Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Bioprinting-Methodik, die ein automatisiertes robotergestütztes Abscheidesystem verwendet, das geätzte topographische Leitfäden mit der präzisen Abscheidung einer Zelle mit Hydrogel-Biotinte verbindet. Die gedruckten Zellen werden direkt auf die geätzten Merkmale aufgebracht und sind in der Lage, diese zu erfassen und sich daran zu orientieren.

Das übergeordnete Ziel dieser automatisierten robotergestützten Dosiertechnik ist es, eine Oberfläche für die topografische Zellführung zu schaffen und dann die Zellen nach einem programmierten Muster an diese Merkmale zu liefern, um die Kontrolle über das Verhalten und die Verteilung der Zellen zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biomedizintechnik zu beantworten, z. B. wie Oberflächentopologien das Zellverhalten sowohl in Monokulturen als auch in Cokulturen beeinflussen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Programmieren und Drucken von Zellführungsmustern im Vergleich zu etablierteren Methoden weniger zeitaufwändig ist.

Es enthält auch einen Zellverabreichungsschritt für eine kontrollierte Dosierung. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir erkannten, dass 2D-Muster von Zellen, die in Hydrogelen abgelagert sind, von der Oberflächenführung profitieren könnten. Aus diesem Grund haben wir diese Technik entwickelt, um Hydrogele auf eine Weise zu drucken, die den Oberflächenmerkmalen entspricht.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines gegendruckgestützten robotergestützten Dosiersystems als auf Oberflächenätzen und Extrusion basierender Biodrucker. Um eine Styroporoberfläche für das Ätzen und Bedrucken vorzubereiten, wählen Sie eine ein Millimeter dicke Polystyrolplatte aus. Dickere Bleche biegen sich stärker.

Behandeln Sie dann das Blatt mit Sauerstoffplasma. Stellen Sie den Sauerstoffgasregler auf zwei bar ein. Schalten Sie dann das Plasmagerät ein und schalten Sie die Vakuumpumpe ein.

Fahren Sie fort, die Maschine auf 150 Watt und 30 Standardkubikzentimeter pro Minute Sauerstoffgasfluss zu programmieren, und setzen Sie das Blatt 10 Minuten lang diesen Bedingungen aus. Evakuieren Sie dann die Kammer, verschließen Sie die Tür und starten Sie den Zyklus. Tauchen Sie dann das behandelte Blatt in reines fötales Rinderserum und inkubieren Sie es zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter Rühren.

Waschen Sie das Blatt nach der Serumbehandlung dreimal mit 1X PBS und sterilisieren Sie das Blatt. Lassen Sie das Blatt nach der letzten Wäsche etwa 12 Stunden lang über Nacht in einem 37 Grad heißen Ofen trocknen. Bereiten Sie zunächst einen Druckstift für das Ätzen vor.

Führen Sie mit großer Sorgfalt eine Textilnadel mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern in die Düse einer Dosierspritze ein, bis sie verkeilt und gesichert ist. Wenn Sie zum ersten Mal versuchen, eine biogedruckte Anordnung zu erstellen, skizzieren Sie das gewünschte Muster auf Millimeterpapier mit nummerierten Achsen, um die x- und y-Koordinaten zu generieren. Geben Sie dann die Koordinaten des Musters in eine Tabelle ein.

Wählen Sie anschließend in der Drucksoftware Programm, Programm hinzufügen und dann Bearbeiten, Punkt hinzufügen, um das Programm einzurichten. Kopieren Sie dann die x- und y-Koordinatenwerte aus der Tabelle in die Druckausgabesoftware. Kalibrieren Sie vor jedem Lauf die z-Höhe des Roboters, um die Kontaktposition des Stifts einzustellen.

Wählen Sie zunächst die Option Roboter. Klicken Sie dann auf Modus ändern und aktivieren Sie die Option Unterrichtsmodus. Dadurch wird die JOG-Funktion des Roboters aktiviert.

Um den Roboter zu JOG zu machen, bringen Sie ihn zunächst in seine Standardposition, indem Sie Roboter, Meca Initialisieren auswählen. Dann, Roboter, JOG. Geben Sie dann in die x- und y-Schlitze den Abstand in Millimetern ein, der erforderlich ist, um den Stift genau auf dem Ursprung des Musters zu platzieren.

Geben Sie dann, ebenfalls in Millimetern, einen numerischen Wert in den z-Schlitz ein, um den Stift oder die Düse in Kontakt mit der Oberfläche zu bringen, ohne die Oberfläche zu biegen oder einzudrücken. Dies wird als Startwert von z festgelegt. Die Tiefe jeder Nut kann mit Hilfe der z-Höhe variiert werden.

Zum Beispiel können die geschnittenen Rillen 40, 80 oder 170 Mikrometer tief sein. Es erfordert Konzentration und genaue Beobachtung, um einen Kontaktpunkt zu finden, an dem sich der Stift nicht verbiegt oder eine spürbare Vertiefung auf der Oberfläche entsteht. Um den Erfolg zu gewährleisten, empfehlen wir, mehrere Blätter vorzubereiten und das Programm in unterschiedlichen z-Höhen laufen zu lassen, um die ideale Ausgangsposition zu finden.

Der nächste Schritt besteht darin, die Druckanweisung für jeden der Koordinatenpunkte zu definieren. Verwenden Sie Start of Line Dispense, um den ersten Punkt und die Druckinitiierung zu definieren. Verwenden Sie Line Passing, um die Zwischenpunkte zu bestimmen, und verwenden Sie schließlich End of Line Dispense, um dem Roboter zu signalisieren, dass der Drucklauf beendet werden soll.

Um das Programm an den Roboter zu übermitteln, wählen Sie Roboter, C&T-Daten senden. Starten Sie dann den Lauf, indem Sie Roboter, Modus ändern, Laufmodus wechseln und die Einstellung auf Ausführen ändern. Starten Sie abschließend den Druck.

Um die Biotinte herzustellen, lösen Sie 2% Gelatine in Alpha MEM auf, die mit 10% FBS und 2% antibiotischem Antimykotikum ergänzt wird. Stelle das Medium zwei Stunden lang auf 60 Grad Celsius, damit sich die Gelatine im Medium auflösen kann. Kultivieren Sie die Zellen für die Biotinte in 10-Zentimeter-Schalen auf 70 % Konfluenz.

Alle Zellen, die auf Oberflächenleitmerkmale reagieren, können verwendet werden, und sie sollten eine fluoreszierende Markierung exprimieren, damit sie während des Einbettungsprozesses gesehen werden können. Geben Sie die angehängten Zellen in die Suspension ab, indem Sie das Medium entfernen, die Zellen mit PBS waschen und die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit einer 1-fachen Trypsin-EDTA-Lösung beschichten. Nachdem Sie das Trypsin mit Medium neutralisiert haben, sammeln Sie die Zellen in einer Suspension und pelletieren Sie sie fünf Minuten lang bei 1.000 g.

Beschreiben Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 0,5 Millilitern Medium. Nach der Messung der Zelldichte mischen Sie die Suspension in die abgekühlte Biotintenlösung, um eine Lösung mit fünf Millionen Zellen pro Millimeter herzustellen. Gießen Sie dann die zelltragende Biotinte in eine vorbereitete Druckspritze, die durch eine Köderkappe blockiert ist.

Kühlen Sie die beladene Spritze auf vier Grad Celsius, um eine druckbare Viskosität zu erreichen. Nehmen Sie dann die geladene und gekühlte Spritze heraus, entfernen Sie die Spritzenkappe und setzen Sie die Druckdüse auf. Befestigen Sie dann die beladene Spritze an der Abgabeanlage und schließen Sie sie an die Luftdruckleitungen an.

Um die Biotinte auf das vorgefertigte Muster zu drucken, müssen die Kanten und Linien deutlich sein. Ein präziser Druck wird durch die Optimierung des Gegendrucks des Spenders und der Nadelstärke der Druckdüse erreicht. Stellen Sie den Gegendruck des Dispensers auf 0,05 Megapascal für eine 10-Milliliter-Spritze mit einer konischen 34-Gauge-Nadel ein.

Anschließend stellen Sie in der Software die Schreibgeschwindigkeit auf einer Styroporfolienoberfläche auf fünf Millimeter pro Sekunde ein. Ordnen Sie nun dem programmierten Muster folgend die zellularisierte Biotinte auf die vorgeätzten Rillen auf. Lassen Sie das Blatt nach dem Ablegen der Zellen 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Decken Sie später das gedruckte Zellgerüst mit dem entsprechenden Wachstumsmedium ab und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang, damit sich die Zellen vor weiteren Experimenten anheften. Stammzellen, die durch Bioprinting in der Biotinte ausgesät wurden, sedimentierten schließlich an die Oberfläche und tasteten und verlängerten sich entlang einer Richtung der diskret geätzten Linien. Zellen, die ohne Bioprinting in Kulturmedium ausgesät wurden, ausgerichtet in Richtung der Merkmale.

Sie bedeckten jedoch auch die gesamte Oberfläche, so dass die Biotinte die Zellen auf die gedruckte Spur beschränkte. Wenn die Zellen ohne die geätzten Merkmale auf Bleche gesät wurden, zeigten sie keine Orientierung oder Ausrichtung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Rillen auf der Styroporplatte präzise ätzt und dann präzise Zellen in die Rillen druckt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zwei bis drei Stunden durchgeführt werden. Für Forscher auf dem Gebiet des Bioengineerings ist es sehr nützlich, Wechselwirkungen zwischen Zelloberflächen in Modellen aufzudecken, bei denen Zellanisotropie und -positionierung erforderlich sind. Vergessen Sie nicht, dass die Biotinte lebende Zellen enthält und es sehr wichtig ist, beim Drucken der Bögen eine sterile Technik zu verwenden.