A High Throughput, multiplexados e alvejado proteômica CSF Ensaio para quantificar Neurodegenerativas Biomarkers e apolipoproteína E isoformas Estado

O objetivo geral deste método é quantificar rapidamente e de forma econômica múltiplos biomarcadores no líquido cefalorraquidiano, ou LCR, para avaliar seu uso no diagnóstico e no monitoramento do tratamento. Este é um novo ensaio que nos permite medir biomarcadores que antes não era possível quantificar. E acreditamos que ele pode ser utilizado com finalidades diagnósticas, bem como para diferenciar entre diferentes doenças neurodegenerativas e, potencialmente, também fornecer informações prognósticas.

A principal vantagem desta técnica é que ela foi projetada para ser rápida, simples na preparação da amostra, altamente específica e economicamente viável para implementação no laboratório clínico. As implicações desta técnica estendem-se para terapia ou diagnóstico, já que este teste de alto rendimento pode ser utilizado em ensaios clínicos futuros para novas terapias em neurodegeneração. Esta metodologia também pode ser aplicada a outras doenças e tecidos, como urina para distúrbios renais, plasma para cardiomiopatia e células para pluripotência.

Para iniciar este procedimento, reconstitua os peptídeos sintéticos desejados até uma concentração estoque de um miligrama por mililitro, de acordo com as instruções do fabricante. Prepare diluições de um em dez do peptídeo a partir da concentração estoque e reúna 1.000 picomoles de cada peptídeo em um tubo microcêntrifugo de baixa ligação. Seque a amostra de peptídeos reunidos em um concentrador SpeedVac.

Quando terminado, armazene a amostra a menos 20 graus Celsius. Em seguida, alíquota 100 microlitros de LCR em tubos de microcentrífuga de baixa ligação. Liofilize as amostras de LCR.

Resuspenda uma alíquota da amostra de peptídeos em pool no tampão de digestão para obter concentrações de 10 e um picomol por microlitro. Em seguida, adicione a amostra de peptídeos em pool aos alíquotas de 100 microlitros de LCR liofilizados, nas concentrações de zero, um, dois, cinco, 10 e 15 picomolares. Então, adicione 20 nanogramas de uma proteína intacta não relacionada para atuar como padrão interno e controle da eficiência de digestão da tripsina.

Adicione tampão de digestão aos alíquotas de LCR para um volume final de 20 microlitros e vortexe as amostras. Em seguida, realize a digestão das amostras conforme protocolo padrão, adicionando 1,5 microlitro de ditiotreitol e agitando à temperatura ambiente por uma hora. Após isso, adicione três microlitros de iodoacetamida às amostras e agite à temperatura ambiente por 45 minutos no escuro.

Em seguida, adicione 165 microlitros de água bidestilada. Adicione 10 microlitros de uma solução de tripsina modificada de grau de sequenciamento a 0,1 micrograma por microlitro, ressuspensa em tampão de bicarbonato de amônio 50 milimolar, às amostras. Incube as amostras em banho-maria a 37 graus Celsius durante a noite.

Em seguida, interrompa a digestão congelando as amostras. Após descongelar os digestos de LCR no gelo, centrifugue a 16.000 vezes g durante 10 minutos. Ao finalizar, transfira 60 microlitros de cada digesto para um frasco de inserção de vidro de 300 microlitros.

Utilizando um sistema LC-MS equipado com uma coluna UPLC C18, injete a concentração mais alta do ponto da curva padrão usando um gradiente linear de acetonitrila de 1 a 40% em 10 minutos. Após a conclusão da corrida, abra o cromatograma resultante no software e anote o tempo de retenção e as duas transições mais intensas por peptídeo. Com base nessas informações, atualize um método de monitoramento de reação múltipla, ou MRM, previamente criado, com canais temporizados para medir peptídeos.

Para manter a sensibilidade, mantenha cada canal com pontos por pico superiores a oito e tempo de permanência superior a 0,01 segundos para pelo menos uma transição para cada peptídeo. Inclua atrasos do solvente no método MRM selecionando atrasos do solvente nos eventos do método no arquivo do método de MS. É essencial associar corretamente o pico correto em um método HPLC curto.

Isso pode ser feito utilizando os peptídeos adicionados à matriz que são usados para uma curva padrão e observando as múltiplas transições durante o desenvolvimento do método. Por fim, revise manualmente a anotação dos dados para garantir a precisão. Analise cada peptídeo e sua razão em relação a um padrão interno apropriado marcado com isótopo estável.

Um cromatograma dos marcadores peptídicos significativos do ensaio de alto rendimento de LCR é mostrado aqui. Os dados fornecem razões padronizadas em relação ao padrão interno marcado com isótopo estável relevante, que podem ser usadas para determinar concentrações absolutas de LCR e analisadas estatisticamente quanto a alterações em amostras clínicas. A quantificação dos 74 peptídeos incluídos neste ensaio de LCR revelou que 25 foram alterados significativamente no LCR de pacientes com demência, e os resultados dos marcadores de demência pró-orexina e proteína semelhante à quitinase-3 YKL são exibidos aqui.

ApoE4 é um fator de risco conhecido para a doença de Alzheimer, e a detecção de isoformas de ApoE baseia-se na identificação dos peptídeos correspondentes às alterações de aminoácidos nas isoformas E2 e E4. O padrão de picos esperado para cada combinação de isoformas é mostrado aqui. Uma vez que o método for configurado, o ensaio pode ser realizado em um dia, se for executado corretamente. Após o desenvolvimento deste método, tornou-se possível medir um novo conjunto de biomarcadores com alta sensibilidade e especificidade analíticas, o que permitirá aos pesquisadores avaliar doenças neurodegenerativas de uma maneira inovadora.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar e otimizar um ensaio MRM quanto à sensibilidade e especificidade. Não se esqueça de que trabalhar com DTE, cupim, ácido fórmico e tecido humano pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas, devem ser adotadas durante este procedimento.