Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von Vibrio parahaemolyticus Und andere Vibrio Arten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Sensitivität und Spezifität eines neuen chromogenen Mediums für die Fähigkeit zum Nachweis und zur Isolierung von Vibrio parahaemolyticus im Vergleich zu herkömmlichen Medien zu bewerten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Lebensmittel- und Umweltmikrobiologie zu beantworten, wie z. B. wie hoch ist die Prävalenz von Vibrio-Spezies in Lebensmittel- und Ernteumgebungen? Der Hauptvorteil unseres Verfahrens besteht darin, dass viele bakterielle Isolate verwendet werden können, auch in Gegenwart einer Lebensmittelmatrix.

Bevor Sie die Bakterien kultivieren, autoklavieren Sie alle Agarmedien. Anschließend kühlst du das Agar in einem Wasserbad auf 45 bis 50 Grad Celsius ab. Wenn der Agar fertig ist, ordnen Sie leere Petriplatten in Stapeln von fünf bis sechs Platten an.

Gießen Sie dann, beginnend am unteren Rand des Stapels, den geschmolzenen Agar in jede Platte, bis er etwa zur Hälfte gefüllt ist, und setzen Sie die Deckel nach dem Gießen wieder auf. Lassen Sie den Agar mindestens 12 Stunden lang bei Raumtemperatur fest ziehen. Um die mikrobiellen Stammkulturen einzurichten, verwenden Sie, wenn der Agar fertig ist, eine sterile Impfschlaufe, um die Kulturen auf die entsprechenden nicht-selektiven Agarplatten zu übertragen, wobei die Bakterien in einem Muster gestreift werden, das die Beobachtung isolierter Kolonien ermöglicht.

Wenn alle Kolonien plattiert sind, inkubieren Sie die Kulturen kopfüber bei 35 bis 37 Grad Celsius für bis zu 48 Stunden, mit Ausnahme der Campylobacter-Arten, die in einem Gefäß mit geschlossenem Deckel inkubiert werden sollten, das einen Gasbeutel enthält, um eine mikroaerophile Umgebung zu erzeugen. Beobachten Sie die Morphologie der Kolonie am Ende der Inkubation. Reinkulturen sollten Kolonien hervorbringen, die eine ähnliche Koloniemorphologie aufweisen.

Um die interessierenden Völker auf selektiven und differentiellen Medien zu züchten, werden einige isolierte Völker in fünf Milliliter der entsprechenden Brühe überführt und die Kulturen bei 35 bis 37 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden neu inkubiert. Am nächsten Tag streichen Sie eine Schlinge der Übernachtkulturen auf mindestens eine Thiosulfat-Citrat-Galle-Salz-Saccharose (TCBS)-Agarplatte und mindestens eine chromogene Agarplatte für eine Inkubationszeit von bis zu 96 Stunden bei 35 bis 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation untersuchen Sie sowohl die Kulturdichte auf der Platte als auch die Größe der isolierten Völker, um das Gesamtwachstum der Stämme zu bestimmen, indem Sie die Farbe der Völker unter Umgebungs- oder UV-Licht aufzeichnen und alle anderen wichtigen Merkmale der Völker notieren.

Um einen Wiederfindungstest durchzuführen, inokulieren Sie junge Kulturen von Vibrio parahaemolyticus in fünf Milliliter tryptische Sojabrühe, ergänzt mit zwei Prozent Natriumchlorid oder TSBS, und legen Sie die Röhrchen 16 bis 24 Stunden lang auf 35 bis 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag die Übernachtkulturen vortexen und eins mal 10 auf die negative, auf eins mal 10 auf die negativen sieben Verdünnungen der Bakterien in PBS einrichten. Unter Verwendung der sieben Verdünnungen von eins mal 10 zu minus vier bis eins mal 10 bis zu den negativen sieben Verdünnungen werden gleichmäßig 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf einzelne chromogene, TCBS- und tryptische Soja-Agar aufgetragen, die mit zwei Prozent Natriumchlorid-Agar oder TSAS-Platten ergänzt werden.

Inkubieren Sie alle Platten bei 35 bis 37 Grad Celsius für bis zu 96 Stunden. Zählen Sie dann die Kolonien und ignorieren Sie die Tafeln mit Kolonien, die zu zahlreich sind, um sie zu zählen, oder die weniger als 25 Völker enthalten. Um einen Konkurrenztest durchzuführen, wählen Sie einen V.Parahaemolyticus-Stamm aus, der die erwarteten Türkiskolonien auf TCBS und cyanfarbene Kolonien auf chromogenem Agar liefert, sowie einen Nicht-V-Stamm.

Parahaemolytius-Art, die auf keinem der beiden Medien wächst oder eine andere Koloniefarbe aufweist. Übertragen Sie einige isolierte V. Parahaemolyticus- und V. Metschnikovii-Kolonien aus einer TSAS-Landwirtschaft auf fünf Milliliter TSBS für eine 16- bis 24-stündige Inkubation bei 35 bis 37 Grad Celsius. Übertragen Sie einige isolierte Shigella sonnei-Kolonien aus dem Brain-Heart-Infusion- oder BHI-Agar für 16 bis 24 Stunden bei 35 bis 37 Grad Celsius auf fünf Milliliter BHI-Brühe.

Am nächsten Tag führen Sie für jeden Stamm eine serielle Verdünnung durch und plattieren die Verdünnungen auf nicht-selektive Agarplatten, um die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter der Übernachtkulturen zu bestimmen. Verwenden Sie als Nächstes die Übernachtkulturen und Verdünnungsröhrchen, um unterschiedliche Volumina eines V.Parahaemolyticus-Stammes und eines Nicht-V-Stammes zu mischen. Parahaemolyticus-Spezies und verteilen Sie 100 Mikroliter des Bakteriengemisches auf einzelne chromogene, TCBS- und TSAS-Agarplatten.

Nach bis zu 96 Stunden bei 35 bis 37 Grad Celsius zählen Sie die Völker anhand ihrer Unterschiede in Wachstum und Morphologie auf den chromogenen und TCBS-Platten. Um die Auswirkungen von Austernhomogenaten auf das Bakterienwachstum auf selektiven und differenziellen Medien zu beurteilen, werden zunächst mindestens 50 g Austernfleisch von mindestens 12 Weichtieren einschließlich Fleisch und Likör gewogen. Geben Sie dann eine gleiche Masse PBS zu den Austerntüchern und mixen Sie die Mischung 90 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit.

Fügen Sie dann 100 Gramm des verdünnten Austernhomogenats zu 400 Gramm PBS hinzu und mischen Sie die Mischung eine Minute lang bei hoher Geschwindigkeit. Dann autoklavieren Sie das Homogenat. Nach dem Abkühlen über Nacht jeweils 100 Mikroliter V.Parahaemolyticus und Nicht-V hinzufügen.

Parahaemolyticus-Kultur in die Austernaufschlämmung und verwenden Sie einen Homogenisator, um die Bakterienzellen mit dem Austernhomogenat zu mischen. Machen Sie eins mal 10 zu den negativen eins zu eins mal 10 zu den negativen drei Verdünnungen des dotierten Austernhomogenats in PBS, wie gezeigt, und verteilen Sie 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf einzelne chromogene, TCBS- und TSAS-Platten. Vergleichen Sie nach 96 Stunden bei 35 bis 37 Grad Celsius die tatsächlichen Koloniezahlen auf den chromogenen und TCBS-Agars mit den erwarteten Koloniezahlen, die aus der Standardkeimzahl abgeleitet wurden, die an den Nachtkulturen durchgeführt wurde.

Um das Wachstum und die Morphologie der Kolonie der in dieser Studie verwendeten Stämme zu bestimmen, wurden die Bakterien auf selektiven und differentiellen Medien gezüchtet. TCBS ist das konventionelle Medium, das für die Isolierung einiger Vibrio-Spezies verwendet wird, darunter Türkis V.Parahaemolyticus und Gelb V.Cholerae. Die Verwendung von chromogenem Medium zur Selektion klinisch relevanter Vibrio-Spezies aus Lebensmittel- und Umweltproben führt zur Bildung von cyan V.Parahaemolyticus und magenta V.Cholerae.

Kolonien von V. Parahaemolyticus, die auf chromogenen Agarplatten in Gegenwart von Austernhomogenat gezüchtet wurden, werden in ähnlicher Anzahl beobachtet wie auf nichtselektiven Medien, was darauf hindeutet, dass die Nachweisgrenze des chromogenen Mediums ähnlich wie bei nichtselektiven Medien ist, selbst wenn eine Lebensmittelmatrix vorhanden ist. Auch das Wachstum und die Erholung von V. Parahaemolyticus werden durch das Vorhandensein eines Nicht-V. Parahaemolyticus-Spezies, ein wesentliches Merkmal für differentielle und selektive Medien, da Umweltproben verschiedene Vibrio-Spezies in hoher Zahl enthalten, insbesondere nach einem Anreicherungsverfahren.

Darüber hinaus zeigt der Vergleich von TCBS und chromogenen Agaren mittels thermolabiler Hämolysin-PCR eine höhere Sensitivität und Spezifität für den chromogenen Agar, was auf eine insgesamt bessere Leistung für dieses differentielle und selektive Medium zum Nachweis und zur Identifizierung von V. Parahaemolyticus hinweist. Einmal gemeistert, kann das gesamte Verfahren, einschließlich der Test- und Inkubationszeiten von etwa 50 Stämmen, bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von 30 Tagen abgeschlossen werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Kulturen sorgfältig zu beschriften und jederzeit aseptische Techniken anzuwenden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Kolonie-PCR durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. "Trägt dieses spezielle Isolat ein Virulenzgen?" Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Lebensmittelsicherheit und der öffentlichen Gesundheit, den Nachweis von Vibrio-Arten in Schalentieren und der Mündungsumgebung zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Standardkeimzählung durchführt und wie man die Sensitivität, Spezifität und Nachweisgrenze eines Wachstumsmediums bewertet.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krankheitserregern und heißem Medium äußerst gefährlich sein kann, und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzkleidung, das Abdecken offener Wunden und die Trennung von biologisch gefährlichen Abfällen getroffen werden sollten.