Mikrofluidik-Pufferaustausch für einen störungsfreien Micro / Nanoparticle Zelltechnik

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine komfortable, effiziente und hochdurchsatzfähige mikrofluidische Aufreinigungstechnologie zu demonstrieren, um freie Nanopartikel aus Zellen zu trennen, indem das Zell-Engineering mit den Nanopartikeln durchgeführt wird. Das Hauptbedürfnis dieser Technologie besteht darin, eine schnelle und effiziente Entfernung von ungebundenen Nanopartikeln zu ermöglichen. Nach dem Zellbearbeitungsverfahren sammeln wir alle unsere Ses-fa-tionen. Diese mikrofluidische Zellreinigungstechnologie erreicht eine effiziente größenbasierte Trennung aufgrund der unterschiedlichen Trägheitsfokussierungseffekte von Zellen und Nanopartikeln in einem spiralförmigen Mikrogerät.

Es kann bis zu 10 Millionen Zellen pro mil Konzentration verarbeiten, was sowohl für die regenerative Medizin als auch für die Verarbeitung von Latch-Volumenzellen sehr nützlich ist. Diese Technologie ist sehr gefragt für den Bereich der Zelltechnik, bei dem häufig Nanopartikel zur Arbeit von Zellen verwendet werden, für Bildgebungszwecke oder zur Funktionskontrolle. Das Verfahren wird von Hui Min Tay, einem Forschungsassistenten aus meinem Labor, sowie von Dr. David Yeo, einem Postdoktoranden aus dem Labor von Professor Xi, demonstriert.

Kultivieren Sie mesenchymale Stammzellen mit einer Konfluenz von mehr als 80 % auf einer Sechs-Well-Platte, bevor die Zellen mit den Nanopartikeln markiert werden. In ähnlicher Weise kultivieren Sie THP-1-Zellen mit einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter. Als nächstes lösen Sie ein Milligramm Siliziumdioxid-Nanopartikel mit einem Milliliter zweihundert mikromolare Calciumfarbstofflösung auf.

Und rühren Sie die Partikel über Nacht um. Stellen Sie außerdem PLGA-Calcium-AM-Nanopartikel mit Methoden her, die in der hier gezeigten Referenz beschrieben sind. Mischen Sie entweder ein Milligramm der PLGA-Calcium-AM-Nanopartikel oder 150 Mikrogramm der Calcium-Silica-Nanopartikel in 01%iger Poly-L-Lysin-Lösung in Wasser, indem Sie die Lösung eine Minute lang auf und ab pipettieren.

Und dann 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Nanopartikel. Entfernen Sie den überschüssigen Poly-L-Lysin-Überstand und suspendieren Sie die Nanopartikel in einem Milliliter des für den zu markierenden Zelltyp geeigneten Kulturmediums.

Geben Sie 1 Milligramm der markierten Nanopartikel zu einem Milliliter Medium für jeweils eine Million Zellen in Kultur. Pipettieren Sie die Mischung aus Zellen, Nanopartikeln und Medium eine Minute lang gründlich. Und dann die Mischung etwa 24 Stunden lang inkubieren.

Nach der Markierung dissoziieren und ernten Sie die Stammzellen und suspendieren sie wieder auf eine Konzentration zwischen 100.000 und 1.000.000 Zellen pro Milliliter für die mikrofluidische Verarbeitung. Verwenden Sie markierte THP-1-Zellen in der gleichen Konzentration. Um die mikrofluidische Spiralvorrichtung herzustellen, bereiten Sie zunächst eine Silikonwafer-Masterform unter Verwendung von Standard-Mikrofabrikationstechniken vor.

Mischen Sie dann 30 Gramm des Basis-PDMS-Prepolymers und drei Gramm eines Härters gründlich in einer Waage. Entgasen Sie das Gemisch 60 Minuten lang unter Vakuum, um alle Luftblasen zu entfernen. Gießen Sie die PDMS-Mischung vorsichtig bis zu einer Höhe von fünf bis 10 Millimetern auf die Urform, die mit dem Spiralkanal-Design versehen ist.

Entgasen Sie die Mischung dann 60 Minuten lang, um alle Luftblasen zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Blasen entfernt sind. Legen Sie dann den Wafer in einen Ofen und stellen Sie sicher, dass der Wafer während des Aushärtens nicht gekippt wird, um eine konstante Gerätehöhe zu gewährleisten.

Härten Sie das PDMS zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius aus. Nach dem Abkühlen die PDMS-Spiralvorrichtung mit einem Skalpell ausschneiden und die PDMS-Platte vorsichtig aus der Urform schälen. Schneiden Sie dann mit einem Skalpell die Kanten des Geräts ab, um eine glatte Oberfläche für die Verklebung zu gewährleisten.

Verwenden Sie als Nächstes einen 1,5-Millimeter-Biopsiestanzer, um zwei Löcher für die Einlässe und zwei Löcher für die Auslässe zu erstellen. Waschen Sie das Gerät mit Isopropanol, um Schmutz zu entfernen. Und trocknen Sie das Gerät fünf Minuten lang in einem 80 Grad heißen Ofen.

Reinigen Sie dann mit Kreppband die Unterseite des PDMS-Geräts und eine Seite eines Objektträgers. Platzieren Sie den Objektträger und das PDMS-Gerät vorsichtig in einer Plasmakammer, wobei die sauberen Oberflächen freiliegen. Schalten Sie die Plasmaleistung auf Maximum ein, senken Sie den Kammerdruck, bis die Kammer rosa wird, und belichten Sie die Komponenten 60 Sekunden lang.

Entfernen Sie dann den Objektträger und das PDMS-Gerät aus der Kammer. Und verbinden Sie sie, indem Sie die plasmaexponierten Oberflächen fest zusammendrücken. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen zwischen den beiden Oberflächen eingeschlossen sind.

Erhitzen Sie das verklebte Gerät auf einer auf 80 Grad Celsius eingestellten Heizplatte zwei Stunden lang, um die Verbindung zu stärken. Schneiden Sie zwei 15 bis 20 Zentimeter lange Schläuche für die Einlässe ab und befestigen Sie eine 23-Gauge-Nadel an einem Ende jedes Schlauchs. Schneiden Sie dann zwei Stücke desselben Schlauchs mit einer Länge von fünf bis 10 Zentimetern für die Auslässe ab und befestigen Sie sie an den Auslasslöchern des Geräts.

Bevor Sie die Probe durchführen, entleeren Sie das Gerät manuell mit einer Spritze mit 70 % Ethanol, bis es aus dem Auslassschlauch fließt. Lassen Sie das Ethanol mindestens 30 Sekunden lang im Gerät einwirken, um es zu sterilisieren. Laden Sie dann 30 Milliliter gefiltertes PBS mit 1 % BSA in eine 60-Milliliter-Spritze.

Laden Sie außerdem drei Milliliter markierter Zellen in eine Drei-Milliliter-Spritze und prüfen Sie, ob keine Luftblasen in einer der Spritzen eingeschlossen sind. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie vorsichtig ein paar Tropfen Flüssigkeit aus der Düse ausstoßen. Verbinden Sie die Spritzenspitzen und den Schlauch mit den Spritzen und befestigen Sie die Spritzen an den Spritzenpumpen.

Führen Sie die Schläuche in die entsprechenden Einlässe des Geräts ein und stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen entlang des Schlauchs befinden. Wenn die Fluidik nun eingerichtet ist, montieren Sie das Gerät auf ein inverses Phasenkontrastmikroskop, um während des Zellsortierprozesses eine Echtzeit-Bildgebung zu ermöglichen. Befestigen Sie einen kleinen Abfallbecher und zwei 15-Milliliter-Röhrchen in der Nähe des Gerätes auf dem Mikroskoptisch.

Stecken Sie den Auslassschlauch aus beiden Auslässen des Geräts in das Becherglas. Stellen Sie nun das Flussverhältnis zwischen Probe und Schleusenpuffer auf eins bis 10 ein, indem Sie die Flussrate der Probenspritze auf 120 Mikroliter pro Minute und die der Schleusenspritze auf 1.200 Mikroliter pro Minute einstellen. Lassen Sie das Gerät eineinhalb Minuten lang laufen, damit sich die Durchflussrate stabilisieren kann.

Verwenden Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera, um das Vorhandensein von trägheitsfokussierten Zellen in der Nähe der Kanalinnenwand unter Hellfeld mit Phasenkontrast zu bestätigen. Sobald ein stationärer Fluss erreicht ist und das Gerät ordnungsgemäß läuft, positionieren Sie die Auslassröhrchen in verschiedenen Fläschchen, um separate Eluenten aus dem Zellauslass und dem Abfallauslass zu sammeln. Dieses Gerät ist in der Lage, eine markierte Suspension von monozytären THP-1-Zellen aus fluoreszierenden Siliziumdioxid-Nanopartikeln korrekt zu sortieren.

Es wurden hohe Trennwirkungsgrade erzielt, die sowohl durch Hochgeschwindigkeits-Bildgebung als auch durch Durchflusszytometrie-Analysen bestätigt wurden. Die einstufige Aufreinigungsstrategie ermöglicht die kontinuierliche Rückgewinnung einer markierten Suspension und adhärenter Zellen, die in frischer Pufferlösung suspendiert sind, ohne dass eine Zentrifugation erforderlich ist. Das Gerät ist in der Lage, sowohl mit Siliziumdioxid- als auch mit PLGA-Nanopartikeln hocheffizient zu trennen und kann bis zu 10 Millionen Zellen pro Milliliter mit dem gleichen hohen Wirkungsgrad trennen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen mit Nanopartikeln markiert. Und wie man die markierten Zellen reinigt, indem man überschüssige ungebundene Partikel mit unserem speziellen mikrofluidischen Gerät entfernt.