Name: Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T18:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Lernen Sie die Dielektrophorese zur kontaktlosen Manipulation und Trennung von Zellen und Beads in mikrofluidischen Systemen mit gedruckten Leiterplatten. Diese Methode ermöglicht präzise Partikelsteuerung.

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Wir drücken Wertschätzung Woo-Jin Chang für die Bereitstellung der trifurcating Kanäle für DEP Betätigung und Mitchell Collens für seine Unterstützung bei Geräten einzurichten. Die Arbeit wurde von der US NSF wurde durch den Grant OISE-0951647 und Taiwan NSC durch den Grant 99-2911-1-002-007 unterstützt.

Eine allgemeine Darstellung der Geräte-Setup ist in Abbildung 1A dargestellt. Die PCB-Probe Montage wird in einem Querschnitt schematisch in Abbildung 1B beschrieben. 1. Vorbereitung PCB-Elektroden: <ol><li> Design-PCB-Elektroden, um die gewünschte Geometrie zu einer ungleichmäßigen elektrischen Feld zu erzeugen. Customized PCB Elektrode Chips können durch kommerzielle Fertigungseinrichtungen (Abbildung 1C) bestellt werden. </li><li> Bereiten Sie vorgefertigte Platine Elektroden durch Löten 16-Gauge-Kabel an das Ende jeder gedruckten Metallelektrode (Abb. 1D). <ol><li> Legen Sie den Draht auf das Ende der Elektrode. Halten Sie den Draht in Platz auf dem Metall-Bereich der PCB mit dem heißen Lötkolben den Draht erhitzen. </li><li> Füttern Sie eine kleine Menge von Lot in den erhitzten Draht um den Draht mit Lot füllen. </li><li> Nachdem der Draht mit Lötzinn gefüllt ist, entfernen Sie den Lötkolben und hält den Draht am Platz, während das Lot abkühlt. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie den Lötprozess für jede elektrische Verbindung auf der Platine (Abbildung 1D). </li></ol> 2. Bereiten Mikrofluidikkanälen: <ol><li> Polydimethylsiloxan (PDMS)-basierten mikrofluidischen Kanälen werden unter Verwendung der PDMS-Elastomer, Sylgard 184 von Dow Corning. Ein Master-Form, die die Kanäle definiert ist in der Regel über Standard-Mikrofabrikation Prozesse mit einem Silizium-Wafer und SU-8 Fotolack erzeugt. </li><li> Mix Basiscompound zu Härter in einem Verhältnis von 10:1 für 5 Minuten. </li><li> Gießen Sie die Flüssigkeit PDMS auf den vorgefertigten SU-8 Master-Form, und entfernen Sie Luftblasen indem flüssige PDMS für ein paar Minuten Vakuum. Wiederholen Sie die Vakuum-Verfahren bei Bedarf vollständig zu entfernen alle Blasen. </li><li> Cure die PDMS bei 70 ° C für 2 Stunden. </li><li> Entfernen PDMS-Stempel mit mikrofluidischen Kanälen aus dem Wafer mit einer Rasierklinge, vorsichtig zu Wafer brechen. </li><li> Lochung für die Einführung von Flüssigkeiten und Zellen in den mikrofluidischen Gerät. (Hinweis: Spritze Pumpen, Schwerkraft oder Oberflächenspannung Basis fließen kann alle mit DEP verwendet werden.) </li><li> Überprüfen Sie die Mikrofluidikvorrichtung zu gewährleisten, ist es frei von Staub und Schmutz. Reinigung des PDMS kann leicht erreicht werden mit 3M Scotch Magic Tape. </li><li> Plasma Bindung der PDMS mikrofluidischen Kanälen, um eine saubere Nr.0 Dicke (80-130 um) Deckglas. Erhitzen Sie das Deckglas-mikrofluidischen Montage bei 100 ° C für mindestens 15 min. </li></ol> 3. Bereiten Sie Medien mit geringerer Leitfähigkeit: <ol><li> Medien mit geringerer Leitfähigkeit wird durch Mischen von 8,5% Sucrose + 0,3% Glukose (w / v) in deionisiertem Wasser (DI). 1 Hinweis:. Wir haben bereits gezeigt, dass Zellen für Tage in konventionellen Zellkulturmedien kultiviert werden können, nachdem sie auf niedrige Leitfähigkeit für kurze Zeit (ca. 30 min) ausgesetzt 11 </li></ol> 4. Montieren Microfluidic Kanäle auf PCB-Elektroden: <ol><li> Legen Sie eine kleine Menge (ca. 10 l) von Mineralöl auf der Leiterplatte, um engen Kontakt zwischen der Leiterplatte und das Deckglas zu gewährleisten. Hinweis: Ein optionaler Schritt zur Verringerung Elektrode Visualisierung ist die Beschichtung der Oberfläche der Leiterplatte mit einer sehr dünnen Schicht von schwarzen Permanent-Marker oder Farbe. </li><li> Legen Sie die Deckglas-mikrofluidischen Kanal Montage auf der geölten PCB, mit Deckglas bildet Kontakt mit dem Öl (Deckglas nach unten). Drücken Sie das Deckglas-mikrofluidischen Montage auf einen guten Kontakt zu gewährleisten und Luftblasen, die aus der Zelle und Bead-Visualisierung beeinträchtigen können zu minimieren. Ein Beispiel für die fertige Gerät ist in Abbildung 1D gezeigt. </li></ol> 5. Sortieren und Concentrate Beads und Zellen mit DEP: <ol><li> Füllen Sie den mikrofluidischen Kanälen mit DI-Wasser oder Medien mit geringerer Leitfähigkeit, die Plasma-Bonding-Verfahren ermöglicht die einfache Beladung von wässrigen Lösungen in den mikrofluidischen Kanälen vorübergehend machen die normalerweise hydrophoben PDMS-Oberfläche hydrophil. </li><li> Einführung Zellen und / oder Polystyrol-Kügelchen in den Kanal Reservoir (Abbildung 1C). Hier verwenden wir die menschliche Kolonadenokarzinom (HT-29)-Zellen. </li><li> Verbinden Sie den Ausgang eines Funktionsgenerators an den Eingang eines AC-Endstufe, dann verbinden Sie den Ausgang des Verstärkers an die Elektrode Drähte. Decken Sie alle elektrischen Leitungen und Oberflächen des Setup mit Isolierband um Benutzer aus der möglichen Exposition gegenüber Schock zu schützen. Eine schematische Darstellung der Geräte-Setup ist in Abbildung 1A dargestellt. </li><li> Stellen Sie den Funktionsgenerator auf eine Sinus-Ausgang von 1,0-1,5 MHz zu erzeugen. Die Amplitude der Ausgabe sollte für den HF-Leistungsverstärker angepasst werden, um eine Leistung von 80-100V auf die Leiterplatte zu produzieren. Die HF-Leistungsverstärker in dieser Arbeit erfordert eine Eingangsspannung um 220-330 mV. Zur Abtrennung von Zellen und Perlen, muss der Laminar-Flow-Rate-kompatibel sein mit der DEP Kraft auf die Zellen und Perlen in den Hauptkanal (Breite w = 100 pm, Höhe h = 27 um) in die Ziel-Kanäle (Breite w = 100 pm bewegen , Höhe h = 27 um). Achtung: bitte mit Leiterplatten-Hersteller, die m bestimmenaximale Betriebsspannungen zu vermeiden, Themen wie PCB Überhitzung oder Schmelzen. Überprüfen Sie die Geräte-Hersteller die Spezifikationen für die Funktion Generator und Leistungsverstärker Hersteller sicheren Betriebszustand Einstellungen bestimmen. </li><li> Initiieren Sie DEP zu sortieren Zellen und Perlen. Cells Erfahrung positiv-DEP während Polystyrol-Kügelchen negativ-DEP Erfahrung in einer ungleichmäßigen elektrischen Feldes innerhalb des angegebenen Frequenzen. Dies ermöglicht DEP-Kraft-activated bioactuation und Trennung von Zellen und anderen Partikeln in mikrofluidischen Systemen mit erschwinglichen und wiederverwendbare PCBs als Elektroden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Wenn DEP effektiv ist bei Betätigung Zellen oder Partikeln, ist eine robuste Ausrichtung innerhalb ungleichmäßige elektrische Felder für statische Bäder oder langsame Strömungsgeschwindigkeiten beobachtet. Unter den Bedingungen der höheren Strömungsgeschwindigkeiten, hängt die Zelle oder Partikel Verhalten auf die relative Orientierung der axialen Strömung um das elektrische Feld und die Strömungsgeschwindigkeit. Darüber hinaus sind die Zell-und Partikel-Verhalten auch abhängig von der elektrischen Feldstärke und der Grad der Uneinheitlichkeit im elektrischen Feld. Typische Verhaltensweisen von Zellen oder Partikel enthalten "Perlenketten", Radfahren, ins Stocken geraten, oder Drehen. Bedingungen, die Kompromisse oder aufzuheben DEP die Anwesenheit von Salzen oder anderen ionischen Moleküle in der Flüssigkeit, schwache elektrische Feldstärke, übermäßiger Strömungsgeschwindigkeiten, Deckgläser, die zu dick sind, oder leitende Lösungen zwischen dem Deckglas und PCB-Elektroden sind (z. B. eine gesprungene Deckglas induzieren können das Mischen von Wasser und Mineralöl). Hier bei der Verwendung von Nr.0 Dicke Deckgläser (80-130 um) und einem Elektrodenabstand von (231 Mikrometer), wandte die Steigung von dem Quadrat der elektrischen Feldstärke, die HT-29 Zellen und Perlen wird geschätzt, dass zwischen 2 werden -8 bis 6 -8 V 2 / um3. 1 Die DEP Kraft kann durch die Messung der Geschwindigkeit des Teilchens, von DEP in statische Flüssigkeit (Abbildung 2A-B) manipuliert geschätzt werden. Aufgrund der geringen Trägheit der Partikel-und hochviskosen Umgebung von mikrofluidischen Kanal wird die hydrodynamische Widerstandskraft gleich, aber in entgegengesetzter Richtung mit der DEP Kraft. Die durchschnittliche bead Geschwindigkeit in der Medien mit geringerer Leitfähigkeit beträgt 34,5 mu m / s mit DEP Spannung von 93 Vpp und 1,5 MHz. Der hydrodynamische Widerstandskraft kann mit folgender Formel berechnet werden. 1 F ziehen = 6πηRv Die durchschnittliche Viskosität η der Medien mit geringerer Leitfähigkeit bei 20 ° C beträgt 1,27 mPa • s und der Wulst Radius R beträgt 7,5 um. Der hydrodynamische Widerstandskraft für die Polystyrol-Mikrokügelchen wird geschätzt auf 6,19 pN werden. Zur Demonstration der Fähigkeit, Kugeln in mikrofluidischen Kanälen betätigen (Abbildung 2C-F), starteten wir den Fluss der Medien mit geringerer Leitfähigkeit durch den Einsatz von Oberflächenspannung vermittelten fließen. Die durchschnittliche bead Geschwindigkeit im Eingangskanal wurde 1540 um / sec, während die durchschnittliche Geschwindigkeit innerhalb der einzelnen Kanäle bis 565 mu m / sec (Abbildung 2C) reduziert wurde. Durch die Initiierung von DEP wurden die Perlen in den zentralen Kanal und nicht in den Seitenkanal veröffentlicht beibehalten. So unter diesen Bedingungen wurden die DEP Kräfte ausreichen, um die Widerstandskraft der Flüssigkeit in den beiden seitlichen Kanälen zu überwinden. Das gleiche Prinzip wurde auch verwendet, um die Perlen aus dem zentralen cannel auf einer einzigen Seite Kanal umzuleiten durch einfache Änderung der Ausrichtung der Kanäle und der Wulst flow, dass der DEP-Elektroden (Abbildung 2E-F). Durch Anwinkeln der Metallelektrode auf der Seite der einzelnen Einlasskanal, wenn DEP initiiert wurde, wurden die Perlen an der Seite des Kanals geführt, wie die Perlen näherte sich dem Trifurkation Punkt. Dort wurden die DEP Kräfte ausreichen, um die Kügelchen in einem der seitlichen Kanälen, in denen der laminaren Strömung weiter, sie treiben durch den Kanal (Abbildung 2F) zu ziehen. Da Zellen und Polystyrol-Kügelchen deutliche Unterschiede in ihrer Fähigkeit, polarisiert werden und betätigt in ungleichmäßigen elektrischen Felder haben, verwenden wir DEP auf die Fähigkeit, die On-Chip-Trennung von Zellen und Perlen, gleichzeitig durchführen zu demonstrieren. Wir verwendeten das gleiche mikrofluidischen Kanal Struktur und PCB-Elektroden, wie in Abbildung 2E-F konfiguriert, aber führte eine Aussetzung der HT-29 Zellen und Perlen in Medien mit geringerer Leitfähigkeit in den einzelnen Einlasskanal (Abbildung 3). Wenn DEP wird eingeführt, und unter diesen Bedingungen, die HT-29 Zellen wurden in den beiden linken Ausgangskanäle beibehalten, während die Perlen in den einzelnen Ausgangskanal auf der rechten Seite beibehalten wurden. Hier werden die Zellen zeigen eine charakteristische "Perle-Verkettung Verhalten, wie sie in der linken Ausgangskanal gesammelt werden. Gelegentlich wird ein Wulst und Zelle werden gemeinsam, in denen sie zusammen sind, gesammelt oft in der Zelle Ausgangskanäle angeschlossen. Aus diesem Experimental Daten ermitteln wir die Sortierung Rate auf 713 Partikel (Zellen und Beads) pro Minute, oder den Gegenwert von 14.260 Zellen und Beads in 20 Minuten. Die Anzahl der Zellen und Perlen abgerufen relevant und nützlich für die Molekularbiologie, bildgebende, biochemische und Lab-on-a-chip-Anwendungen. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. PCB-basierte DEP von Zellen und Partikeln in mikrofluidischen Kanälen. (A) Die Ausrüstung Setup für DEP-basierten Ansteuerung mit einem Funktionsgenerator beginnt die Frequenz und Amplitude des elektrischen Signals zu definieren, dann einen Leistungsverstärker zur Steigerung der Signalstärke des elektrisches Feld auf der Platine erzeugt. (B) Die Mikrofluidikvorrichtung Montage für die Probenvorbereitung Betätigung besteht aus PDMS mikrofluidischen Kanälen irreversibel zu einem nicht gebunden. 0 Dicke Deckglas (80-130 um) durch Sauerstoff-Plasma, nicht leitenden Medien, um zu baden den Zellen und / oder Perlen. (C) Die PCB-Elektroden verwendet hier bestehen aus zwei Regionen, in denen die Elektroden verzahnt, um eine starke nicht-homogenes elektrisches Feld zu erzeugen. (D) Die fertige Gerät: ein PCB mit einer trifurcated Mikrofluidikvorrichtung auf einem einzigen Deckglas, zeigt Einsatz das ganze Gerät mit Elektrodendrähte. (CD) Für Maßstab, sind PCB-Messungen 8,4 cm (l), 2,1 cm (w), mit 5 mm breiten Elektroden. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Repräsentative Bilder von Zellen und Perlen in Kanälen vor und während der DEP Betätigung. (A) 15 um fluoreszierende Polystyrolkügelchen in Medien mit geringerer Leitfähigkeit Lösung innerhalb eines PDMS mikrofluidischen Kanal, ohne Laminar-Flow-(Zeit verstrichen, 1,23 sec). (B) Nach DEP Initiation, die Perlen auf die PCB-Elektrode Muster (schwarze Streifen), anstatt zwischen den Elektroden (Zeit verstrichen, 8.18 sec) zu migrieren. (C) Perlen in den gleichen Kanälen unter Laminar-Flow zwischen den drei getrennte Kanäle (Zeit verstrichen, 5,3 sec) unterteilt, und wenn DEP eingeleitet wird (D), die Perlen werden betätigt, um nur fließen in den zentralen Kanal (Zeit verstrichen, 4,3 sec). (E) Durch die Änderung der Ausrichtung der Kanäle zu den PCB-Elektroden können Perlen differentiell in den seitlichen Kanälen (F) mit DEP als den zentralen Kanal wie in (D) gezeigt, gerichtet werden. (EF) Abgelaufene Zeit ist 8.23 ​​sec und 5,16 sec, bzw.. Alle Maßstabsbalken = 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Repräsentative Bilder von Zellen und Perlen in Kanälen vor und während der DEP Betätigung. (AB) Vor Beginn der DEP, eine gemischte Lösung von humanen Kolon-Adenokarzinom (HT-29)-Zellen und Perlen-Flow aus einem Kanal auf 3 separate Ausgänge. Der offene Pfeil kennzeichnet die Richtung der laminaren Strömung und Kanäle mit gestrichelten Linien zur Orientierung und Klärung skizziert. (CD), indem DEP, sind Perlen und Zellen selektiv in einzelne Kanäle angesteuert als identifiziert. HT-29-Zellen verlassen den zentralen und linken Kanal, während Perlen Ausfahrt den rechten Kanal. Charakteristisch Perle Verkettung von Perlen und Zellen während der DEP Betätigung beobachtet. (A, C) Differential Interference Contrast Bildgebung von Zellen und Perlen in Mikrokanälen macht die Perlen gut sichtbar. Glow Skala Intensität Bilder (B, D) aus dem gleichen DIC Bilder (A, C) die Verbesserung der Visualisierung von Zellen in den Kanälen. Die reflektierende Metall-Elektroden ((A, C) hellen Streifen und (B, D) gelb und grün) bieten ein markantes Wahrzeichen für die Ausrichtung Mikrokanälen an die Elektroden für eine effektive DEP-basierte Betätigung. Maßstabsbalken = 100 um.

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</ol>

Zellmanipulation in mikrofluidischen Systemen für die Sortierung oder selektiven Platzierung von einzelnen Zellen oder für Bevölkerungsstudien wünschenswert. 2 Laminar-Flow in Verbindung mit Ventilen und Pumpen wird verwendet, um Zellen in mikrofluidischen Systemen zu manipulieren. Allerdings sind diese Methoden allein anspruchsvoll und erfordern eine detaillierte Fertigungsprozesse und Fähigkeiten 3 Zentrifugation kann die Anforderungen für die Zell-Platzierung, sondern die gleichzeitige Bildgebung ist eine Herausforderung, zu vereinfachen;. Ferner die Channel-Architektur für die Zentrifugation müssen sorgfältig in Betracht ziehen bei der Gestaltung der gewünschten Manipulationen und unter Berücksichtigung Effekte der Fliehkräfte. 4 Laser Pinzette für die Zell-Platzierung verwendet werden kann, aber die Methode ist teuer und nicht geeignet für High-Throughput-cell sorting. 5 Dennoch hat DEP als ein wirksames System der "elektrische Pinzette" für eine effektive Zelle Unterbringung, Charakterisierung nachgewiesen und Manipulation. 6,7 Insbesondere hat DEP verwendet worden, um gezielt zu erfassen und zu sortieren Zellen für On-Chip-Verarbeitung von lebenden und toten Zellen, 7-10 und für das Sammeln Zellen auf resonante Sensoren für die Messung der Zellmasse. 11 Wir haben bisher, dass durch die Erhöhung der DEP zeigte Kraft auf Bakterien oder Perlen vor die fluidische Zugkraft, kann die On-Chip-Konzentration und das Einfangen von Polystyrol-Kügelchen und Listeria monocytogenes V7 erreicht werden. 12 gemischte Populationen von E. coli und L. monocytogenes Bakterien können auch gerichtet und freigegeben werden durch DEP Impulse. Darüber hinaus können größere Partikel unterschiedlich erfasst werden und konzentrierte sich auf den Elektroden auf der großen Partikelgröße auf, während kleinere Partikel werden nicht erfasst, sind aber mit dem fluidischen Fluss entfernt. 13 Wenn DEP Kräfte nicht überwinden die fluidische ziehen Kräfte auf die Partikel, die Perle oder Zelle nicht eingefangen, sondern innerhalb der fluidischen Strom bewegt. Wie in Abbildung 2C zeigt, können Perlen in der zentralen Region des Fluidstroms ausreichen, um die Perlen in den zentralen Kanal behalten fokussiert werden. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, die kombinierte Wirkung von Partikel-Partikel-Einflüsse innerhalb des elektrischen Feldes, Fluidgeschwindigkeiten größer als DEP ziehen Kräfte, die Kombination dieser oder einer anderen definierte Auswirkungen. Neuere Fortschritte in der kontaktlosen DEP für die Maximierung der Zelle zu erfassen und die Manipulation mit der minimal erforderlichen Bereich und schützt so Zelltypen, so weit, während DEP Manipulation zu ermöglichen. 1,9 Contactless DEP bietet Versprechen an die Mikrofluidik-Community für die Sortierung, Erfassung und Positionierung Zellen innerhalb von mikrofluidischen Bauteilen. Wir erwarten, dass mit der gestiegenen Nachfrage nach und der Umsetzung, DEP für die Manipulation innerhalb mikrofluidischen Bauteilen, weitere Entdeckungen und Innovationen wird das Verständnis und den Einfluss der DEP Kräfte zu erweitern. Leiterplatten können durch High-Volume-Verfahren zu einem erschwinglichen Preis mit einem schnellen Herstellung Turnaround-Zeit hergestellt werden, so dass sie eine gute Plattform für die Vermarktung. Darüber hinaus sind PCBs einfach zu bedienen und zugänglich für Wissenschaftler in einer Reihe von Disziplinen für On-Chip-Zell-Manipulationen und Sortierung. Bei der Gestaltung des Layouts der PCB-Elektroden, sollte überlegt werden, die gewünschte Partikelgröße / Zelle Flugbahn gegeben werden. Wesentliche Faktoren für die Prüfung sind Korngröße und Art (Wulst und / oder Zellen), Zelltyp, Mikrokanal Größe, Strömungsgeschwindigkeit, Elektrodenabstand (bestimmt die elektrische Feldstärke), Deckglas Dicke, und die Leitfähigkeit der Flüssigkeit. Diese Faktoren beeinflussen die erforderliche Kraft und stehen dem Partikel oder Zellen und letztendlich die Trennleistung zu manipulieren. Unser Protokoll hier vorgestellten zeigt eine effektive Einrichtung zur Einleitung DEP für Mikrosphären und Zellseparation. Für potenzielle Anwendungen, sollten Anwender die Architektur des mikrofluidischen Kanal-Design mit den gewünschten Strömungswege für Zellen und Perlen sowie die Elektrode Muster passen, um die Effizienz für jede Anwendung zu optimieren. Elektrodenabstand und Deckglas Dicke kann je nach zuvor berichtet Richtlinien bei der Gestaltung der mikrofluidischen Kanal-Layout verwendet werden. 1 Die Leitfähigkeit und Permittivität der Zelle / Teilchen und der umgebenden Medien müssen unterschiedlich genug, um positive oder negative DEP zu erleichtern, während die Zellen intakt. Die Polarität von DEP für ein kugelförmiges Teilchen können von den tatsächlich Teil eines komplexen Wert des folgenden Clausius-Mosotti Faktor bei der Frequenz ω der DEP Spannung bestimmt werden. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545eq1.jpg" alt="Gleichung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 1"> Gleichung 1 In dieser Gleichung ε ist Permittivität ist σ die Leitfähigkeit und ε * ist komplexe Permittivität. Die Indizes p und mbezeichnen die Partikel-und Medien-bzw.. Wenn eine Zelle eine höhere Dielektrizitätskonstante als die Medien oder den Realteil der Clausius-Mosotti Faktor positiv wird, wird das Teilchen stärker polarisiert als die umgebenden Medien. Aufgrund einer nicht-homogenen elektrischen Feld wird das Teilchen die Polarisation ungleichmäßige und das schafft eine positive DEP (+ DEP) Kraft, die die Zelle zieht in Richtung der Region mit höheren elektrischen Feldstärke. Wenn eine Zelle hat eine geringere Dielektrizitätszahl als das umgebende Medium oder der Realteil der Clausius-Mosotti Faktor negativ wird, wird es durchlaufen negativen DEP (-DEP), und die Zelle auf die minimal-Feld Region gezwungen. Wenn die Zelle und Medien etwa die gleiche komplexe Permittivität haben, können keine Kraft erzeugt werden, um die Zelle zu manipulieren. Aus diesem Grund ist reines Wasser ein bevorzugtes Medium für die DEP Teilchen Manipulation. Um jedoch zu vermeiden den osmotischen Stress auf die Zelle von reinem Wasser mit niedriger Leitfähigkeit Medien formuliert, damit die Leitfähigkeit unverändert, aber um Osmolarität zu erhöhen, um osmotischen Stress auf die Zellen zu verringern. Konventionelle Zellkulturmedien oder physiologische Puffer, wie DMEM oder PBS, haben eine hohe Leitfähigkeit, die nicht geeignet ist für die DEP Manipulation. Wir haben auch bereits gezeigt, dass Zellen, die auf Sensoren mit DEP mit geringer Leitfähigkeit Medien erfasst werden können. Nach einer kurzen Zeit für die Zelladhäsion, kann die geringe Leitfähigkeit Medien für die erforderliche Zellkulturmedien ersetzt werden, um das Zellwachstum für Tage unterstützen. 11 Aus unserer Erfahrung sind fluoreszierende Kügelchen sehr hell mit Bezug auf die lebenden Zellen Fluoreszenz, so kann es eine Herausforderung, die Perle Intensität, um die Intensität eines Wohn-und fluoreszierende Zelle angepasst werden. Zur Verbesserung der Visualisierung von Zellen und die Perlen, verwendeten wir DIC-Mikroskopie auf einem aufrechten Mikroskop für die Bildgebung beides. Um die Zellen und Perlen, stellten wir die Daten in einer Intensität leuchten angelegte Image, das die Daten in einem breiten Farbspektrum für ein leichteres Ablesen behält. Bei der Planung der Studie von Interesse, muss der Aufnahmeparameter und Ressourcen berücksichtigt werden. Zusammenfassend zeigen wir die Fähigkeit zur selektiven Betätigung Perlen und Zellen in getrennten Kanälen mit DEP. Mit der zunehmenden Nutzen von mikrofluidischen Kanälen für Zellbiologie, Biochemie und Biotechnik-Anwendungen ist DEP eine wünschenswerte Option für die Zell-Sammlung, Vermittlung und Sortierung. Die PCB-Elektroden Herstellung ist kostengünstig und bequem, sind die Elektroden einfach zu bedienen, und die schnelle Herstellung Zeiten sind ideal für die Umsetzung der DEP.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184-Kit (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Dow Corning Sylgard</td></tr><tr><td>16 awg Anschlussdraht</td><td>Belden</td><td>8521</td><td>(Typ MW) Mil-W-76C-PVC</td></tr><tr><td>Goldversiegeltes Deckglas</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260320</td><td>No. 0 dick, 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Miltex Biopsiebohrer</td><td>VWR international</td><td>95039-104</td><td>Miltex, verschiedene Größen</td></tr><tr><td>Individuelle Leiterplatten-Elektroden</td><td>Bay Area Circuits</td><td>Maßgefertigte Teile</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Fisher Scientific</td><td>O121-1</td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes Wasser</td><td>Eigene deionisierte Wasserversorgung</td><td>Keine</td><td>Gefiltertes DI-Wasser verwenden</td></tr><tr><td>D-Glukose, wasserfrei, granuliert, AR</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>4912-06</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose, kristallin</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>8360-06</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierende Polymer-Mikrokugeln</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS07F/9277</td><td>15&amp;#x03BC;m Dragon-green-Mikrokugeln</td></tr><tr><td>HT-29-Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-38D</td><td>Menschliches Kolonadenokarzinom</td></tr><tr><td>Trypsin 0,05 % EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600FN Aufrechtmikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Phantom V310 Hochgeschwindigkeitskamera</td><td>Phantom</td><td>V310</td><td></td></tr><tr><td>BX51 aufrechtes Forschungsmikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>SpotFlex Farbkamera mit hoher Auflösung</td><td>Diagnostic Instruments</td><td>FX1520</td><td></td></tr><tr><td>Funktionsgenerator</td><td>Agilent Technologies</td><td>3325A</td><td></td></tr><tr><td>HF-Leistungsverstärker</td><td>EIN</td><td>2100L</td><td></td></tr></tbody></table>

die trennung beads und zellen in multi-kanal-mikrofluidiksysteme mit dielektrophorese und laminar flow

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Mikrofluidik-Geräte verfügen über Zell-Studien durch die Bereitstellung einer dynamischen Fluidik-Umgebung auf der Skala der Zelle zu studieren, zu manipulieren, Sortieren und Zählen von Zellen fortgeschritten. Doch die Manipulation der Zellen innerhalb der fluidischen Domain bleibt eine Herausforderung und erfordert aufwendige Herstellung Protokolle zur Bildung Ventile und Elektroden oder Forderungen Spezialausrüstung wie optischen Pinzette. Hier zeigen wir, dass herkömmliche Leiterplatten (PCB) für die berührungslose Manipulation von Zellen kann durch den Einsatz von Dielektrophorese (DEP) für Perle und Zellmanipulation in Laminar-Flow-Felder für bioactuation verwendet werden, und für Zell-und Bead-Trennung in Mehrkanal mikrofluidischen Geräte. Zunächst stellen wir das Protokoll für die Montage der DEP-Elektroden und mikrofluidischen Systemen, und die Vorbereitung der Zellen für die DEP. Dann zeichnen wir die DEP mit Polystyrol-Kügelchen. Schließlich zeigen wir repräsentative Ergebnisse der Wulst und Zellseparation in einer Mehrkanal-Mikrofluidikvorrichtung. Zusammenfassend ist DEP eine effektive Methode zur Manipulation von Partikeln (Beads oder Zellen) in mikrofluidischen Bauteilen.

Dielektrophorese (DEP) ist eine effektive Methode, um Zellen zu manipulieren. Leiterplatten (PCB) können kostengünstig, wiederverwendbar und effektive Elektroden zur berührungslosen Zellmanipulation in mikrofluidischen Systemen bieten. Durch die Kombination von PDMS-basierten mikrofluidischen Kanälen mit Deckgläsern auf Leiterplatten, zeigen wir, Perle und Zell-Manipulation und Trennung innerhalb Mehrkanal mikrofluidischen Bauteilen.

Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow

Mikrofluidische Geräte haben Zellstudien vorangebracht, indem sie eine dynamische fluidische Umgebung auf der Skala der Zelle für die Untersuchung, Manipulation und Sortierung bereitstellen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellen und Kügelchen in mikrofluidischen Vorrichtungen mittels dielektrophoretischer Kräfte oder DEP unter Verwendung von Leiterplatten (PCBs) zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die PCB-Elektroden und die mikrofluidischen Kanäle entworfen und vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die mikrofluidische PCB-Baugruppe sowie die Lösungen mit Kügelchen und Zellen vorzubereiten.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Kanäle mit Medien geringer Leitfähigkeit zu füllen und anschließend die Kügelchen und Zellen zuzugeben. Der letzte Schritt des Verfahrens ist der Anschluss der PCB-Baugruppe an den Leistungsverstärker und den Funktionsgenerator und danach die Initiierung der DEP. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Trennung und Manipulation von Zellen und Kügelchen in mikrofluidischen Vorrichtungen mittels DEP zeigen.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da der Anwender die Prinzipien der dielektrophoretischen Kraft (DEP) verstehen muss, um eine wirksame Elektrode zu entwickeln, die in einem mikrofluidischen Gerät für die gewünschte Manipulation von Zellen oder Kügelchen funktioniert. Andererseits ermöglicht die Verwendung von Leiterplatten (PCBs) als Elektroden die Aktuierung von Zellen und Kügelchen in mikrofluidischen Vorrichtungen für eine Vielzahl wissenschaftlicher Disziplinen. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, die Leiterplattenelektroden (PCB-Elektroden) mit der gewünschten Geometrie zu entwerfen, um ein inhomogenes elektrisches Feld zu erzeugen.Wenn das Design abgeschlossen ist, bestellen Sie die maßgeschneiderten PCB-Elektrodenchips über eine kommerzielle Fertigungsstelle. Öffnen und inspizieren Sie nach dem Eintreffen der individuell angefertigten Leiterplatte diese zur Demonstration. Die Leiterplatte ist 8,4 Zentimeter lang und 2,1 Zentimeter breit.Die Metallelektroden sind fünf Millimeter breit. In diesem Beispiel verfügen die Elektroden über zwei lange metallische Streifen und zwei 4,5 Millimeter lange Querbereiche, in denen die Elektroden verschränkt sind. Diese verschränkten Bereiche erzeugen ein starkes, inhomogenes elektrisches Feld, um eine Verbindung vom Stimulator zur PCB-Elektrode herzustellen.Platzieren Sie einen 16-Gauge-Draht an der Spitze der Elektrode. Verwenden Sie ein heißes Löteisen, um den Draht im metallischen Bereich der Leiterplatte zu fixieren. Dadurch wird der Draht erhitzt.Halten Sie das Lot an den erhitzten Draht und lassen Sie eine kleine Menge Lot in den Draht fließen. Nachdem der Draht mit Lot gefüllt ist, nehmen Sie das Löteisen weg, wobei Sie den Draht weiterhin festhalten, bis das Lot abgekühlt ist. Wiederholen Sie den Lötprozess für die andere elektrische Verbindung auf der Leiterplatte.Der nächste Schritt besteht darin, mikrofluidische Kanäle mit dem gewünschten Verzweigungsmuster herzustellen. Erstellen Sie mithilfe standardmäßiger Mikrofertigungstechniken eine Urform zur Definition der Kanäle, indem Sie eine Siliziumscheibe und SU-8-Photoresist verwenden. Diese Urform weist einen Eingangskanal und drei Zielkanäle auf.Die Breite der Kanäle beträgt 100 Mikrometer und die Höhe der Kanäle 27 Mikrometer. Sobald die Urform hergestellt ist, mischen Sie das Polymethyl-LAANE- oder PDMS-Elastomer mit einem Härter im Gewichtsverhältnis von 10 zu 1 fünf Minuten lang. Gießen Sie das flüssige PDMS auf die vorgefertigte SU-8-Urform und entfernen Sie Luftblasen, indem Sie das flüssige PDMS drei Minuten lang einem Vakuum aussetzen.Wiederholen Sie den Vakuumprozess gegebenenfalls, um alle Blasen vollständig zu entfernen. Bei Bedarf kann ein Strom aus Stickstoffgas verwendet werden, um zusätzliche Blasen zu entfernen. Aushärten Sie das PDMS zwei Stunden lang bei 70 Grad Celsius im Ofen.Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das P-D-M-S-S-Labor mit den mikrofluidischen Kanälen vom Wafer zu entfernen. Achten Sie darauf, den Wafer nicht zu beschädigen, wobei der Kanalbereich nach oben zeigen sollte. Verwenden Sie eine Biopsiepunchvorrichtung, um Löcher für die Zufuhr von Flüssigkeiten und Zellen in die mikrofluidische Vorrichtung zu stanzen. Schneiden Sie zurecht.Überschüssiges PDMS. Überprüfen Sie das mikrofluidische Gerät daraufhin, dass es frei von Staub und Verunreinigungen ist. Reinigen Sie das PDMS mit 3M Scotch Magic Tape.Den PDMS-Kanälen und einer sauberen Deckglasnummer Null mit einer Dicke von 80 bis 130 Mikrometern 1,5 Minuten lang Plasma-Gas aussetzen. Entfernen Sie den PDMS-Chip und das Deckglas aus dem Plasma-Reiniger in einer Petrischale. Verbinden Sie das PDMS-Mikrofluidik-System mit nach unten gerichteten Kanälen auf dem Deckglas. Erhitzen Sie die mikrofluidische Deckglasanordnung auf einem Heizblock, der auf 100 Grad Celsius eingestellt ist, mindestens 15 Minuten lang. Der letzte Schritt bei der Vorbereitung des mikrofluidischen Geräts besteht darin, die PDMS-Kanäle und das Deckglas über den Elektroden der Leiterplatte (PCB) zu positionieren.Beginnen Sie damit, etwa 10 Mikroliter Mineralöl auf die Leiterplatte (PCB) zu geben. Um einen engen Kontakt zwischen der Leiterplatte und der Deckglasanordnung sicherzustellen, platzieren Sie die mikrofluidische Kanalanordnung mit dem Deckglas auf die geölte Leiterplatte. Berühren Sie vorsichtig das Öl und drücken Sie die mikrofluidische Deckglasanordnung nach unten, um einen guten Kontakt zu gewährleisten und Luftblasen zu minimieren, die die Sichtbarkeit von Zellen und Kügelchen beeinträchtigen könnten.Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Herstellung des niedrig leitfähigen Mediums, bestehend aus 8,5 % Saccharose und 0,3 % Glucose (Gewicht pro Volumen) in entionisiertem Wasser. Die mikrofluidische Vorrichtung ist nun gebrauchsfertig; füllen Sie mit einer Pipette jeden mikrofluidischen Kanal mit 15 bis 20 Mikrolitern des niedrig leitfähigen Mediums, falls erforderlich. Entfernen Sie mittels Vakuum-Aspiration eventuelle Blasen in den Kanälen.Der nächste Schritt besteht darin, die Testpartikel in die mikrofluidische Vorrichtung einzubringen. In dieser Demonstration wird eine Suspension von 550 Polystyrolkugeln pro Mikroliter Medium mit geringer Leitfähigkeit verwendet. Da sich die Kugeln im Laufe der Zeit absetzen können, suspendieren Sie die Kugeln erneut durch Schütteln. Anschließend geben Sie mit einer Pipette 200 Mikroliter der Polystyrolkugelsuspension in den Kanal. Der nächste Schritt besteht darin, die Elektroden vorzubereiten, indem der Ausgang eines Funktionsgenerators mit dem Eingang eines Wechselstrom-Verstärkers verbunden wird. Anschließend verbinden Sie den Ausgang des Verstärkers mit den Elektrodenkabeln. Decken Sie alle elektrischen Kabel und Oberflächen der Versuchsanordnung mit Isolierband ab, um die Benutzer vor möglichen Stromschlägen zu schützen.Stellen Sie den Funktionsgenerator so ein, dass er eine Sinuswellenausgabe von eins bis 1,5 Megahertz erzeugt. Leiten Sie die DEP ein, um die Sortierung der Zellen und Kügelchen in diesem Aufbau zu starten. Der Zulaufkanal befindet sich rechts, und die drei Zielkanäle verzweigen sich an der dreifachen Verzweigungsstelle.Die Leiterplatten-Elektroden entsprechen den schwarzen Streifen ohne laminare Strömung und ohne DEP. Die Kügelchen sind im Wesentlichen stationär, sobald die DEP einsetzt, jedoch ohne Strömung. Die Kügelchen wandern zu den Leiterplatten-Elektroden hin und vom Raum zwischen den Elektroden weg, wenn die laminare Strömung eingeschaltet ist.Doch wenn die DEP abgeschaltet ist, werden die durch die Einlasskanäle strömenden Kügelchen auf die drei Zielkanäle verteilt. Wenn die DEP aktiviert wird und die laminare Strömung eingeschaltet ist, werden die Kügelchen so angeregt, dass sie ausschließlich im mittleren Kanal fließen. In den folgenden Videos wurde das mikrofluidische Gerät über den PCB-Elektroden gedreht, wodurch sich die Ausrichtung der Kanäle veränderte.Im Hinblick auf die Leiterplatten-Elektroden: Der Zulaufkanal, der zuvor senkrecht zu den Leiterplatten-Elektroden verlief, verläuft nun bei laminarer Strömung nahezu parallel zu den Elektroden. Bei ausgeschalteter DEP treten die Kügelchen jedoch gleichmäßig in alle drei Zielkanäle ein.Wenn die DEP initiiert wird, nähern sich die Kügelchen dem Verzweigungspunkt an, und die DEP-Kraft zieht die Kügelchen in den Seitenkanal über der Elektrode. Dieser nächste Satz von Abbildungen im Video zeigt eine Mischung aus menschlichen Kolonadenokarzinomzellen oder HT 29-Zellen und fluoreszierenden Kügelchen in der mikrofluidischen Vorrichtung. Auf diesem DIC-Bild kennzeichnet der offene Pfeil die Richtung der laminaren Strömung, und die Kanäle sind mit gestrichelten Linien hervorgehoben.Die reflektierenden Metallelektroden sind als heller Hintergrundstreifen sichtbar, die DIC-Mikroskopie wird verwendet, um die Kügelchen während des Leuchtens abzubilden. Intensitätsskala. Die Bilder dienen dazu, die Zellen besser sichtbar zu machen.Diese Abbildung zeigt dasselbe Bild wie die andere Abbildung, jedoch als Intensitätsbild im Glow-Scale-Modus, um sowohl die Zellen als auch die Kügelchen sichtbar zu machen. Die reflektierenden Metallelektroden erscheinen in dieser Abbildung als gelbe und grüne Streifen. Bei DEP verlassen die Kügelchen den rechten Kanal, wie im DIC-Bild gezeigt, während die HT 29-Zellen den mittleren und linken Kanal verlassen, wie im Glow-Scale-Bild vor dem Einschalten von DEP zu sehen ist. Eine Mischlösung aus Zellen und Kügelchen strömt vom einen Eingangskanal zu den drei separaten Zielkanälen.Nach der Induktion von DEP werden die Beads und Zellen gezielt in separate Kanäle bewegt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Dial-Elektrophorese zur Manipulation von Zellen und Beads in mikrofluidischen Vorrichtungen anwenden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

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Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow

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