Ein magnetischer Nanopartikel-basierter Immunoassay mit einem mikrofluidischen Gerät

Nehmen Sie eine mikrofluidische Vorrichtung, die an einem Mikroskoptisch befestigt ist und einen Einlass zum Dosieren von Reagenzien, miteinander verbundene Kanäle für den Flüssigkeitsfluss und Auslässe zum Spülen der Flüssigkeiten umfasst.

Der Hauptkanal enthält eine zentrale gestaffelte Restriktion mit eingeschlossenen aggregierten Eisenmikropartikeln.

Die Kanäle werden mit einer Blockierungslösung inkubiert, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Lassen Sie einen Waschpuffer fließen und entfernen Sie überschüssige Blocklösung.

Führen Sie eine Immunkomplexsuspension mit einer definierten Flussrate ein. Der Immunkomplex besteht aus magnetischen Nanopartikeln, die mit Antigenen beschichtet sind, die an Primärantikörper gebunden sind, die wiederum an Peroxidase-konjugierte Sekundärantikörper gebunden sind.

Wenden Sie ein externes Magnetfeld an, das die aggregierten Mikropartikel magnetisiert und sie in eine magnetische Falle zum Einfangen der Immunkomplexe umwandelt.

Führen Sie ein fluorogenes Substrat ein, das von der Peroxidase in ein fluoreszierendes Produkt umgewandelt wird und durch die Falle fließt.

Vergleichen Sie mit dem Mikroskop die Fluoreszenz vor und nach der Falle, um den Einfang von Immunkomplexen zu bestätigen.

Füllen Sie die Kanäle mit einer Spritze mit destilliertem Wasser. Tauchen Sie das Gerät 10 Minuten lang in ein Ultraschallbad. Leeren Sie dann das Wasser in den Gerätekanälen und verwenden Sie eine Spritze, um 5%ige BSA-Lösung einzuführen.

Bereiten Sie eine Suspension aus Eisenmikropartikeln mit einem Durchmesser von 7,5 Mikrometern in 5 % BSA vor. Inkubieren Sie den Chip und die Mikropartikelsuspension mindestens 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit der Blockierungslösung. Führen Sie anschließend die Mikropartikel mit einer Spritzennadel durch den Seitenkanal-Auslassschlauch in den Chip ein.

Platzieren Sie den Chip vertikal und drehen Sie ihn dann in zwei Schritten von 90 Grad, so dass die Mikropartikel bei der 5-Mikrometer-Beschränkung ankommen und sich verdichten. Versiegeln Sie alle Schläuche des Acrylgeräts mit Hitze. Schneiden Sie den Zulaufschlauch ab, bis nur noch wenige Millimeter übrig sind.

Füllen Sie die Dosiernadel mit Waschpuffer und führen Sie ihn in den geschnittenen Schlauch ein. Lassen Sie die Lösung tropfen und verbinden Sie dann die Nadel mit dem Gerät. Schneiden Sie den Auslassschlauch aus dem seitlichen Kanal ab und schließen Sie ihn dann an die Spritzenpumpe an. Wiederholen Sie anschließend den gleichen Vorgang für den Hauptkanalauslassschlauch und befestigen Sie dann den Chip am Magneten.

Für den Immunnachweis lassen Sie den Waschpuffer 10 Minuten lang bei 50 Mikrolitern pro Stunde fließen. Entfernen Sie den restlichen Waschpuffer mit einer Mikropipette von der Dosiernadel und fügen Sie 50 Mikroliter der Nanopartikelsuspension hinzu. Lassen Sie die Nanopartikelsuspension 7 Minuten lang mit einer Durchflussrate von 100 Mikrolitern pro Stunde fließen. Ändern Sie dann die Durchflussrate auf 50 Mikroliter pro Stunde und setzen Sie den Durchfluss für weitere 15 Minuten fort.

Wechseln Sie die Dosiernadel und lassen Sie den Waschpuffer 10 Minuten lang mit der gleichen Geschwindigkeit laufen. Entfernen Sie den restlichen Waschpuffer mit einer Mikropipette von der Dosiernadel und fügen Sie 100 Mikroliter des fluorogenen Substrats hinzu. Passen Sie die Durchflussrate und die Zeitparameter für die Substrateingabe, die Fluoreszenzmessung und den Waschschritt an.

Aktivieren Sie den Eingangsfluss des fluorogenen Substrats für 6 Minuten bei 50 Mikrolitern pro Stunde. Schalten Sie 15 Sekunden vor dem Stopp des Substratflusses die Fluoreszenz des Mikroskops ein. Starten Sie die Bilderfassung mit der Software der Mikroskopkamera 10 Sekunden vor dem Stopp des Substrats mit einer Belichtungszeit von 1.000 Millisekunden

Klicken Sie auf die Startschaltfläche des gewünschten Durchflussparameters unmittelbar nach Beendigung der Substratwäsche. Führen Sie die Bildgebung 6 Minuten lang mit einem Bild pro Sekunde durch. Klicken Sie auf die Startschaltfläche des Waschflusses, unmittelbar nachdem der ausgewählte Messfluss gestoppt wurde.