Workflow für Hoch Inhalt, einzelne Zell Quantifizierung der Fluoreszenzmarker von Universal Mikroskop Daten, Unterstützung von Open Source Software

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Reaktionen einzelner Zellen objektiv zu messen, indem spezifische Fluoreszenzmarkerintensitäten aus Mikroskopbildern quantifiziert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst eine adhärente Gewebekulturzelle einem irna-vermittelten Gen-Knockdown unterzogen wird. Im zweiten Schritt werden die Zellen fluoreszenzgefärbt und dann auf mehrere interessante Marker abgebildet.

Im letzten Schritt wird die Expression der Marker innerhalb bestimmter subzellulärer Regionen, also einzelner Zellen, algorithmisch definiert. Letztendlich können die zellulären Reaktionen auf biologische Signale aus dem Gen-Knockdown analysiert werden, indem die Fluoreszenzexpressionsniveaus der interessierenden Marker und ihre subzelluläre Translokation gemessen werden. Dieses Verfahren gibt jedoch Einblick in die Regulation des G-1-Zellzyklus-Transits als Reaktion auf siRNAs.

Es kann auch für Studien zur Erzeugung fluoreszierender Zellbilder, zur Untersuchung des Kerntransports und der Proteinhomöostase eingesetzt werden. Daniel Wek und Car K HO, Postdoc-Kollegen aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit der Abgabe von 70 Mikrolitern 200 nanomolare Irna, verdünnt mit einem Irna-Puffer in die entsprechenden Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Platte in einer sterilen Gewebekulturhaube. Geben Sie dann 105 Mikroliter Transfektionslipid, verdünnt in 40 Volumina serumfreiem DMEM-Medium, in jede Vertiefung von sir a mischen Sie die Platte durch sanfte Vibration der Raumtemperatur und unterteilen Sie dann nach 10 Minuten die resultierenden 175 Mikroliter in drei 50-Mikroliter-Replikate pro Ziel in eine undurchsichtige, mit Gewebekultur behandelte 96-Well-Platte mit transparentem Boden.

Geben Sie anschließend 8.000 Zellen pro Vertiefung in 150 Mikroliter DMEM mit 10 % Serum direkt auf die 50 Mikroliter Lipid-Irna-Komplexe, ohne zu mischen. Verschließen Sie dann die Platte mit einer sterilen, selbstklebenden, atmungsaktiven Membran und legen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. 48 Stunden später aspirieren Sie das Medium von den Platten.

Fixieren Sie dann die Zellen in 100 Mikrolitern 4%Puffer-Formaldehyd in einem Abzug bei Raumtemperatur. Nach 10 Minuten aspirieren Sie das Fixiermittel und führen nach der letzten Wäsche drei 100-Mikroliter-Wäschen mit PBS durch. Entfernen Sie das PBS und perforieren Sie die Zellen mit drei Zyklen von 100 Mikrolitern Permeationslösung, Inkubationen von jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Entfernen Sie nach der letzten Inkubation die Permeationslösung und fügen Sie dann 100 Mikroliter Blocklösung pro Vertiefung für 30 Minuten bei Raumtemperatur hinzu.

Aspirieren Sie dann die Blocklösung und untersuchen Sie die Zellen innerhalb von zwei Wochen nach der Markierung mit 50 Mikrolitern des primären Antikörpers von Interesse, ein konfokales UC-Mikroskop mit einem 20-fach-Objektiv, um separate 16-Bit-Graustufen-TIFF-Bilder in drei Kanälen aufzunehmen, die dem DNA-Farbstoff GFP und der Immunfärbung entsprechen. Flora-Fours erfassen viele nicht überlappende Bildsätze oder Frames, um etwa 1000 bis 2000 Zellen pro Well abzubilden. Systematisches Benennen der Bilddatei mit den Metadateninformationen, sodass jeder Dateiname eine eindeutige Kombination aus Experimentname, Well-Adresse, Frame-Nummer und Kanalkennung ist.

Öffnen Sie dann die Cell Profiler-Software, und klicken Sie auf Datei und Pipeline importieren. Wählen Sie anschließend unter Aus Datei die Datei Drei-Kanal-Pipeline-CP-Pipe-Datei aus, die die notwendigen Anweisungen für die Software zur Interpretation der Bilddatei-Metadaten aus dem gespeicherten Dateinamen enthält. Convention Cell Profiler kann nun verwendet werden, um die Bilder in Beziehung zu setzen, die Kern-DNA und die Antikörperintensitäten aus den Dateien zu extrahieren und den GFP-Kanal zu verwenden, um das Verhältnis der Kern- zur Zytoplasmaintensität zu berechnen. Klicken Sie für jede erkannte Zelle auf die Schaltfläche Ausgabeeinstellungen anzeigen und dann auf die Standardeingabe- und Standardausgabeordner.

Auswählen des Speicherorts der Bilddateien für die Analyse bzw. des Ziels für die extrahierten Daten. Klicken Sie dann im Fenster der Analysemodule auf die entsprechenden Augensymbole, um die Fenster zur Identifizierung primärer Objekte und tertiärer Objekte während der Analyse zu beobachten, und klicken Sie auf Bilder analysieren, wenn die Analyse abgeschlossen ist. Klicken Sie im Meldungsfeld auf OK und wechseln Sie zum Standardausgabeordner Speicherort, in dem alle Datendateien als kommagetrennte Dateien gespeichert werden.

Um die Datenextraktion durchzuführen, suchen Sie die neue Zellkern-CSV-Datei, die in der Ausgabe des Zellprofilers enthalten ist und die einzelnen Zelldaten für die Intensität der fluoreszierenden nuklearen Antikörper, die Intensität der nuklearen DNA und die GFP CDK zwei Reporterverhältniswerte enthält. Kopieren Sie die bereitgestellte Pulsskriptdatei in den Gangklassifikator PL in denselben Ordner wie die CSV-Datendatei der Kerne. Doppelklicken Sie dann auf das Symbol für Pearl Script.

Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie den vollständigen Namen der Datendatei ein, gefolgt von einem DOT-CSV-Dateinamen für die Datei, in der die Zellen gated werden sollen, und den Gate-Werten für die Antikörperfluoreszenz und die G FP CDK-zwei Reporterdaten. Vergewissern Sie sich, dass die neu erstellte Datei die Rohwerte der einzelnen Zellassays aus dem ursprünglichen Zellprofil der Daten mit den Subpopulationsbeschriftungen kombiniert, die anzeigen, wie jede Zelle aus jedem Well im Vergleich zu beiden Gates abschneidet. Öffnen Sie nun die R Studio-Software, um die Daten für jede experimentelle Bedingung unter Verwendung der einzelnen Zell-Subpopulationsbeschriftungen darzustellen, indem Sie auf Datei und Datei öffnen klicken und dann die bereitgestellte Analysepunkt-R-Datei auswählen.

Geben Sie die Computeradresse des Ordners ein, der die abgegrenzten Daten enthält, einschließlich des Laufwerkbuchstabens und des Namens der Datei selbst. Markieren Sie dann die Linien eins bis 17 im oberen linken Fenster unseres Studios und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Schwellenwerte für die experimentellen Daten und die Details zur Bohrlochposition einzugeben. Markieren Sie abschließend die einzelnen Blöcke des verbleibenden Codes unterhalb von Zeile 17 und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die entsprechenden Diagramme zu erstellen.

Beobachten Sie die Plots im Fenster in der unteren rechten Ecke unseres Studios und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Exportieren, um diese in einer Vielzahl von Formaten zu speichern. Der hier beschriebene Arbeitsablauf analysiert die Fluoreszenzmikroskopbilder, um Rohdaten in Form einer Liste zu erstellen, in der jede identifizierte Zelle und die entsprechenden Assay-Werte aufgeführt sind. Für die Analyse dieser Daten gibt es viele Möglichkeiten.

In diesen Histogrammdiagrammen ermöglichen beispielsweise die Assay-Werte für die mit Kontroll-RNAs behandelten Zellen die Identifizierung der geeigneten Gates für den Schwellenwert für jeden Assay. Die Gating-Schwellenwerte werden dann mithilfe eines Pulsskripts angewendet, um jede Zelle in den Rohdaten entsprechend dem Assay-Ergebnis zu markieren. Dieser Markierungsansatz unterstützt sowohl die vorläufige visuelle als auch die automatisierte Beurteilung der Beziehungen zwischen den Behandlungen und der Subpopulationsverteilung selbst sehr großer Datensätze einzelner Zelldaten.

Zum Beispiel führten in diesem repräsentativen Experiment drei Irna-Knockdown-Bedingungen zu gegensätzlichen Verteilungen der Zellen relativ zu den Gates der beiden Assays. Die R-Diagramme verwenden die Beschriftungen, um die prozentualen Verteilungen der Zellen in den einzelnen Quadranten zu berechnen. Die Markierungen ermöglichen auch den Querverweis auf zusätzliche Fluoreszenzmessungen mit den Assay-Daten.

In diesem Experiment wurden die Subpopulationen von Zellen, die mit SI CDK sechs behandelt wurden, nach ihren jeweiligen Assay-Markierungen gruppiert und als Histogramme der nukleären DNA-Färbung aufgetragen. Diese Verwendung der Zelldatenmarkierungen zeigt die Beziehung zwischen den beiden Zellassays und dem DNA-Gehalt in den Zellen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es immer wichtig, daran zu denken, die Parameter für die Bildsegmentierung bei der Verwendung des Cell Profilers zu testen und anzupassen.

Dies ist besonders wichtig, wenn neue oder ungetestete Bilddateien zum ersten Mal verwendet werden. Okay.