergehende Transfektion durch Elektroporation in synchronisierte Ciona-Zygoten durchführt, wie man mit den zerbrechlichen dechorionierten Embryonen umgeht und wie man den richtigen Winkel der Mikroinjektion findet. Nach ihrer Entwicklung haben diese Techniken den Weg zur funktionellen Genomik geebnet. Erforschung der Genfunktion, genregulatorischer Netzwerke und Konservierung von Entwicklungsmodulen, die für die Gewebebildung auch beim Menschen wichtig sind.