Mikrofluidik-Pufferaustausch für einen störungsfreien Micro / Nanoparticle Zelltechnik

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine praktische, effiziente und hochdurchsatzfähige mikrofluidische Reinigungstechnologie zur Trennung freier Nanopartikel von Zellen nach der Zellengineering-Behandlung mit Nanopartikeln zu demonstrieren. Der Hauptvorteil dieser Technologie liegt darin, dass ungebundene Nanopartikel nach dem Zellbehandlungsverfahren schnell und effizient entfernt werden können. Nach dem Zellbehandlungsschritt sammeln wir alle unsere ses-fa-tion. Diese mikrofluidische Zellreinigungstechnologie ermöglicht eine effiziente, größenbasierte Trennung aufgrund der unterschiedlichen trägheitsbedingten Fokussierungseffekte von Zellen und Nanopartikeln in einem spiralförmigen Mikrogerät.

Es kann bis zu 10 Millionen Zellen pro Mil-Konzentration verarbeiten, was für die regenerative Medizin sowie für die Verarbeitung von Latch-Volumen-Zellen sehr nützlich ist. Diese Technologie ist im Bereich der Zellengineering stark gefragt, wo häufig Nanopartikel zur Markierung von Zellen für bildgebende Verfahren oder zur Funktionskontrolle eingesetzt werden. Die Durchführung des Verfahrens wird Hui Min Tay, eine wissenschaftliche Assistentin aus meinem Labor, sowie Doctor David Yeo, ein Postdoktorand aus dem Labor von Professor Xi, demonstrieren.

Kultivieren Sie mesenchymale Stammzellen auf einer 6-Loch-Platte bis zu einer Konfluenz von mehr als 80 %, bevor Sie die Zellen mit den Nanopartikeln markieren. Kultivieren Sie die THP-1-Zellen analog auf eine Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter. Lösen Sie danach ein Milligramm Silica-Nanopartikel in einem Milliliter einer zweihundert Mikromolar starken Kalziumfarbstofflösung auf.

Und rühren Sie die Partikel über Nacht. Stellen Sie außerdem PLGA-Calcium-AM-Nanopartikel mit den hier gezeigten Referenzmethoden her. Mischen Sie entweder ein Milligramm der PLGA-Calcium-AM-Nanopartikel oder 150 Mikrogramm der Calcium-Silica-Nanopartikel in einer 0,1%igen Poly-L-Lysin-Lösung in Wasser, indem Sie die Lösung mit einer Pipette eine Minute lang auf- und abpipettieren.

Anschießend 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Danach die Nanopartikel zentrifugieren. Den überschüssigen Poly-l-Lysin-Überstand entfernen und die Nanopartikel in einem Milliliter des geeigneten Kulturmediums für den zu markierenden Zelltyp resuspendieren.

Geben Sie 1 Milligramm der markierten Nanopartikel pro eine Million Zellen in Kultur zu einem Milliliter Medium hinzu. Pipettieren Sie die Mischung aus Zellen, Nanopartikeln und Medium gründlich für eine Minute. Anschließend inkubieren Sie die Mischung für etwa 24 Stunden.

Nach der Markierung dissoziieren und die Stammzellen gewinnen und sie in einer Konzentration von 100.000 bis 1.000.000 Zellen pro Milliliter für die mikrofluidische Verarbeitung resuspendieren. Verwenden Sie markierte THP-1-Zellen in derselben Konzentration. Um die mikrofluidische Spiralvorrichtung herzustellen, bereiten Sie zunächst eine Silikonwafer-Form mit Hilfe standardmäßiger Mikrofertigungstechniken vor.

Anschließend 30 Gramm des Basis-PDMS-Präpolymers und drei Gramm eines Härters gründlich in einem Wiegeboot mischen. Die Mischung 60 Minuten unter Vakuum entgasen, um Luftblasen zu entfernen. Das PDMS-Gemisch vorsichtig auf die Negativform, die mit dem spiralförmigen Kanaldesign strukturiert ist, bis zu einer Höhe von fünf bis 10 Millimetern gießen.

Anschließend entgasen Sie die Mischung 60 Minuten lang, um Luftblasen zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Blasen beseitigt sind. Danach platzieren Sie das Wafer in einem Ofen und stellen sicher, dass das Wafer während der Aushärtung nicht geneigt ist, um eine konstante Bauelementhöhe zu gewährleisten.

Härten Sie das PDMS bei 80 Grad Celsius für zwei Stunden aus. Nach dem Abkühlen schneiden Sie das spiralförmige PDMS-Gerät mit einem Skalpell aus und lösen vorsichtig die PDMS-Scheibe von der Negativform. Anschließend trimmen Sie mit einem Skalpell die Ränder des Geräts, um eine glatte Oberfläche für die Verbindung sicherzustellen.

Verwenden Sie anschließend eine 1,5 mm große Biopsiepunch, um zwei Löcher für die Zulauföffnungen und zwei Löcher für die Ablauföffnungen zu erstellen. Spülen Sie das Gerät mit Isopropanol, um Rückstände zu entfernen, und trocknen Sie es fünf Minuten lang in einem 80 °C heißen Ofen.

Verwenden Sie dann Klebeband, um die Unterseite des PDMS-Geräts und eine Seite eines Objektträgers zu reinigen. Platzieren Sie den Objektträger und das PDMS-Gerät vorsichtig in eine Plasma-Kammer, wobei die gereinigten Oberflächen nach außen zeigen. Schalten Sie die Plasma-Leistung auf Maximum, senken Sie den Druck in der Kammer, bis diese rosa gefärbt erscheint, und belichten Sie die Komponenten 60 Sekunden lang.

Entfernen Sie dann die Objektträger und die PDMS-Vorrichtung aus der Kammer und verbinden Sie sie, indem Sie die plasmabehandelten Oberflächen fest miteinander pressen. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen zwischen den beiden Oberflächen eingeschlossen sind.

Erhitzen Sie das verbundene Gerät zwei Stunden lang auf einer Heizplatte, die auf 80 Grad Celsius eingestellt ist, um die Verbindung zu verstärken. Schneiden Sie zwei Tubing-Stücke mit einer Länge von 15 bis 20 Zentimetern für die Zulauföffnungen zu und befestigen Sie an einem Ende jedes Schlauchs eine 23-Gauge-Nadel. Schneiden Sie anschließend zwei weitere Stücke des gleichen Tubings mit einer Länge von fünf bis 10 Zentimetern für die Auslässe zu und verbinden Sie sie mit den Ablauföffnungen des Geräts.

Bevor die Probe durchgeführt wird, spülen Sie das Gerät manuell mit einer Spritze, die 70 % Ethanol enthält, bis es aus der Auslassleitung austritt. Lassen Sie das Ethanol mindestens 30 Sekunden im Gerät verbleiben, um es zu sterilisieren. Danach füllen Sie 30 Milliliter gefiltertes PBS mit 1 % BSA in eine 60-Milliliter-Spritze.

Außerdem drei Milliliter markierter Zellen in eine Drei-Milliliter-Spritze füllen und prüfen, ob sich in keiner der Spritzen Luftblasen befinden. Eventuelle Luftblasen entfernen, indem man vorsichtig einige Tropfen Flüssigkeit aus der Düse ausstößt. Die Einlass-Spritzenaufsätze und Schläuche an den Spritzen anschließen und die Spritzen an den Spritzenpumpen befestigen.

Setzen Sie die Röhrchen in die entsprechenden Anschlüsse des Geräts ein und stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in den Schläuchen befinden. Nachdem die Fluidik eingerichtet ist, befestigen Sie das Gerät an einem invertierten Phasenkontrastmikroskop, um während des Zellsortierprozesses Echtzeit-Aufnahmen zu machen. Stellen Sie einen kleinen Abfallbecher sowie zwei 15-Milliliter-Röhrchen in der Nähe des Geräts auf den Mikroskoptisch.

Stellen Sie die Auslassschläuche beider Geräteausgänge in den Abfallbecher. Stellen Sie nun das Flussverhältnis von Probe zu Umhüllungspuffer auf eins zu 10 ein, indem Sie die Flussrate der Probenspritze auf 120 Mikroliter pro Minute und die Umhüllungsspritze auf 1.200 Mikroliter pro Minute einstellen. Betreiben Sie das Gerät eineinhalb Minuten lang, um den Flussraten die Möglichkeit zu geben, sich zu stabilisieren.

Verwenden Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera, um das Vorhandensein inertial fokussierter Zellen nahe der inneren Kanalwand im Hellfeld mit Phasenkontrast zu bestätigen. Sobald ein stationärer Fluss erreicht ist und das Gerät korrekt läuft, positionieren Sie die Auslassröhrchen in verschiedene Gefäße, um getrennte Eluate aus Zellen-Auslass und Abfall-Auslass zu sammeln. Dieses Gerät ist in der Lage, eine markierte Suspension von THP-1-monozytären Zellen korrekt von fluoreszierenden Silica-Nanopartikeln zu trennen.

Hohe Trennleistungen wurden bestätigt durch Hochgeschwindigkeitsaufnahmen und Durchflusszytometrie-Analyse. Die einstufige Reinigungsstrategie ermöglicht die kontinuierliche Gewinnung einer markierten Suspension und adhärenter Zellen, die in frischer Pufferlösung suspendiert sind, ohne Zentrifugation erforderlich zu machen. Das Gerät ist in der Lage, mit Silica- und PLGA-Nanopartikeln eine Trennung mit hoher Effizienz durchzuführen und bis zu 10 Millionen Zellen pro Milliliter mit derselben hohen Effizienz zu trennen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Zellen mit Nanopartikeln markiert werden können und wie die markierten Zellen gereinigt werden, indem überschüssige, nicht gebundene Partikel mit unserem speziellen mikrofluidischen Gerät entfernt werden.