Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Experimente zur Rettung von Erschöpfung unter Bedingungen durchzuführen, die die zelluläre Integrität und die Proteinhomöostase erhalten. Für funktionelle Analysen biologischer Prozesse auf Einzelzellebene. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu Proteinfunktionen und Strukturanforderungen in der Zelldynamik wie Mitose und Zelldifferenzierung zu beantworten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, ein Protein von Interesse zu erschöpfen und gleichzeitig eine Variante dieses Proteins auf neophysiologischer Ebene in der Messung einer Zellpopulation wieder einzuführen. Beginnen Sie damit, Schalen mit Glasboden mit Fribronektin zu bestreichen. Verdünnen Sie dazu ein Milligramm pro Milliliter firbronektin-Stamm eins zu 100 mit sterilem PBS.

Geben Sie einen Milliliter in jede 35-Milliliter-Schale, um die gesamte Oberfläche zu bedecken. Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Während der Inkubation wurde vorwarmes Alpha-MEM mit 10 % FBS und einem Aliquot von 0,05 % Trypsin-EDTA auf 37 Grad Celsius ergänzt.

Beginnen Sie nach 45 Minuten Inkubation mit der Vorbereitung der Zelllösung. Aspirieren Sie das Medium aus einer 10 Zentimeter großen Platte aus HeLa RFP H2B-Zellen. Und spülen Sie zweimal vorsichtig mit 1,5 Millilitern 0,05 % Trypsin EDTA nach.

Lassen Sie nach der letzten Aspiration 0,5 Milliliter Trypsin EDTA auf der Platte. Und inkubieren Sie die Zellen für zwei bis drei Minuten bei 37 Grad Celsius. Und 5% Kohlendioxid.

Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte. Und beobachten Sie die Zellschicht unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich alle Zellen abgelöst haben. Fügen Sie dann 10 Milliliter Medium hinzu und pipettieren Sie mehrmals vorsichtig, um die Zellen zu trennen, und geben Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Zählen Sie eine 10-Mikroliter-Probe der Zellsuspension mit einem Hämozytometer. Als nächstes aspirierst du die Fibronektinlösung aus den Glasbodenschalen. Lassen Sie das Fibronektin vor dem Plattieren der Zelle nicht trocknen.

Bereiten Sie eine Zellsuspensionslösung vor, um 1,5 mal zehn bis fünfte Zellen pro 35-Millimeter-Schale in zwei Milliliter Medium zu plattieren. Platte eine 35-Millimeter-Platte zusätzlich zur Anzahl der Bedingungen, um die Zellzahl vor der Virustransduktion zu zählen. 30 bis 45 Minuten inkubieren.

Überprüfen Sie nach Ablauf der Inkubationszeit die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen gut getrennt sind. Wie hier zu sehen. Stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator und züchten Sie die Zellen bis zum nächsten Tag.

Stellen Sie am Tag nach der Beschichtung sicher, dass die Zellen eine Dichte von mindestens 50 % erreicht habenEine Zelldichte von weniger als 50 % führt zu einer verminderten Virustransduktionseffizienz. Erhöhte Variation der Proteinexpression pro Zelle und erhöhte Zelltoxizität. Ernten Sie dann wie zuvor die Zellen aus der zusätzlichen Tellerschale.

Und zählen Sie die Anzahl der Zellen. Berechnen Sie das Volumen der Viren, das für eine effiziente Transduktion der Zellen erforderlich ist. Beschriften Sie für jede Bedingung ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Und fügen Sie 400 Mikroliter warmes alpha MEM minus hinzu. Nachdem Sie die Aliquots der Viren auf Eis langsam aufgetaut haben, geben Sie das erforderliche Volumen jedes Virus in die Röhrchen und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren. Nachdem Sie das Medium aus den Zellen abgesaugt haben, fügen Sie die Virusmischung vorsichtig tropfenweise hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Rühren Sie die Platten alle 15 Minuten für einen Zeitraum von einer Stunde vorsichtig unter der sterilen Haube um, um die Zellen mit Viren zu bedecken. Die Verwendung einer kleinen Menge Medium erleichtert den Kontakt des Virus mit den Zellen.

Nach der Inkubation pipettieren Sie vorsichtig 1,6 Milliliter Alpha MEM minus auf jede Platte, um ein Gesamtvolumen von zwei Millilitern zu erhalten. Starten Sie dann die Zellsynchronisation, indem Sie zwei millimolare Thymidin hinzufügen, bevor Sie die Zellen weitere zwei Stunden lang inkubieren. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die siRNA-Transfektionsmischung vor, indem Sie in ein Mikroröhrchen 139 Mikroliter steriles Wasser, 50 Mikroliter eines molaren Calciumchlorids und 11 Mikroliter 20 mikromolare siRNA geben.

Wenn keine siRNA erforderlich ist, ersetzen Sie die Menge an siRNA durch steriles Wasser, um eine leere Transfektion durchzuführen. Geben Sie die HBSS2X-Lösung tropfenweise langsam auf das Calciumchlorid-siRNA-Gemisch. Mischen Sie vorsichtig zweimal durch Luftinjektion mit einer 200-Mikroliter-Pipette.

Da kleinere Ausfällungen zu einer besseren Transfektionseffizienz führen. Dann die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation langsam 200 Mikroliter tropfenweise auf jede Platte geben und zum Mischen umrühren.

Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid für 16 Stunden. Nehmen Sie am nächsten Tag die Schalen aus dem Inkubator und transportieren Sie sie in eine Gewebekulturhaube. Nachdem Sie die Zellen zweimal mit zwei Millilitern warmem Hipis gespült haben, fügen Sie zwei Milliliter Alpha-MEM minus hinzu, bevor Sie in den Inkubator zurückkehren.

Sieben Stunden später geben Sie zwei millimolare Thymidin in die Platten, bevor Sie sie wieder in den Inkubator geben. Arbeiten Sie mit nicht mehr als vier Zellplatten gleichzeitig, da Temperaturschwankungen die Länge des Zellzyklus beeinflussen. Am nächsten Tag, 48 Stunden nach der siRNA-Transfektion und der Virusinfektion, spülen Sie die Zellen zweimal mit zwei Millilitern warmem PBS und fügen Sie dann zwei Milliliter Alpha-MEM ohne Phenolrot für die Bildgebung lebender Zellen hinzu.

Sieben Stunden lang inkubieren. Führen Sie kurzfristige Experimente zur Bildgebung lebender Zellen an mitotischen Zellen mit einem inversen Mikroskop durch, das mit einer befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-thermoregulierten Kammer ausgestattet ist. Vergewissern Sie sich vor der Erfassung, dass die Kammer die entsprechende Temperatur von 37 Grad Celsius erreicht hat.

Stellen Sie die kultivierten Schalen eine Stunde vor der Aufnahme in die Mikroskopkammer, um ein ordnungsgemäßes Gleichgewicht des Mediums zu ermöglichen und eine Fokusdrift aufgrund von Temperaturänderungen zu vermeiden. Untersuchen Sie den mitotischen Status der Zellen. An dieser Stelle.

10 bis 15 % der Zellen sollten sich in den frühen Stadien der Mitose befinden. Während der Äquilibrierungszeit sind die Erfassungsparameter so einzustellen, wie sie in früheren Experimenten bestimmt wurden. Es ist wichtig, eine angemessene Auflösung ohne Photobleaching zu erreichen.

Denn dies führt zu Zellschäden und stört das mitotische Fortschreiten. Wählen Sie mehrere Felder aus, die Zellen enthalten, die sich beim mitotischen Eintritt pro Bedingung befinden, um eine signifikante Anzahl von Zellen zu erhalten, die analysiert werden sollen, ohne das Erfassungsintervall zu überschreiten. Wenn alle Felder ausgewählt sind, setzen Sie den Fokus zurück und starten Sie die Erfassung so schnell wie möglich.

Die Verwendung einer rotierenden Scheibe kann das Fokussystem ermöglichen. Ein typisches Setup umfasst vier verschiedene Bedingungen. Sieben Felder pro Platte.

Und zwei Farbkanäle mit einem Intervall von 1,5 bis zwei Minuten über einen Zeitraum von 75 Minuten. Bestimmen Sie klar definierte Kriterien für die Analyse mitotischer Phänotypen in Zellen, die von den verwendeten Fluoreszenzmarkern abhängen. Im Gegensatz zur Transfektion von BAG3 GFP, plasmatischer DNA, wie links zu sehen, ermöglicht die Adenofektion mit rekompetenten Adenoviren, hier rechts zu sehen, eine homogenere und effizientere Expression von BAG3 GFP.

Bei einem Großteil der Zellpopulation bei geringer Multiplizität von Infektionen. Dieser repräsentative Western Blot zeigt, dass die Adenofektion mit BAG3-spezifischen siRNAs und rekomponentem Adenovirus BAG3 GFP eine effiziente Depletion von endogenem BAG3 und die Wiedereinführung des BAG3 GFP-Proteins in nahezu endogenen Konzentrationen ermöglicht. Wie hier gezeigt, kann die Adenofektion die Proteinhomöostase erhalten, da es keinen nachweisbaren Anstieg der Spiegel der stressinduzierten Hitzeschockproteine in HeLa-Zellen gibt, die adenofektiert wurden.

Im Gegensatz zu HeLa-Zellen, die mit dem proteotoxischen Stressinduktor MG132 behandelt wurden. Hier sehen wir, dass das Fortschreiten der Zellen durch die Mitose durch die Adenofektion nicht signifikant gestört wird, wie diese konfokalen Zeitrafferbilder von HeLa-Zellen zeigen, die mit Kontroll-siRNA und BacMam GFP alpha Tubulin adenofektiert wurden. und BacMam FRP Actin.

Die Grafik zeigt den Anteil der Zellen mit abnormaler Mitose. Zellen, die nur mit BAG3-spezifischer siRNA adenofisiert wurden, zeigten einen etwa zweifachen Anstieg des Niveaus der mitotischen Defekte. Wie durch den roten Balken dargestellt.

Diese wurde durch Wiedereinführung von BAG3 GFP, dargestellt durch den schwarzen Balken, wieder in die Nähe des Kontrollzellenniveaus gebracht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Experimente zur Rettung von Erschöpfung mit Adenofektion durchführen können. Diese Methode bietet ein schnelles und einfaches System zur Erstellung hypomorpher Knock-Downs für die Strukturfunktionsanalyse in mehreren zellulären Hintergründen.

Mit dieser Methode können die wichtigsten strukturellen Anforderungen an das Protein von Interesse für eine gegebene Funktion identifiziert werden. Andere Ansätze des Genome Editing können dann genutzt werden, um die beteiligten Mechanismen zu vertiefen.