Name: Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Adenofektionsmethode für Depletion-Rettungs-Experimente zur Untersuchung von Proteinfunktionen in Zellbiologie. Diese Technik ermöglicht funktionelle Analysen auf Einzelzellebene bei Erhaltung der zellulären Integrität.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von den Canadian Institutes of Health Research (Grant Nr. 7077), sowie von der Bellini Foundation und Roby Fondazione.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier beschrieben wir ein Verfahren ermöglicht Verarmungsrettungsexperimente durchgeführt werden, die funktionelle Analyse von zellbiologischen Prozessen anwendbar ist, die besonders empfindlich auf eine Überexpression von Proteinen, die Stöchiometrie und die Dynamik von Proteinkomplexen und makromolekulare Strukturen zu beeinträchtigen. Mitotischen Zellteilung ist ein extremes Beispiel für fein abgestimmte Zelle Morphodynamik, die die dramatische und spektakuläre Veränderungen in der Gesamtstruktur einer Zelle beinhalte...

Funktionelle Inaktivierung der Genexpression in Säugerzellen ist der Goldstandard Proteinfunktionen zu sezieren. Neu entwickelte Technologien der Genom Bearbeitung 1,2 kurz über die Verwendung von ortsspezifischen Nukleasen wie Zink-Finger - Nukleasen und gruppierten regelmäßig voneinander beabstandete Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CAS9 erlauben nun die Generierung von Zelllinien mit gezielten Gen - Deletion und Mutation basiert. Diese neuen Ansätze sollten revolutionieren die Art, wie wir die Proteinfunktion und unser Verständnis der Genetik von Krankheiten beim Menschen studieren. In einigen Fällen ist nicht wünschenswert, langfristige oder vollständige Gen-Knockout jedoch und kann Sekundärzelle Kompensationsmechanismen hervorrufen. Die Erzeugung von gentechnisch veränderten Zelllinien können auch Begrenzungs sein, wenn sie mit primären Zellkulturen mit begrenzter Proliferationskapazität handelt, oder wenn Screening einer großen Gruppe von Mutationen in verschiedenen Zelltypen gesucht wird. Dies wird oft zur Bestimmung der Abhängigkeit einer Zelle b erforderlicheiologische Prozess auf strukturellen Anforderungen eines Proteins. Zu diesem Zweck reversible Knockdown durch RNA - Interferenz , die noch transiente Depletion-Rettungsversuchen in verschiedenen zellulären Hintergründen ermöglicht weiterhin eine einfache und leistungsstarke Ansatz zur Durchführung Struktur-Funktion eines Proteins von Interesse 3 analysiert. Allerdings ist ein großer Nachteil bei diesem Ansatz die Schwierigkeit, effiziente Silencing zu erreichen, und das Protein von Interesse oder seine Varianten in der Nähe von physiologischen Konzentrationen in einer Mehrheit der Zellpopulation wieder einführen. Dies ist entscheidend, umfassende Studien zu ermöglichen, die funktionelle Effekte auf der Ebene einzelner Zellen (hypomorphen Phänotyp) mit denen in populationsbasierten Zellassays gesehen zu korrelieren versuchen, zum Beispiel auf Protein-Protein-Wechselwirkungen. Mit klassischen Transfektionsverfahren, kann man kaum erreichen homogene und niedrige Expression von exogenen Proteinen in einer großen Population von Zellen. Transduktion von Zellen mit rekombinanten Virenwie Adenoviren können oft mehr normalisierte Expression von exogenen Proteinen. Doch Adenovirus Aufnahme wird durch den CAR-Rezeptor begrenzt, die in nicht-menschlichen Zellen fehlt oder nur schwach in einigen menschlichen Zelltypen exprimiert. Darüber hinaus aktiviert die Zelleintritt von Adenoviren Signalwege , die Zellform und Haftung 4-6 regulieren. Dies ist natürlich nicht wünschenswert, wenn regulatorische Mechanismen der Zell Morphodynamik studieren. Wir waren mit Blick auf diese Problematik, wenn wir funktionelle Analysen eines Chaperon-Komplex unternahm, BAG3-HSPB8, bei der Zellteilung und Aktindynamik. Pionierarbeit hatte eine Rolle für dieses Chaperon - Komplex in der Proteinqualitätskontrolle und Autophagie bei Stress 7,8 beschrieben. Die meisten dieser Studien stützte sich jedoch auf die Proteinexpression unter der Annahme, dass die Chaperone normalerweise während Stress aufreguliert werden. Dies hat die Frage offen gelassen, ob BAG3, im Komplex mit HSPB8 kann zum normalen Betrieb von sich teilenden Zellen beitragen th exprimierendenese Chaperone wie 9 viele Krebszelltypen. Insbesondere ob trägt das Chaperon - Komplex auf den Umbau des Aktin-basierten Strukturen , die mitotischen Progression von großem Interesse war kontrollieren, 10 die Schwellen Verbindungen zwischen HspB Chaperone und Zytoskelett Dynamik gegeben. Um dieses Problem zu beheben, suchten wir ein effizientes Verfahren zur Depletion-Rettungsversuche zu entwickeln, die nicht mit mitotischen Progression oder zelluläre Morphologie stören würde, und das würde Proteinhomöostase erhalten zur sekundären Störung der Dynamik makromolekularer Komplexe Regelzellformänderungen vermeiden . So ideal, Depletion-Add-Rückseite des Gens von Interesse sollte gleichzeitig ausgeführt werden. Die Verwendung von Komplexen von Adenovirus mit einem kationischen Polymer oder Lipiden beschrieben wurde Gentransfer in vitro zu fördern , und in vivo 11,12. Beispielsweise Calciumphosphat (CaPi) erscheint, um einen Niederschlag zu bilden, mitAdenovirus , die Virusbindung-Eingabe über eine CAR-unabhängigen Weg 13 zu verbessern. Tatsächlich fanden wir, dass Adenovirus-basierten Kombination Zell Transduktion und Transfektion mit kationischen Verbindungen könnte die Effizienz der Verarmungsrettungsexperimente verbessern. Dies ermöglichte es uns, die Mengen an Virus durch 3- bis 20-fach niedriger, abhängig von der Zelllinie und dem Gen von Interesse, und profitieren von einem breiteren Fenster, um die Expression von exogenen Proteinen in der Nähe von endogenen Konzentrationen in den meisten einzustellen einer Zellpopulation von Interesse mit minimalen Auswirkungen auf die Zellmorphologie. Unter diesen Bedingungen konnten wir auch hohe Effizienz Knockdown endogener Proteinexpression (&gt; 75%) erzielen. Wir beschreiben hiermit das Verfahren Schritt für Schritt und belegen , dass Proteinhomöostase nicht signifikant , wie durch den unveränderten Stress-induzierten Chaperone des Hitzeschockproteinfamilie beurteilt gestört wird, wodurch das Verfahren geeignet für die funktionelle Analyse des physiologischen role von molekularen Chaperonen durch Zeitraffervideomikroskopie. Das Protokoll ist zugänglich Zellensynchronisationsverfahren und die Verwendung von handelsüblichen Baculoviren für die Coexpression von geringen Mengen an Fluoreszenzmarkern, mit minimaler Beeinträchtigung der normalen Aktin-basierten und Spindeldynamik während der mitotischen Progression. Wir zeigen die Vielseitigkeit des Verfahrens, die anwendbar ist , Maus C2C12 - Zellen &quot;schwer zu transduzieren&quot;, ohne erhebliche Auswirkungen auf die Myoblastendifferenzierung in Myotuben in vitro.

<table><tbody><tr><td>C2C12 Maus Myoblasten</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus kundenspezifisches Design</td><td>Welgen</td><td>kundenspezifisches</td><td></td></tr><tr><td>Design Calciumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg; Actin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10582</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg; Tubulin-RFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10614</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium (DMEM), High Glucose</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenschalen, 35 mm</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-20-C Case</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-RFP-H2B</td><td>Freundliches Geschenk von Dr. Sabine Elowe, Qu&eacute; bec, Kanada</td><td></td><td>Klebig C et al. 2009</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum, Neuseeland</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine&reg; RNAiMAX Transfektionsreagenz</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Minimal essentielles Medium (MEM) Alpha</td><td>Wisent</td><td>310-101-CL</td><td></td></tr><tr><td>Minimal essentielles Medium (MEM) Alpha ohne Desoxyribonuleoside/Ribonukleoside</td><td>Thermo Fisher</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>Minimal essentielles Medium (MEM) Alpha ohne Phenolrot</td><td>Thermo Fisher</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Biobasic</td><td>S0404</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>rAVCMV-LifeAct-TagGFP2</td><td>IBIDI</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>siRNA Duplexe</td><td>Dharmacon</td><td>Custom design</td><td></td></tr><tr><td>Thymidin</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 2,5%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15090-046</td><td></td></tr></tbody></table>

adenofection: eine methode zur untersuchung der rolle von molekularen chaperonen in cellular morphodynamik von depletion-rettungs-experimente

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Zelluläre Prozesse, wie beispielsweise die Mitose und Zelldifferenzierung werden durch Änderungen in der Zellform bestimmt, die auf die richtige Remodellierung der Zell Zytoskelettstrukturen weitgehend verlassen. Dabei wird die Montage-Demontage von höherer Ordnung makromolekulare Strukturen zu einem bestimmten Zeitpunkt und Ort, ein Vorgang, der besonders empfindlich gegenüber Störungen durch die Überexpression von Proteinen verursacht wird. Methoden, die Protein-Homöostase und aufrechtzuerhalten in der Nähe zu normalen Zellmorphologie sind höchst wünschenswert, um zu bestimmen die funktionelle Beitrag eines Proteins von Interesse in einer Vielzahl von zellulären Prozessen erhalten kann. Transient Verarmungsrettungsversuche auf Basis von RNA-Interferenz sind leistungsfähige Ansätze Proteinfunktionen und strukturellen Anforderungen zu analysieren. Allerdings Wiedereinführung des Zielproteins mit minimalen Abweichung von seiner physiologischen Ebene ist eine echte Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Methode genannt adenofection das entwickelt wurde, um die Rolle von molekularen Chaperonen zu studieren eind Partner in dem normalen Betrieb von sich teilenden Zellen und die Beziehung mit Aktin-Umbildung. HeLa-Zellen wurden von BAG3 verarmt mit siRNA-Duplexe die 3&#39;UTR Region abzielt. unter Verwendung von rekombinanten Adenoviren gekoppelt Transfektionsreagenzien GFP-markierten BAG3 Proteine ​​wurden gleichzeitig in&gt; 75% der Zellen wieder eingeführt. Adenofection aktiviert BAG3-GFP-Proteine ​​bei nahezu physiologischen Konzentrationen in HeLa-Zellen verarmt BAG3, in Abwesenheit eines Stressreaktion auszudrücken. Es wurde keine Wirkung auf den Ebenen der endogenen Heat Shock Protein Chaperone beobachtet, den Stress-induzierbaren Regulatoren der Protein-Homöostase. Weiterhin kann durch Baculoviren Antreiben der Expression von fluoreszierenden Markern zum Zeitpunkt der Zell Transduktion-Transfektion Zugabe konnten wir mitotischen Zelldynamik durch Zeitraffer mikroskopische Analysen sezieren mit minimaler Störung der normalen mitotischen Progression. Adenofection ist auch auf schwer zu Infect Mauszellen, und geeignet für die funktionelle Analyse von Myoblasten differenzierung in Myotuben. So bietet adenofection eine vielseitige Methode Struktur-Funktion in sensiblen biologischen Prozessen beteiligten Proteine ​​Analysen durchzuführen, die auf höherer Ordnung Dynamik des Zytoskeletts verlassen.

Transfektion von BAG3-GFP - Plasmid - DNA unter Verwendung von kationischen Lipiden mit heterogenen Expression assoziiert in HeLa - Zellen einige Zellen zeigt kaum nachweisbaren Mengen des Proteins und andere Lager sehr hohe BAG3 Ebenen (2A). In diesen Zellen, Proteinverlust Homöostase wurde durch Akkumulation von BAG3-GFP nachgewiesen in perinukleären Aggregate (2A, Pfeile). Im Gegensatz dazu Zelltransduktion mit Adenoviren BAG3-GFP tragen zeigte homoge...

Wir beschreiben eine Methode für Depletion-Rescue-Experimente, die die zelluläre Integrität und Proteinhomöostase bewahrt. Die Adenofektion ermöglicht funktionelle Analysen von Proteinen innerhalb biologischer Prozesse, die auf fein abgestimmter Aktin-basierter Dynamik beruhen, wie z. B. mitotische Zellteilung und Myogenese, auf Einzelzellebene.

Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Ausschöpfungs-Rettungs-Experimente unter Bedingungen durchführen zu können, die die zelluläre Integrität und Proteostase bewahren, um funktionelle Analysen biologischer Prozesse auf Einzelzell-Ebene durchzuführen.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen zur Proteinfunktion und zu strukturellen Anforderungen in zellulären Dynamiken wie Mitose und Zell-Differenzierung beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, ein Protein von Interesse abzubauen und gleichzeitig eine Variante dieses Proteins in der Mehrheit einer Zellpopulation nahe physiologischer Konzentrationen wieder einzuführen.Beginnen Sie damit, Glasbodenkulturschalen mit Fibronectin zu beschichten. Verdünnen Sie hierzu einen Fibronectin-Stammlösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter im Verhältnis 1:100 mit steriler PBS.Geben Sie je ein Milliliter in jede 35-Milliliter-Schale, um die gesamte Oberfläche zu bedecken. Inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Während der Inkubation erwärmen Sie vorgängig alpha MEM, ergänzt mit 10 % FBS, sowie eine Portion 0,05 %iger Trypsin-EDTA-Lösung auf 37 Grad Celsius. Nach 45 Minuten Inkubation beginnen Sie mit der Vorbereitung der Zellsuspension. Aspirieren Sie das Medium von einer 10 cm-Platte mit HeLa-RFP-H2B-Zellen und spülen Sie vorsichtig zweimal mit 1,5 Millilitern 0,05 %iger Trypsin-EDTA-Lösung.Lassen Sie 0,5 Milliliter Trypsin-EDTA nach der letzten Aspiration auf der Platte und inkubieren Sie die Zellen für zwei bis drei Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Tippen Sie vorsichtig auf die Platte und beobachten Sie die Zellschicht unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob alle Zellen abgelöst wurden. Geben Sie anschließend 10 Milliliter Medium hinzu und pipettieren Sie mehrmals vorsichtig, um die Zellen zu lösen, und überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen.Zählen Sie eine 10-Mikroliter-Probe der Zellsuspension mithilfe eines Hämozytometers. Danach saugen Sie die Fibronectin-Lösung aus den Glasbodenkulturschalen ab. Lassen Sie das Fibronectin vor dem Aufbringen der Zellen nicht austrocknen.Bereiten Sie eine Zellsuspensionslösung vor, um 1,5 × 10⁵ Zellen pro 35-Millimeter-Schale in zwei Milliliter Medium zu impfen. Impfen Sie eine zusätzliche 35-Millimeter-Schale neben der Anzahl der Bedingungen, um die Zellanzahl vor der Virus-Transduktion zu bestimmen. Inkubieren Sie 30 bis 45 Minuten. Überprüfen Sie nach Ablauf der Inkubationszeit die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen gut separiert sind, wie hier gezeigt. Stellen Sie die Schalen zurück in den Inkubator und kultivieren Sie die Zellen bis zum nächsten Tag.Am Tag nach der Aussaat sicherstellen, dass die Zellen eine Dichte von mindestens 50 % erreicht haben. Eine geringere Zelldichte führt zu einer verminderten Virus-Transduktionseffizienz, einer erhöhten Variabilität der Proteinexpression pro Zelle sowie zu einer stärkeren Zelltoxizität. Anschließend die Zellen wie zuvor aus der zusätzlichen bebrüteten Schale gewinnen und die Zellanzahl bestimmen. Berechnen Sie das Volumen an Viren, das für eine effiziente Transduktion der Zellen erforderlich ist. Beschriften Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Bedingung und geben Sie 400 Mikroliter warmes alpha MEM minus hinzu. Nach dem langsamen Auftauen der Virusaliquote auf Eis das erforderliche Volumen jedes Virus den Röhrchen hinzufügen und vorsichtig per Pipette mischen. Danach, nach dem Absaugen des Mediums von den Zellen, die Virusmischung tropfenweise vorsichtig hinzugeben. Die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Alle 15 Minuten über einen Zeitraum von einer Stunde die Platten vorsichtig unter der sterilen Haube schwenken, um die Zellen gleichmäßig mit dem Virus zu bedecken. Die Verwendung einer geringen Menge Medium erleichtert den Kontakt zwischen Virus und Zellen.Nach der Inkubation vorsichtig 1,6 Milliliter alpha MEM minus in jede Platte pipettieren, um ein Gesamtvolumen von zwei Millilitern zu erhalten. Anschließend die Zellsynchronisierung durch Zugabe von zwei Millimolar Thymidin starten, bevor die Zellen weitere zwei Stunden inkubiert werden.Bereiten Sie unterdessen das siRNA-Transfektionsgemisch vor, indem Sie in ein Mikroröhrchen 139 µL sterilem Wasser, 50 µL einer einmolarigen Calciumchloridlösung und 11 µL einer 20 µM siRNA geben. Falls keine siRNA erforderlich ist, ersetzen Sie die siRNA-Menge durch steriles Wasser, um eine leere Transfektion durchzuführen. Geben Sie die HBSS-2X-Lösung langsam tropfenweise auf die Calciumchlorid-siRNA-Mischung. Mischen Sie vorsichtig zweimal durch Luftinjektion mit einer 200-µL-Pipette, da kleinere Präzipitate eine bessere Transfektionseffizienz bewirken. Inkubieren Sie danach das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation geben Sie langsam 200 µL tropfenweise zu jeder Platte hinzu und schwenken Sie, um zu mischen. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid für 16 Stunden.Am nächsten Tag die Schalen aus dem Inkubator nehmen und in die Zellkulturhaube transportieren. Nachdem die Zellen zweimal mit je zwei Milliliter warmer HEPES-Lösung gespült wurden, zwei Milliliter alpha MEM minus hinzufügen und die Schalen anschließend in den Inkubator zurückbringen.Sieben Stunden später zwei Millimolar Thymidin zu den Platten hinzufügen und diese anschließend in den Inkubator zurückstellen. Es sollten jeweils nicht mehr als vier Zellplatten gleichzeitig bearbeitet werden, da Temperaturschwankungen die Dauer des Zellzyklus beeinflussen. Am folgenden Tag, 48 Stunden nach der siRNA-Transfektion und Virusinfektion, die Zellen zweimal mit je zwei Milliliter warmer PBS spülen und dann zwei Milliliter alpha MEM ohne Phenolrot für die Live-Cell-Abbildung hinzufügen. Sieben Stunden inkubieren.Führen Sie kurzfristige Live-Cell-Imaging-Experimente an mitotischen Zellen mit einem umgekehrten Mikroskop durch, das mit einer befeuchteten, thermo-regulierten Kammer mit 5 % Kohlendioxid ausgestattet ist. Überprüfen Sie vor der Aufnahme, ob die Kammer die geeignete Temperatur von 37 Grad Celsius erreicht hat.Stellen Sie die Kulturschalen eine Stunde vor der Aufnahme in die Mikroskophöhle, um eine ordnungsgemäße Gleichgewichtseinstellung des Mediums zu ermöglichen und Fokussierungsverschiebungen aufgrund von Temperaturschwankungen zu vermeiden. Überprüfen Sie den mitotischen Status der Zellen. Zu diesem Zeitpunkt sollten 10 bis 15 % der Zellen in den frühen Stadien der Mitose sein.Während der Equilibrierungszeit stellen Sie die Akquisitionsparameter gemäß vorheriger Experimente ein. Es ist wichtig, eine geeignete Auflösung ohne Photo-Bleichen zu erreichen, da dies Zellschäden verursacht und den Mitoseverlauf stört. Wählen Sie mehrere Felder mit Zellen, die je nach Bedingung den Eintritt in die Mitose zeigen, um eine signifikante Anzahl analysierbarer Zellen zu erhalten, ohne das Akquisitionsintervall zu überschreiten. Sobald alle Felder ausgewählt sind, stellen Sie den Fokus erneut ein und starten die Akquisition so schnell wie möglich.Bei Verwendung eines Spinning-Disk-Konfokalsystems würde ein typischer Versuchsaufbau vier verschiedene Bedingungen, sieben Felder pro Platte und zwei Farbkanäle mit einem Intervall von 1,5 bis zwei Minuten über einen Zeitraum von 75 Minuten umfassen. Legen Sie klar definierte Kriterien zur Analyse von mitotischen Phänotypen in Zellen fest, die von den verwendeten fluoreszierenden Markern abhängen. Im Gegensatz zur Transfektion mit BAG3-GFP-Plasmid-DNA, wie links zu sehen, ermöglicht die Adenofektion mit hier rechts gezeigten rekombinanten Adenoviren eine homogenere und effizientere Expression von BAG3-GFP in der Mehrheit der Zellpopulation bei niedriger Multiplizität der Infektion. Dieser repräsentative Western-Blot zeigt, dass die Adenofektion mit BAG3-spezifischen siRNAs und dem rekombinanten Adenovirus BAG3-GFP eine effiziente Ausschaltung des endogenen BAG3 sowie die erneute Einführung des BAG3-GFP-Proteins auf nahezu endogenen Ebenen erlaubt. Wie hier dargestellt, kann die Adenofektion die Proteinhomöostase bewahren, da bei adenofektierten HeLa-Zellen im Vergleich zu mit dem proteotoxischen Stressinduzierer MG132 behandelten HeLa-Zellen kein nachweisbarer Anstieg der stressinduzierten Hitzeschockproteine festzustellen ist. Hier sehen wir, dass der Zellfortschritt durch die Mitose durch die Adenofektion nicht signifikant gestört wird, wie durch diese konfokalen Zeitrafferaufnahmen von HeLa-Zellen gezeigt, die mit Kontroll-siRNA sowie BacMam-GFP alpha-Tubulin und BacMam-RFP-Aktin adenofektiert wurden.Der Graph zeigt den Anteil der Zellen mit abnormer Mitose an. Zellen, die allein mit BAG3-spezifischem siRNA adenofiziert wurden, wiesen eine etwa zweifache Erhöhung des Niveaus an Mitosestörungen auf, wie durch den roten Balken dargestellt, das durch die erneute Einführung von BAG3-GFP, dargestellt durch den schwarzen Balken, nahezu auf das Niveau der Kontrollzellen zurückkehrte.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Depletion-Rescue-Experimente mittels Adenofektion durchführt. Diese Methode bietet ein schnelles und einfaches System, um hypomorphe Knock-downs zur Funktionsanalyse in verschiedenen zellulären Hintergründen zu erzeugen. Mithilfe dieser Methode können die wesentlichen strukturellen Anforderungen des Proteins der Untersuchung für eine bestimmte Funktion identifiziert werden. Andere Ansätze der Genomeditierung können anschließend verwendet werden, um die zugrundeliegenden Mechanismen weiter zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Protokoll eine Methode, um intrazelluläre Protein Rückfaltung nach Hitzeschock Maßnahme beschrieben. Diese Methode kann verwendet werden, um foldases wie molekulare Chaperone und ihr Co-Faktoren oder Verbindungen in der Lage, ihre Tätigkeit Einfluss zu studieren. Firefly Luciferase-Aktivität wird als Reporter Chaperon Rückfaltung Aktivität zu messen.

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Quelle: Dahl, J. et al. Nachweis der pH-abhängigen Aktivität von Escherichia coli Chaperone HdeB In vitro und In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert einen auf Fluoreszenzspektrophotometer basierenden Test zur Bewertung der Chaperonaktivität auf einem Substratprotein unter Säure- und Hitzestress. Es beschreibt die Schritte zur Überwachung der Entfaltung und Aggregation des Substrats durch Lichtstreuung und vergleicht Bedingungen mit und ohne den Begleiter.

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Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Diese Studie beschreibt biophysikalischen, biochemischen und molekularen Techniken , um die Chaperon - Aktivität von Escherichia coli HdeB unter sauren pH - Bedingungen zu charakterisieren. Diese Verfahren wurden für andere Säureschutz Chaperone wie HdeA erfolgreich angewendet und kann modifiziert werden, um andere Chaperone und Belastungsbedingungen zu arbeiten.

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Wir beschreiben, wie Mikro- und Fotomanipulation Techniken wie FRAP und photoaktivierungen ermöglichen die Bestimmung der Motilität Parameter und die räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine innerhalb Migration Zellen. Experimentellen Messwerte sind subzelluläre Dynamik und Umsatz der Motilität Regulierungsbehörden oder des zugrunde liegenden Aktin-Zytoskeletts.

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Eines der schwierigsten Stressbedingungen, die Organismen im Laufe ihres Lebens zu begegnen bedeutet die Anhäufung von Oxidantien. Bei oxidativem Stress Zellen auf Molekulare Chaperone angewiesen. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zu untersuchen, die Redox-regulierte Anti-Aggregation Tätigkeit, als auch strukturelle Veränderungen, die EZB der Chaperon-Funktion mit HDX-MS zu überwachen.

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Cognate J-Domain-Proteine arbeiten mit dem Hsp70-Chaperon zusammen, um eine Vielzahl biologischer Prozesse zu unterstützen, die von der Proteinfaltung bis zum Abbau reichen. Hier beschreiben wir einen in situ-Näheligationstest, der die Überwachung dieser vorübergehend gebildeten Chaperon-Maschinen in Bakterien-, Hefe- und menschlichen Zellen ermöglicht.

In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

Um Chaperon-Chaperon- und Chaperon-Substrat-Interaktionen zu untersuchen, führen wir synthetische Interaktionsscreens bei Caenorhabditis elegans mit RNA-Interferenz in Kombination mit leichten Mutationen oder Überexpression von Chaperonen durch und überwachen gewebespezifische Proteindysfunktion auf organismischer Ebene.

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Dieses Protokoll stellt eine Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen unter Verwendung von Glutathion-verknüpften Spenderperlen mit GST-verschmolzenen TPR-Motiv-Co-Chaperonen und Akzeptorperlen in Verbindung mit einem Hsp90-abgeleiteten Peptid vor. Wir haben diese Technik verwendet, um kleine Moleküle zu screenen, um Hsp90-FKBP51- oder Hsp90-FKBP52-Interaktionen zu stören, und potente und selektive Hsp90-FKBP51-Interaktionshemmer identifiziert.

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Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, die eine analytische Größenausschlusschromatographie zur Untersuchung der Histon-Chaperon-Oligomerisierung und -stabilität, den Pull-Down-Assay zur Entschlüsselung von Histon-Chaperon-Histon-Interaktionen, die AUC zur Analyse der Stöchiometrie der Proteinkomplexe und den Histon-Chaperoning-Assay zur funktionellen Charakterisierung eines mutmaßlichen Histon-Chaperons in vitro umfassen.

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DNA-Vorhang, ein Hochdurchsatz-Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren, bietet eine Plattform für die Echtzeit-Visualisierung verschiedener Protein-DNA-Interaktionen. Das vorliegende Protokoll verwendet die DNA-Vorhangtechnik, um die biologische Rolle und den molekularen Mechanismus von Abo1 zu untersuchen, einer Schizosaccharomyces pombe Bromodomänen-haltigen AAA+ ATPase.

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Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente (Video) | JoVE Journal

Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente

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