Name: Mikrofluidik-Pufferaustausch für einen störungsfreien Micro / Nanoparticle Zelltechnik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Lernen Sie eine mikrofluidische Reinigungstechnologie zur effizienten Trennung freier Nanopartikel von Zellen mittels inertialer Mikrofluidik. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatzverarbeitung für die regenerative Medizin.

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Freundliches Geschenk von THP-1-Zellen von Dr. Mark Chong und Unterstützung bei der Mikrofabrikation von Dr. Yuejun Kang und Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) wurden sehr geschätzt. Dieses Projekt wurde vom NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University) finanziert. H.W.H. wurde durch das Postdoktorandenstipendium der Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) unterstützt.

1. Nanopartikel (NPs) Kennzeichnung von mesenchymalen Stammzellen und Monozyten <ol><li> Kultur von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) vor der Markierung mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika zu ≥80% Konfluenz ergänzt. Ähnlich Kultur THP-1 - Zellen (ATCC) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 - Medium mit 10% FBS auf eine Dichte von ~ 10 6 Zellen / ml ergänzt. </li><li> Last Silica-Nanopartikel (~ 500 &amp; mgr; m) mit Calceinfarbstoff-Lösung (200 &amp; mgr; M) über Nacht Rühren mit. Fabrizieren PLGA-Calcein AM (CAM) mit einem Protokoll zuvor beschrieben. 22 <ol><li> Man löst 250 ug CAM und 100 mg PLGA (50:50) in Chloroform bei 4 ° C. </li><li> Generieren Sie einzelne NPs Emulsion, die eine High-Speed-Homogenisator (13.600 · g, 60 sec) bei Raumtemperatur. Man dampft das Chloroform in einer chemischen Haube (≥3 hr) vor Sammlung mit Zentrifugation (3.400 × g für 5 min), Waschen (Doppel distiWasser gefüllt), Gefriertrocknung und Lagerung bei -20 ° C. </li></ol></li><li> CAM-PLGA NPs (1 mg) oder Calcein Siliciumdioxid NPs (150 ug) in 0,01% Poly-L-Lysin (PLL) Lösung bei Raumtemperatur inkubieren 15 - 20 min. </li><li> Zentrifuge bei 3.400 xg für 5 min überschüssige PLL Überstand vor NPs Resuspension in 1 ml der jeweiligen Kulturmedium zu entfernen. </li><li> Inkubieren der NPs mit Zellen (MSCs oder THP-1, ~ 1 - 2 mal 10 6 Zellen insgesamt) für etwa 24 Stunden (0,1 mg · ml -1 Markierungskonzentration). </li><li> Dissoziieren und Ernte der markierten anhaftende MSCs unter Verwendung von 2 ml von 0,25% Trypsin (5 min, 37 ° C) und Abschrecken mit 6 ml DMEM. Drehen , um die Zellen bei (1000 xg, 4 min) und resuspendieren zu einer Konzentration von 10 5 - 10 6 Zellen / ml für mikrofluidische Verarbeitung. Verwenden Sie markierten THP-1 - Zellen (10. Mai - 10. JUNI Zellen / ml) direkt für die Mikrofluidik Reinigung. </li></ol> 2. Mikrofluidik-Vorrichtung Vorbereitung <ol><li> Vorrichtung Fabrication <ol><li> Fabrizieren die mikrofluidische Spiraleinrichtung (500 &amp; mgr; m (w) × 115 &amp; mgr; m (h)) mit Polydimethylsiloxan (PDMS) von einem kommerziellen Kit unter Verwendung von Standard weichen Lithographieschritte. 23 </li><li> Mischen Sie 30 g Base Prepolymers und 3 g Mittel gründlich in einem Wägeschiffchen aushärtet. De-Gas das Gemisch in einem Exsikkator für 60 Minuten alle Luftblasen zu entfernen. </li><li> Gießen Sie die PDMS-Mischung auf den Siliziumwafer Masterform mit dem spiralförmigen Kanal Design strukturiert sorgfältig zu einer Höhe von ~ von 5 bis 10 mm. </li><li> De-Gas das Gemisch in einem Exsikkator Vakuum erneut 60 min alle Luftblasen zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Blasen beseitigt werden. </li><li> Härten des PDMS-Mischung in einem Ofen bei 80ºC für 2 Stunden, bis das PDMS eingestellt ist. Sicherstellen, dass der Wafer nicht während der Aushärtung haben eine konstante Bauhöhe gekippt wird. </li><li> Schneiden Sie die PDMS-Spirale Gerät mit einem Skalpell und vorsichtig schälen die PDMS-Platte aus der Urform. </li><li> Trim, die Kanten der Vorrichtung mit einem Skalpell zum Bonden glatte Oberfläche zu gewährleisten. </li><li> Stanzen zwei Löcher (1,5 mm) für die Einlässe und zwei Löcher (1,5 mm) für die Auslässe auf der PDMS-Gerät mit einem 1,5 mm-Biopsie Tanze verwendet wird. </li><li> Waschen Sie das Gerät mit Isopropanol (IPA) alle Ablagerungen zu entfernen und das Gerät in einem 80 ° C Ofen für 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Reinigen Sie die Bodenfläche der PDMS-Gerät (mit Kanalfunktionen) unter Verwendung von Klebeband. </li><li> Sauber einer Seite eines Glasobjektträger (2 &quot;von 3&quot;) unter Verwendung von Klebeband. </li><li> Vorsichtig legen und die gereinigten Oberflächen der PDMS-Gerät und Glasträger in der Kammer eines Plasmareiniger aussetzen und unterziehen sie für 60 Sekunden Vakuum. Als nächstes schalten Sie die Plasmaleistung auf Maximum und den Kammerdruck zu senken, bis die Kammer rosa Farbe dreht. <ol><li> Expose die Oberflächen Luftplasma für 60 Sekunden. Das Plasma erzeugt reaktive Spezies auf den freiliegenden Oberflächen der PDMS und Glas, die feste Bindung ermöglicht, wenn sie in Physic gebrachtal Kontakt. Schalten Sie den Plasma-Gerät aus und lassen Sie den Druck aus dem Plasma-Reiniger das Gerät und Glasträger abzurufen. </li></ol></li><li> Bond, die PDMS-Gerät und Glasobjektträger zusammen mit dem Plasma ausgesetzten Oberflächen fest gedrückt und sicherzustellen, dass keine Luftblasen zwischen den beiden Oberflächen gefangen sind. </li><li> Erhitzen Sie das gebundene Gerät eine Heizplatte eingestellt bei 80 ° C für 2 Stunden mit der Bindung zu stärken. </li></ol></li><li> Gerätebetrieb <ol><li> Geschnitten, um zwei Schlauchstücke (1,52 mm OD) von ca. 15 bis 20 cm für die Einlass- Spritzen und Befestigen einer Spritzenspitze (Gauge 23) an einem Ende jedes Schlauch. </li><li> Geschnitten, um zwei Schlauchstücke (1,52 mm OD) von ca. 5 - 10 cm für die Auslässe und heften sich an den Austrittsöffnungen des PDMS-Gerät. </li><li> Vor Laufen zu probieren, das Gerät manuell prime mit einer Spritze 70% Ethanol enthält, bis sie aus dem Ablaufschlauch fließt. Ermöglichen das Ethanol sit für 30 sec bis 1 min, das Gerät zu sterilisieren. </li><li> Last 30 ml gefilterter(0,2 um Poren) Mantel-Puffer (Phosphat-gepufferte Saline (PBS) mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)) in die 60 ml-Spritze und sichern die Spritze auf Spritzenpumpe. Stellen Sie die Pumpe auf die richtigen Einstellungen (Spritzengröße: 60 ml, Volumen: 60.000 ul). Anmerkung: Die Zugabe von BSA zu PBS ist Zell-Zell-Bindung und unspezifischer zwischen Zellen und der PDMS-Gerät Bindung zu minimieren. </li><li> Last 3 ml der markierten Zellen in die 3-ml-Spritze und sichern Sie die Spritze auf einem separaten Spritzenpumpe. Stellen Sie die Pumpe auf die richtigen Einstellungen (Spritzengröße: 3 ml, Volumen: 3000 ul). </li><li> Überprüfen Sie, dass keine Luftblasen in den Spritzen gefangen sind, eine stabile Strömung zu gewährleisten. Entfernen Sie alle Luftblasen durch vorsichtiges paar Tropfen Flüssigkeit Ausstoßen aus der Düse. </li><li> Schließen Sie die Einlass Spritze Spitzen und Schläuche an die Spritzen und fügen Sie sie in die jeweiligen Einlässe der Vorrichtung (Hülle und Probeneingang). Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen entlang dem Schlauch sind. </li><li> Montieren Sie die Geräte auf einen Inverted Phasenkontrastmikroskop für die Echtzeitbildgebung während der Zellsortierprozess. </li><li> Sichern Sie sich einen kleinen Abfallbecher und zwei 15-ml-Röhrchen bei dem Gerät auf dem Mikroskoptisch unter Verwendung von Klebstoffen. </li><li> Die Austrittsschläuche in den Abfallbecher. </li><li> Stellen Sie den Stromverhältnis für die Probe zu Hülle Puffer bis 1:10 und starten die beiden Spritzenpumpen den Sortierprozess zu initiieren (Beispiel: 120 ml / min für die Probenspritze und 1200 ml / min für die Hülle Spritze; Kanalströmungsgeschwindigkeit ~ 0,38 m / sec ). </li><li> Führen Sie das Gerät für 1,5 min für die Strömungsgeschwindigkeit zu stabilisieren. Dies kann durch die Anwesenheit von inertially fokussierten Zellen in der Nähe der Kanalinnenwand unter Hellfeld mit Phasenkontrast mit einer Hochgeschwindigkeitskamera (-: 10-50 us 10.000 Frames pro Sekunde (fps), Belichtungszeit ~ 5000) bestätigt werden. </li><li> Positionieren Sie die Austrittsschläuche in verschiedene Röhrchen, die die Eluenten aus der Zelle Auslass und Abfallausgang zu sammeln. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das DFF Zellreinigung hier beschriebene Technologie ermöglicht eine schnelle und kontinuierliche Trennung der markierten Zellen in einem Hochdurchsatz Weise. Diese Trennung Ansatz ist ideal für große Probenvolumen oder hohe Zellkonzentration Probenverarbeitung und ist besser als herkömmliche Membranbasis Filtration, die zu einer Verstopfung nach längerem Gebrauch anfällig ist. In ähnlicher Weise Affinität basierende magnetische Trennung erfordert eine zusätzliche Markierung von Zellen Schritte, die aufwendig und teuer s...

Zellen , die durch agenten geladen Mikro- / Nanopartikel (NPs) ist eine einfache, genomische Integration frei und vielseitige Methode zur Bioimaging - Fähigkeit zu verbessern und zu erweitern / Ergänzung seiner nativen therapeutischen Eigenschaften in der regenerativen Medizin - Engineering. 1-3 Cellular Modifikationen erreicht werden durch die Kennzeichnung Plasmamembran oder Zytoplasma mit einem Überschuss Konzentration des Mittels belasteten NPs die Bindungsstellen zu sättigen. Jedoch ist ein Hauptnachteil dieses Verfahrens , die signifikante Mengen an ungebundenen Partikel in Lösung verbleibt nach dem Zellmarkierungsverfahren, die möglicherweise eine genaue Identifizierung von partikel manipulierten Zellen vermengen können oder therapeutische Ergebnisse erschweren. 4,5 Zusätzlich Exposition gegen NPs enthält transformierende Mittel (Wachstumsfaktoren, Kortikosteroide, etc.) bei zu hoher Konzentration kann Zytotoxizität und misdirected Exposition verursachen unerwünschte Folgen auf nicht-Zielzellen induzieren kann. partikuläre Träger Selbst umfassend of &quot;biokompatibel&quot; Materialien [zB Poly (milch co-Glykolsäure), PLGA] kann auch potente Immunzell - Reaktionen unter bestimmten Bedingungen anstiften. 6 Dieses bei Personen mit eingeschränkter Immunität besonders riskant ist (zB rheumatoide Arthritis) , die möglicherweise Verzögerungen systemische Clearance Nanopartikels. 7 somit effiziente Entfernung von freien Teilchen vor der Einführung des partikel manipulierten Zellen ist von großer Bedeutung Toxizitätsprofil zu minimieren und misdirected Exposition gegenSubstanz beladenen Partikel in vivo reduzieren. Herkömmliche Gradientenzentrifugation wird oft zu trennen manipulierten Zellen von freien Teilchen verwendet, ist aber umständlich und im Batch-Modus betrieben werden. Darüber hinaus kann durch Zellen erfahrenen Scherspannungen während des hochtourigen Zentrifugation und die Bestandteile des Dichtegradientenmedium kompromittieren Integrität Zelle und / oder Beeinflussung des Zellverhaltens. 8 Microfluidics ist eine attraktive Alternative mit sevrere Trenntechnologien einschließlich deterministische seitliche Verschiebung (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 und acoustophoresis 12 kleine Partikel Trennung und Pufferaustausch - Anwendungen entwickelt wurde. Jedoch leiden diese Methoden von geringem Durchsatz (1-10 &amp; mgr; l · min - 1) und sind anfällig für Probleme zu verstopfen. Aktive Trennungen wie Dielektrophorese-basierten Verfahren benötigen auch Unterschiede in der intrinsischen dielektrophoretischen Zellphänotypen oder zusätzliche Zellmarkierungsschritte zur Trennung erzielen. Ein vielversprechender Ansatz beinhaltet Trägheits Mikrofluidik - die seitliche Wanderung der Partikel oder Zellen über rationalisiert an bestimmten Positionen durch dominante Auftriebskräfte (F L) bei hohen Reynolds - Zahl (Re) 13 Aufgrund der hohen Strömungsverhältnisse und überlegene Größe Auflösung zu konzentrieren. ist es oft für größenbasierte Zellseparation 14,15 und Pufferaustausch - Anwendungen genutzt werden . 16-18 However, Pufferaustauschleistung bleibt mit ~10-30% Verunreinigung Lösung schlecht wie die getrennten Zellen in der Regel zwischen ursprünglichen und neuen Pufferlösungen an die Grenze dicht bleiben. 16-18 Noch wichtiger ist , hat auf die Größenverteilung von Zielzellen ähnlich sein zu erreichen , präzise Trägheits Fokussierung und Trennung von der ursprünglichen Pufferlösung , die ein Problem insbesondere bei der Verarbeitung von heterogenen großen Zelltypen wie mesenchymalen Stammzellen (MSCs) darstellt. 19 Wir haben bereits eine neue Trägheits Mikrofluidik Zellsortierung Technik bezeichnet Dean Flow Fractionation (DFF) zur Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) 20 und Bakterien 21 aus Vollblut unter Verwendung eines 2-Eingang, 2-Auslass Spiralmikrokanalgerät entwickelt. In diesem Video-Protokoll, werden wir den Prozess der Etikettierung THP-1 (humane akute monozytäre Leukämie-Zelllinie) Suspension monozytären Zellen (~ 15 &amp; mgr; m) und MSCs (10-30 &amp; mgr; m) mit Calcein-l beschreibenoaded NPs, gefolgt von der Herstellung und dem Betrieb der DFF Spiralmikrovorrichtung zur effizienten Rückgewinnung von markierten Zellen und das Entfernen von ungebundenem NPs. 22 Diese einstufigen Reinigungsstrategie ermöglicht eine kontinuierliche Rückgewinnung von markiertem Suspension und haft in frische Pufferlösung ohne Zentrifugation suspendierten Zellen. Darüber hinaus kann es bis zu 10 Millionen Zellen verarbeiten · ml -1, eine Zelldichte zugänglich für die regenerative Medizin - Anwendungen.

<table><tbody><tr><td>Zelllinien & Medien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesenchymale Stammzellen (MSCs)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 Monozytenzellen (THP-1)</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medien</td><td>Lonza</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien & Materialien</stark>0,01</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% Poly-L-Lysin (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Spritze</td><td>BD</td><td>302113</td><td>Spritze 3 ml Luer-Lock</td></tr><tr><td>60 ml Spritze</td><td>BD</td><td>309653</td><td>Spritze 60 ml Luer-Lock</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Biowest</td><td>P6154-100GR</td><td></td></tr><tr><td>Calcein, AM (CAM)</td><td>Life Technologies</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>#P/7507/17</td><td>HPLC Grade 2,5 L</td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-516Q/12</td><td></td></tr><tr><td>Einfache Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>FIS#12-550D</td><td>75 x 25 x 1 mm3</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&reg; 184</td><td></td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>3M</td><td>21200702044</td><td>18 mm x 25 m</td></tr><tr><td>Silica NPs (&sim; 200 &mu; m)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>748161</td><td>Porengröße 4 nm</td></tr><tr><td>Spritzenspitze</td><td>JEC Technology</td><td>7018302</td><td>23 G 0,013 x 0,25</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Schlauch</td><td>Spectra-Teknik</td><td>06419-01</td><td>0,02 x 0,06" 100</td></tr><tr><td>Poly (D,L-Lactid-co-glycolid) (PLGA; 50:50)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191</td><td></td></tr><tr><td>EquipmentBiopsie-Stanze</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Harris Uni-Core</td><td>69036-15</td><td>1,50 mm</td></tr><tr><td>Exsikator</td><td>Scienceware</td><td>111/4 IN OD</td><td></td></tr><tr><td>High-speed Kamera</td><td>Phantom&nbsp;</td><td>V9.1</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Phasenkontrastmikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Reiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Chemyx</td><td>CX Fusion 200</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrofluidik-pufferaustausch für einen störungsfreien micro / nanoparticle zelltechnik

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Engineering-Zellen, die mit wirkstoffbeladenen Mikro- / Nanopartikel (NPs) ist ein zunehmend beliebte Methode nativen therapeutischen Eigenschaften zu verbessern, Bio-Bildgebung ermöglichen und Zell-Phänotyp steuern. Eine kritische noch unzureichend angesprochen Problem ist die beträchtliche Anzahl von Teilchen, die nach der Zellmarkierungs ungebunden bleiben, die nicht leicht durch herkömmliche Zentrifugation entfernt werden kann. Dies führt zu einer Erhöhung der bio Abbildungshintergrundrauschen und transformierende Wirkung auf benachbarte Nicht-Zielzellen vermitteln. In diesem Protokoll präsentieren wir ein Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie bezeichnet als Dean Flow Fractionation (DFF), um effizient markierten Zellen von freien Nanopartikeln in einem hohen Durchsatz Weise trennen. Die entwickelte Spiralmikrovorrichtung ermöglicht eine kontinuierliche Sammlung (&gt; 90% Zell recovery) von gereinigten Zellen (THP-1 und MSCs) in neue Pufferlösung suspendiert, während&gt; 95% Abreicherung von ungebundenen Fluoreszenzfarbstoff zu erreichen oder farbstoffbeladenen NPs (silica oder PLGA). Dieses einstufige, größenbasierte Zellreinigungsstrategie ermöglicht hohe Zellverarbeitungsdurchsatz (10 6 Zellen / min) und ist sehr nützlich für die großvolumige Zelle Reinigung von Mikro- / Nanopartikel - Zellen entwickelt , störungsfreie klinische Anwendung zu erzielen.

Nach der Markierung NPs die Zellen mit Bio - Bildgebungsmittel beladene über Nacht, die markierten Zellen (die freie Teilchen) werden geerntet und gereinigt durch DFF Spirale Mikroeinrichtung zum freien NPs in einem einstufigen Verfahren (1A) zu entfernen. Der 2-Eingang, 2-Auslass Spiralmikrokanal wird durch Engineering-Software entwickelt und mikro Su-8 verwenden. Die strukturierte Silizium - Wafer wird dann als Vorlage für die PDMS Replik Formen mit weichen Lithographi...

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie zu Mikro- / Nanopartikel manipulierten Zellen mit einer effizienten Abbau von nicht gebundenen Partikel zu reinigen.

Mikrofluidik-Pufferaustausch für einen störungsfreien Micro / Nanoparticle Zelltechnik

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine praktische, effiziente und hochdurchsatzfähige mikrofluidische Reinigungstechnologie zur Trennung freier Nanopartikel von Zellen nach der Zellengineering-Behandlung mit Nanopartikeln zu demonstrieren. Der Hauptvorteil dieser Technologie liegt darin, dass ungebundene Nanopartikel nach dem Zellbehandlungsverfahren schnell und effizient entfernt werden können. Nach dem Zellbehandlungsschritt sammeln wir alle unsere ses-fa-tion. Diese mikrofluidische Zellreinigungstechnologie ermöglicht eine effiziente, größenbasierte Trennung aufgrund der unterschiedlichen trägheitsbedingten Fokussierungseffekte von Zellen und Nanopartikeln in einem spiralförmigen Mikrogerät.Es kann bis zu 10 Millionen Zellen pro Mil-Konzentration verarbeiten, was für die regenerative Medizin sowie für die Verarbeitung von Latch-Volumen-Zellen sehr nützlich ist. Diese Technologie ist im Bereich der Zellengineering stark gefragt, wo häufig Nanopartikel zur Markierung von Zellen für bildgebende Verfahren oder zur Funktionskontrolle eingesetzt werden. Die Durchführung des Verfahrens wird Hui Min Tay, eine wissenschaftliche Assistentin aus meinem Labor, sowie Doctor David Yeo, ein Postdoktorand aus dem Labor von Professor Xi, demonstrieren.Kultivieren Sie mesenchymale Stammzellen auf einer 6-Loch-Platte bis zu einer Konfluenz von mehr als 80 %, bevor Sie die Zellen mit den Nanopartikeln markieren. Kultivieren Sie die THP-1-Zellen analog auf eine Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter. Lösen Sie danach ein Milligramm Silica-Nanopartikel in einem Milliliter einer zweihundert Mikromolar starken Kalziumfarbstofflösung auf.Und rühren Sie die Partikel über Nacht. Stellen Sie außerdem PLGA-Calcium-AM-Nanopartikel mit den hier gezeigten Referenzmethoden her. Mischen Sie entweder ein Milligramm der PLGA-Calcium-AM-Nanopartikel oder 150 Mikrogramm der Calcium-Silica-Nanopartikel in einer 0,1%igen Poly-L-Lysin-Lösung in Wasser, indem Sie die Lösung mit einer Pipette eine Minute lang auf- und abpipettieren.Anschießend 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Danach die Nanopartikel zentrifugieren. Den überschüssigen Poly-l-Lysin-Überstand entfernen und die Nanopartikel in einem Milliliter des geeigneten Kulturmediums für den zu markierenden Zelltyp resuspendieren.Geben Sie 1 Milligramm der markierten Nanopartikel pro eine Million Zellen in Kultur zu einem Milliliter Medium hinzu. Pipettieren Sie die Mischung aus Zellen, Nanopartikeln und Medium gründlich für eine Minute. Anschließend inkubieren Sie die Mischung für etwa 24 Stunden.Nach der Markierung dissoziieren und die Stammzellen gewinnen und sie in einer Konzentration von 100.000 bis 1.000.000 Zellen pro Milliliter für die mikrofluidische Verarbeitung resuspendieren. Verwenden Sie markierte THP-1-Zellen in derselben Konzentration. Um die mikrofluidische Spiralvorrichtung herzustellen, bereiten Sie zunächst eine Silikonwafer-Form mit Hilfe standardmäßiger Mikrofertigungstechniken vor.Anschließend 30 Gramm des Basis-PDMS-Präpolymers und drei Gramm eines Härters gründlich in einem Wiegeboot mischen. Die Mischung 60 Minuten unter Vakuum entgasen, um Luftblasen zu entfernen. Das PDMS-Gemisch vorsichtig auf die Negativform, die mit dem spiralförmigen Kanaldesign strukturiert ist, bis zu einer Höhe von fünf bis 10 Millimetern gießen.Anschließend entgasen Sie die Mischung 60 Minuten lang, um Luftblasen zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Blasen beseitigt sind. Danach platzieren Sie das Wafer in einem Ofen und stellen sicher, dass das Wafer während der Aushärtung nicht geneigt ist, um eine konstante Bauelementhöhe zu gewährleisten.Härten Sie das PDMS bei 80 Grad Celsius für zwei Stunden aus. Nach dem Abkühlen schneiden Sie das spiralförmige PDMS-Gerät mit einem Skalpell aus und lösen vorsichtig die PDMS-Scheibe von der Negativform. Anschließend trimmen Sie mit einem Skalpell die Ränder des Geräts, um eine glatte Oberfläche für die Verbindung sicherzustellen.Verwenden Sie anschließend eine 1,5 mm große Biopsiepunch, um zwei Löcher für die Zulauföffnungen und zwei Löcher für die Ablauföffnungen zu erstellen. Spülen Sie das Gerät mit Isopropanol, um Rückstände zu entfernen, und trocknen Sie es fünf Minuten lang in einem 80 °C heißen Ofen.Verwenden Sie dann Klebeband, um die Unterseite des PDMS-Geräts und eine Seite eines Objektträgers zu reinigen. Platzieren Sie den Objektträger und das PDMS-Gerät vorsichtig in eine Plasma-Kammer, wobei die gereinigten Oberflächen nach außen zeigen. Schalten Sie die Plasma-Leistung auf Maximum, senken Sie den Druck in der Kammer, bis diese rosa gefärbt erscheint, und belichten Sie die Komponenten 60 Sekunden lang. Entfernen Sie dann die Objektträger und die PDMS-Vorrichtung aus der Kammer und verbinden Sie sie, indem Sie die plasmabehandelten Oberflächen fest miteinander pressen. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen zwischen den beiden Oberflächen eingeschlossen sind.Erhitzen Sie das verbundene Gerät zwei Stunden lang auf einer Heizplatte, die auf 80 Grad Celsius eingestellt ist, um die Verbindung zu verstärken. Schneiden Sie zwei Tubing-Stücke mit einer Länge von 15 bis 20 Zentimetern für die Zulauföffnungen zu und befestigen Sie an einem Ende jedes Schlauchs eine 23-Gauge-Nadel. Schneiden Sie anschließend zwei weitere Stücke des gleichen Tubings mit einer Länge von fünf bis 10 Zentimetern für die Auslässe zu und verbinden Sie sie mit den Ablauföffnungen des Geräts.Bevor die Probe durchgeführt wird, spülen Sie das Gerät manuell mit einer Spritze, die 70 % Ethanol enthält, bis es aus der Auslassleitung austritt. Lassen Sie das Ethanol mindestens 30 Sekunden im Gerät verbleiben, um es zu sterilisieren. Danach füllen Sie 30 Milliliter gefiltertes PBS mit 1 % BSA in eine 60-Milliliter-Spritze. Außerdem drei Milliliter markierter Zellen in eine Drei-Milliliter-Spritze füllen und prüfen, ob sich in keiner der Spritzen Luftblasen befinden. Eventuelle Luftblasen entfernen, indem man vorsichtig einige Tropfen Flüssigkeit aus der Düse ausstößt. Die Einlass-Spritzenaufsätze und Schläuche an den Spritzen anschließen und die Spritzen an den Spritzenpumpen befestigen.Setzen Sie die Röhrchen in die entsprechenden Anschlüsse des Geräts ein und stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in den Schläuchen befinden. Nachdem die Fluidik eingerichtet ist, befestigen Sie das Gerät an einem invertierten Phasenkontrastmikroskop, um während des Zellsortierprozesses Echtzeit-Aufnahmen zu machen. Stellen Sie einen kleinen Abfallbecher sowie zwei 15-Milliliter-Röhrchen in der Nähe des Geräts auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie die Auslassschläuche beider Geräteausgänge in den Abfallbecher. Stellen Sie nun das Flussverhältnis von Probe zu Umhüllungspuffer auf eins zu 10 ein, indem Sie die Flussrate der Probenspritze auf 120 Mikroliter pro Minute und die Umhüllungsspritze auf 1.200 Mikroliter pro Minute einstellen. Betreiben Sie das Gerät eineinhalb Minuten lang, um den Flussraten die Möglichkeit zu geben, sich zu stabilisieren.Verwenden Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera, um das Vorhandensein inertial fokussierter Zellen nahe der inneren Kanalwand im Hellfeld mit Phasenkontrast zu bestätigen. Sobald ein stationärer Fluss erreicht ist und das Gerät korrekt läuft, positionieren Sie die Auslassröhrchen in verschiedene Gefäße, um getrennte Eluate aus Zellen-Auslass und Abfall-Auslass zu sammeln. Dieses Gerät ist in der Lage, eine markierte Suspension von THP-1-monozytären Zellen korrekt von fluoreszierenden Silica-Nanopartikeln zu trennen.Hohe Trennleistungen wurden bestätigt durch Hochgeschwindigkeitsaufnahmen und Durchflusszytometrie-Analyse. Die einstufige Reinigungsstrategie ermöglicht die kontinuierliche Gewinnung einer markierten Suspension und adhärenter Zellen, die in frischer Pufferlösung suspendiert sind, ohne Zentrifugation erforderlich zu machen. Das Gerät ist in der Lage, mit Silica- und PLGA-Nanopartikeln eine Trennung mit hoher Effizienz durchzuführen und bis zu 10 Millionen Zellen pro Milliliter mit derselben hohen Effizienz zu trennen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Zellen mit Nanopartikeln markiert werden können und wie die markierten Zellen gereinigt werden, indem überschüssige, nicht gebundene Partikel mit unserem speziellen mikrofluidischen Gerät entfernt werden.

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