Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Empfindlichkeit und Spezifität eines neuen chromogenen Mediums hinsichtlich seiner Fähigkeit zum Nachweis und zur Isolierung von Vibrio parahaemolyticus im Vergleich zu herkömmlichen Medien zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Lebensmittel- und Umweltmikrobiologie zu beantworten, beispielsweise: Wie hoch ist die Prävalenz von Vibrio-Arten in Lebensmitteln und Erntenumgebungen? Der Hauptvorteil unseres Verfahrens liegt darin, dass viele bakterielle Isolate verwendet werden können, auch in Gegenwart einer Lebensmittelmatrix.

Bevor die Bakterien kultiviert werden, alle Agarmedien im Autoklaven sterilisieren. Anschließend das Agar in einem Wasserbad auf 45 bis 50 Grad Celsius abkühlen lassen. Wenn das Agar bereit ist, leere Petrischalen in Stapeln zu je fünf bis sechs Schalen anordnen.

Dann, beginnend von der Unterseite des Stapels, das geschmolzene Agar in jede Petrischale gießen, bis diese etwa zur Hälfte gefüllt ist, und danach die Deckel wieder aufsetzen. Das Agar bei Raumtemperatur mindestens 12 Stunden lang erstarren lassen. Um die Kulturen der Mikrobenstämme anzusetzen, sobald das Agar bereit ist, mit einer sterilen Inokulationsnadel die Kulturen auf die entsprechenden nicht-selektiven Agarplatten übertragen und die Bakterien in einem Muster stricheln, das die Beobachtung isolierter Kolonien ermöglicht.

Nachdem alle Kolonien ausgestrichen wurden, inkubieren Sie die Kulturen bis zu 48 Stunden lang verkehrt herum bei 35 bis 37 Grad Celsius, mit Ausnahme von Campylobacter-Arten, die in einem geschlossenen Behälter mit einem Gasbeutel zur Erzeugung einer mikroaerophilen Umgebung inkubiert werden sollten. Beobachten Sie am Ende der Inkubation die Kolonienmorphologie. Reinkulturen sollten Kolonien hervorbringen, die eine ähnliche Kolonienmorphologie aufweisen.

Um die Kolonien von Interesse auf selektiven und differenzierenden Medien zu vergrößern, überführen Sie einige isolierte Kolonien in fünf Milliliter der geeigneten Brühe und inkubieren die Kulturen erneut 16 bis 24 Stunden bei 35 bis 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag streichen Sie eine Schleife der Übernachtkulturen auf mindestens eine Thiosulfat-Citrat-Galle-Saccharose- (TCBS-)Agarplatte und mindestens eine chromogene Agarplatte und inkubieren bis zu 96 Stunden bei 35 bis 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation untersuchen Sie sowohl die Kulturdichte auf der Platte als auch die Größe der isolierten Kolonien, um das Gesamtwachstum der Stämme zu beurteilen. Notieren Sie die Farbe der Kolonien unter Umgebungslicht oder UV-Licht, je nach Erfordernis, und vermerken Sie alle weiteren wichtigen Merkmale der Kolonien.

Um einen Reaktivierungs-Assay durchzuführen, impfen Sie junge Kulturen von Vibrio parahaemolyticus in fünf Milliliter Trypcase-Soja-Brühe, ergänzt mit zwei Prozent Natriumchlorid, oder TSBS, an und inkubieren Sie die Röhrchen bei 35 bis 37 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden. Am nächsten Tag wirbeln Sie die Übernachtkulturen kräftig und bereiten Verdünnungen von ein mal 10 hoch minus eins bis ein mal 10 hoch minus sieben der Bakterien in PBS vor. Verwenden Sie die Verdünnungen von ein mal 10 hoch minus vier bis ein mal 10 hoch minus sieben, um jeweils 100 Mikroliter jeder Verdünnung gleichmäßig auf einzelne chromogene, TCBS- und Trypcase-Soja-Agar-Platten, die mit zwei Prozent Natriumchlorid-Agar, oder TSAS, angereichert sind, aufzuplatzieren.

Inkubieren Sie alle Platten bei 35 bis 37 Grad Celsius für bis zu 96 Stunden. Zählen Sie anschließend die Kolonien, wobei Platten mit zu zahlreichen Kolonien für eine Zählung oder mit weniger als 25 Kolonien ignoriert werden. Für einen Konkurrenzassay wählen Sie einen V. parahaemolyticus-Stamm aus, der die erwarteten türkisfarbenen Kolonien auf TCBS und cyanfarbene Kolonien auf chromogenem Agar bildet, sowie einen Nicht-V.

Parahaemolytius-Arten, die auf keinem der beiden Medien wachsen oder eine abweichende Koloniefarbe aufweisen. Überführen Sie einige isolierte Kolonien von V. parahaemolyticus und V. metschnikovii von einem TSAS-Agar in fünf Milliliter TSBS und inkubieren Sie 16 bis 24 Stunden bei 35 bis 37 Grad Celsius. Überführen Sie einige isolierte Kolonien von Shigella sonnei von Brain-Heart-Infusion- (BHI-)Agar in fünf Milliliter BHI-Brühe und inkubieren Sie 16 bis 24 Stunden bei 35 bis 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag eine serielle Verdünnung für jeden Stamm durchführen und die Verdünnungen auf nicht-selektiven Agarplatten ausplattieren, um die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter der Übernachtkulturen zu bestimmen. Anschließend die Übernachtkulturen und Verdünnungsgefäße verwenden, um verschiedene Volumina eines V. parahaemolyticus-Stamms und einer nicht-V. parahaemolyticus-Art zu mischen, und 100 Mikroliter der Bakterienmischung auf einzelne chromogene, TCBS- und TSAS-Agarplatten auftragen.

Nach bis zu 96 Stunden bei 35 bis 37 Grad Celsius zählen Sie die Kolonien anhand ihrer Wachstums- und morphologischen Unterschiede auf den chromogenen und TCBS-Platten. Um die Auswirkungen von Austernhomogenaten auf das bakterielle Wachstum auf selektiven und differenzierenden Medien zu beurteilen, wiegen Sie zunächst mindestens 50 Gramm Austernfleisch aus mindestens 12 Mollusken-Schalentieren, einschließlich des Fleisches und der Flüssigkeit. Geben Sie dann eine gleiche Masse PBS zu dem Austergewebe hinzu und vermischen Sie die Mischung für 90 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit.

Fügen Sie anschließend 100 Gramm des verdünnten Austernhomogenats zu 400 Gramm PBS hinzu und vermischen Sie die Mischung eine Minute lang bei hoher Geschwindigkeit. Danach autoklavieren Sie das Homogenat. Nach dem Abkühlen geben Sie jeweils 100 Mikroliter der über Nacht kultivierten V. parahaemolyticus und der nicht-V.-Stämme hinzu.

Geben Sie die Parahaemolyticus-Kultur zur Austern-Suspension und mischen Sie die Bakterienzellen mit dem Austernhomogenat unter Verwendung eines Homogenisators. Stellen Sie Verdünnungen des belasteten Austernhomogenats im Verhältnis 1 × 10⁻¹ bis 1 × 10⁻³ in PBS her, wie gezeigt, und geben Sie jeweils 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf einzelne chromogene, TCBS- und TSAS-Platten. Nach 96 Stunden bei 35 bis 37 Grad Celsius vergleichen Sie die tatsächlichen Koloniezahlen auf den chromogenen Agar- und TCBS-Platten mit den erwarteten Koloniezahlen, die aus der Standard-Plattenzählung der Übernachtkulturen abgeleitet wurden.

Um das Wachstum und die Kolonie-Morphologie der in dieser Studie verwendeten Stämme zu bestimmen, wurden die Bakterien auf selektiven und differenzierenden Medien kultiviert. TCBS ist das konventionelle Medium zur Isolierung einiger Vibrio-Arten, einschließlich türkisfarbener V.Parahaemolyticus und gelber V.Cholerae. Die Verwendung von chromogenem Medium zur Selektion klinisch relevanter Vibrio-Arten aus Lebensmittel- und Umweltproben führt zur Bildung von cyanfarbenen V.Parahaemolyticus und magentafarbenen V.Cholerae.

Kolonien von V. Parahaemolyticus, die auf chromogenen Agarplatten in Gegenwart von Austernhomogenat gezüchtet wurden, treten in ähnlichen Zahlen auf wie auf nicht-selektiven Medien, was darauf hindeutet, dass die Nachweisgrenze des chromogenen Mediums der von nicht-selektiven Medien entspricht, selbst in Gegenwart einer Lebensmittelmatrix. Auch das Wachstum und die Wiederfindung von V. Parahaemolyticus werden durch das Vorhandensein einer nicht-V. parahaemolyticus-Art nicht beeinträchtigt, eine wesentliche Eigenschaft für differenzierende und selektive Medien, da Umweltproben zahlreiche Vibrio-Arten in hohen Konzentrationen enthalten, insbesondere nach einem Anreicherungsverfahren.

Außerdem zeigt der Vergleich von TCBS- und chromogenen Agars mittels PCR für thermolabile Hämolyse eine höhere Sensitivität und Spezifität für das chromogene Agar, was auf eine insgesamt bessere Leistungsfähigkeit dieses differenzierenden und selektiven Mediums zur Detektion und Identifizierung von V. parahaemolyticus hinweist. Wenn man einmal Erfahrung mit dem Verfahren gesammelt hat, kann der gesamte Ablauf – einschließlich der Test- und Inkubationszeiten für etwa 50 Stämme – bei korrekter Durchführung innerhalb von 30 Tagen abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets daran zu denken, alle Kulturen sorgfältig zu kennzeichnen und durchgehend aseptische Techniken anzuwenden.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Kolonie-PCR angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Trägt dieser spezifische Isolat ein Virulenzgen? Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern im Bereich Lebensmittelsicherheit und öffentliche Gesundheit den Weg, um die Detektion von Vibrio-Arten in Schalentieren und im brackigen Milieu zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Standardplattenzählung durchführt und wie man die Empfindlichkeit, Spezifität und Nachweisgrenze eines Nährbodens bewertet.

Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Krankheitserregern und heißem Medium äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzkleidung, das Abdecken offener Wunden sowie die Trennung von biohazardösem Abfall stets beachtet werden sollten, während dieser Prozedur.