Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Ausschöpfungs-Rettungs-Experimente unter Bedingungen durchführen zu können, die die zelluläre Integrität und Proteostase bewahren, um funktionelle Analysen biologischer Prozesse auf Einzelzell-Ebene durchzuführen.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen zur Proteinfunktion und zu strukturellen Anforderungen in zellulären Dynamiken wie Mitose und Zell-Differenzierung beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, ein Protein von Interesse abzubauen und gleichzeitig eine Variante dieses Proteins in der Mehrheit einer Zellpopulation nahe physiologischer Konzentrationen wieder einzuführen.

Beginnen Sie damit, Glasbodenkulturschalen mit Fibronectin zu beschichten. Verdünnen Sie hierzu einen Fibronectin-Stammlösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter im Verhältnis 1:100 mit steriler PBS.

Geben Sie je ein Milliliter in jede 35-Milliliter-Schale, um die gesamte Oberfläche zu bedecken. Inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Während der Inkubation erwärmen Sie vorgängig alpha MEM, ergänzt mit 10 % FBS, sowie eine Portion 0,05 %iger Trypsin-EDTA-Lösung auf 37 Grad Celsius.

Nach 45 Minuten Inkubation beginnen Sie mit der Vorbereitung der Zellsuspension. Aspirieren Sie das Medium von einer 10 cm-Platte mit HeLa-RFP-H2B-Zellen und spülen Sie vorsichtig zweimal mit 1,5 Millilitern 0,05 %iger Trypsin-EDTA-Lösung.

Lassen Sie 0,5 Milliliter Trypsin-EDTA nach der letzten Aspiration auf der Platte und inkubieren Sie die Zellen für zwei bis drei Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Tippen Sie vorsichtig auf die Platte und beobachten Sie die Zellschicht unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob alle Zellen abgelöst wurden. Geben Sie anschließend 10 Milliliter Medium hinzu und pipettieren Sie mehrmals vorsichtig, um die Zellen zu lösen, und überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Zählen Sie eine 10-Mikroliter-Probe der Zellsuspension mithilfe eines Hämozytometers. Danach saugen Sie die Fibronectin-Lösung aus den Glasbodenkulturschalen ab. Lassen Sie das Fibronectin vor dem Aufbringen der Zellen nicht austrocknen.

Bereiten Sie eine Zellsuspensionslösung vor, um 1,5 × 10⁵ Zellen pro 35-Millimeter-Schale in zwei Milliliter Medium zu impfen. Impfen Sie eine zusätzliche 35-Millimeter-Schale neben der Anzahl der Bedingungen, um die Zellanzahl vor der Virus-Transduktion zu bestimmen. Inkubieren Sie 30 bis 45 Minuten. Überprüfen Sie nach Ablauf der Inkubationszeit die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen gut separiert sind, wie hier gezeigt. Stellen Sie die Schalen zurück in den Inkubator und kultivieren Sie die Zellen bis zum nächsten Tag.

Am Tag nach der Aussaat sicherstellen, dass die Zellen eine Dichte von mindestens 50 % erreicht haben. Eine geringere Zelldichte führt zu einer verminderten Virus-Transduktionseffizienz, einer erhöhten Variabilität der Proteinexpression pro Zelle sowie zu einer stärkeren Zelltoxizität. Anschließend die Zellen wie zuvor aus der zusätzlichen bebrüteten Schale gewinnen und die Zellanzahl bestimmen. Berechnen Sie das Volumen an Viren, das für eine effiziente Transduktion der Zellen erforderlich ist. Beschriften Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Bedingung und geben Sie 400 Mikroliter warmes alpha MEM minus hinzu. Nach dem langsamen Auftauen der Virusaliquote auf Eis das erforderliche Volumen jedes Virus den Röhrchen hinzufügen und vorsichtig per Pipette mischen. Danach, nach dem Absaugen des Mediums von den Zellen, die Virusmischung tropfenweise vorsichtig hinzugeben. Die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Alle 15 Minuten über einen Zeitraum von einer Stunde die Platten vorsichtig unter der sterilen Haube schwenken, um die Zellen gleichmäßig mit dem Virus zu bedecken. Die Verwendung einer geringen Menge Medium erleichtert den Kontakt zwischen Virus und Zellen.

Nach der Inkubation vorsichtig 1,6 Milliliter alpha MEM minus in jede Platte pipettieren, um ein Gesamtvolumen von zwei Millilitern zu erhalten. Anschließend die Zellsynchronisierung durch Zugabe von zwei Millimolar Thymidin starten, bevor die Zellen weitere zwei Stunden inkubiert werden.

Bereiten Sie unterdessen das siRNA-Transfektionsgemisch vor, indem Sie in ein Mikroröhrchen 139 µL sterilem Wasser, 50 µL einer einmolarigen Calciumchloridlösung und 11 µL einer 20 µM siRNA geben. Falls keine siRNA erforderlich ist, ersetzen Sie die siRNA-Menge durch steriles Wasser, um eine leere Transfektion durchzuführen. Geben Sie die HBSS-2X-Lösung langsam tropfenweise auf die Calciumchlorid-siRNA-Mischung. Mischen Sie vorsichtig zweimal durch Luftinjektion mit einer 200-µL-Pipette, da kleinere Präzipitate eine bessere Transfektionseffizienz bewirken. Inkubieren Sie danach das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation geben Sie langsam 200 µL tropfenweise zu jeder Platte hinzu und schwenken Sie, um zu mischen. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid für 16 Stunden.

Am nächsten Tag die Schalen aus dem Inkubator nehmen und in die Zellkulturhaube transportieren. Nachdem die Zellen zweimal mit je zwei Milliliter warmer HEPES-Lösung gespült wurden, zwei Milliliter alpha MEM minus hinzufügen und die Schalen anschließend in den Inkubator zurückbringen.

Sieben Stunden später zwei Millimolar Thymidin zu den Platten hinzufügen und diese anschließend in den Inkubator zurückstellen. Es sollten jeweils nicht mehr als vier Zellplatten gleichzeitig bearbeitet werden, da Temperaturschwankungen die Dauer des Zellzyklus beeinflussen. Am folgenden Tag, 48 Stunden nach der siRNA-Transfektion und Virusinfektion, die Zellen zweimal mit je zwei Milliliter warmer PBS spülen und dann zwei Milliliter alpha MEM ohne Phenolrot für die Live-Cell-Abbildung hinzufügen. Sieben Stunden inkubieren.

Führen Sie kurzfristige Live-Cell-Imaging-Experimente an mitotischen Zellen mit einem umgekehrten Mikroskop durch, das mit einer befeuchteten, thermo-regulierten Kammer mit 5 % Kohlendioxid ausgestattet ist. Überprüfen Sie vor der Aufnahme, ob die Kammer die geeignete Temperatur von 37 Grad Celsius erreicht hat.

Stellen Sie die Kulturschalen eine Stunde vor der Aufnahme in die Mikroskophöhle, um eine ordnungsgemäße Gleichgewichtseinstellung des Mediums zu ermöglichen und Fokussierungsverschiebungen aufgrund von Temperaturschwankungen zu vermeiden. Überprüfen Sie den mitotischen Status der Zellen. Zu diesem Zeitpunkt sollten 10 bis 15 % der Zellen in den frühen Stadien der Mitose sein.

Während der Equilibrierungszeit stellen Sie die Akquisitionsparameter gemäß vorheriger Experimente ein. Es ist wichtig, eine geeignete Auflösung ohne Photo-Bleichen zu erreichen, da dies Zellschäden verursacht und den Mitoseverlauf stört. Wählen Sie mehrere Felder mit Zellen, die je nach Bedingung den Eintritt in die Mitose zeigen, um eine signifikante Anzahl analysierbarer Zellen zu erhalten, ohne das Akquisitionsintervall zu überschreiten. Sobald alle Felder ausgewählt sind, stellen Sie den Fokus erneut ein und starten die Akquisition so schnell wie möglich.

Bei Verwendung eines Spinning-Disk-Konfokalsystems würde ein typischer Versuchsaufbau vier verschiedene Bedingungen, sieben Felder pro Platte und zwei Farbkanäle mit einem Intervall von 1,5 bis zwei Minuten über einen Zeitraum von 75 Minuten umfassen. Legen Sie klar definierte Kriterien zur Analyse von mitotischen Phänotypen in Zellen fest, die von den verwendeten fluoreszierenden Markern abhängen.

Im Gegensatz zur Transfektion mit BAG3-GFP-Plasmid-DNA, wie links zu sehen, ermöglicht die Adenofektion mit hier rechts gezeigten rekombinanten Adenoviren eine homogenere und effizientere Expression von BAG3-GFP in der Mehrheit der Zellpopulation bei niedriger Multiplizität der Infektion. Dieser repräsentative Western-Blot zeigt, dass die Adenofektion mit BAG3-spezifischen siRNAs und dem rekombinanten Adenovirus BAG3-GFP eine effiziente Ausschaltung des endogenen BAG3 sowie die erneute Einführung des BAG3-GFP-Proteins auf nahezu endogenen Ebenen erlaubt. Wie hier dargestellt, kann die Adenofektion die Proteinhomöostase bewahren, da bei adenofektierten HeLa-Zellen im Vergleich zu mit dem proteotoxischen Stressinduzierer MG132 behandelten HeLa-Zellen kein nachweisbarer Anstieg der stressinduzierten Hitzeschockproteine festzustellen ist. Hier sehen wir, dass der Zellfortschritt durch die Mitose durch die Adenofektion nicht signifikant gestört wird, wie durch diese konfokalen Zeitrafferaufnahmen von HeLa-Zellen gezeigt, die mit Kontroll-siRNA sowie BacMam-GFP alpha-Tubulin und BacMam-RFP-Aktin adenofektiert wurden.

Der Graph zeigt den Anteil der Zellen mit abnormer Mitose an. Zellen, die allein mit BAG3-spezifischem siRNA adenofiziert wurden, wiesen eine etwa zweifache Erhöhung des Niveaus an Mitosestörungen auf, wie durch den roten Balken dargestellt, das durch die erneute Einführung von BAG3-GFP, dargestellt durch den schwarzen Balken, nahezu auf das Niveau der Kontrollzellen zurückkehrte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Depletion-Rescue-Experimente mittels Adenofektion durchführt. Diese Methode bietet ein schnelles und einfaches System, um hypomorphe Knock-downs zur Funktionsanalyse in verschiedenen zellulären Hintergründen zu erzeugen. Mithilfe dieser Methode können die wesentlichen strukturellen Anforderungen des Proteins der Untersuchung für eine bestimmte Funktion identifiziert werden. Andere Ansätze der Genomeditierung können anschließend verwendet werden, um die zugrundeliegenden Mechanismen weiter zu erforschen.