Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, lebensfähige zellbeladene Konstrukte mit einer komplexen Geometrie unter Verwendung eines 3D-Bioprints zu generieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Stromazellen aus menschlichem Fettgewebe aus Kultur isoliert werden. Als nächstes werden die Zellen mit frisch zubereiteter oxidierter RGD-konjugierter Alginat-Biotinte gemischt.

Im letzten Schritt wird die Zelle LA im Biomaterial mittels Bioprinting extrudiert. Letztendlich wird die konfokale Mikroskopie verwendet, um die Lebensfähigkeit, Proliferation und Migration der biogedruckten Zellen zu analysieren. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Verfahren, wie z.B. der Gerüstbildung und dem Cell Seeding, besteht darin, dass Sie mit unserem Verfahren die Zellen und Zellaggregate direkt dort platzieren können, wo sie zur Bildung des Gewebes benötigt werden.

Heute wird das Verfahren von Sarah Grace Dennis, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit der Aussaat von 350.000 Stromazellen aus menschlichem Fettgewebe auf einen behandelten T 75-Kolben in 15 Millilitern TMEM mit niedrigem Glukosegehalt zur Expansion in einem Zellkultur-Inkubator. Wenn die Kultur 80 % Co-Flüssigkeit erreicht, entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen in fünf Millilitern DPBS ohne Kalzium und Magnesium.

Dann inkubieren Sie die Zellen in fünf Millilitern Trypsin und DPBS für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius, wenn sich die Zellen abgelöst haben, stoppen Sie die enzymatische Reaktion mit drei Millilitern Zellkulturmedium und überführen Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren das Pellet in zwei Millilitern Zellkulturmedium. Dann zählen Sie die Zellen, geben Sie ein 1,3 mal 10 der sechs Zellen Aliquot in ein 15 Milliliter konisches Röhrchen und schleudern Sie die Zellen wieder herunter.

Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frisch zubereiteter Bio-Tinte und achten Sie darauf, dass die Zellen gleichmäßig in der wässrigen Alginatlösung verteilt sind. Laden Sie dann die Zellen in eine sterile, druckerkompatible Drei-Milliliter-Spritze und schrauben Sie eine sterile 22-Gauge-Kunststoffspitze auf. Schalten Sie nun den Bioprint, jeden der Spendercomputer und das Umlaufwasserbad ein.

Stellen Sie die Badtemperatur für den Mechanismus und die Druckparameter für jeden Spender auf dem entsprechenden Spendercomputer manuell auf vier Grad Celsius ein. Stellen Sie das Dosiervolumen auf 230 Nanoliter, die Anzahl der Rückschritte auf Null und die Abgaberate auf 10 Mikroliter pro Sekunde ein. Öffnen Sie dann die Designsoftware und das Programm zur Anzeige der USB-Kameraanzeige auf dem Computer.

Geben Sie als Nächstes manuell die Koordinaten für ein Fünf-mal-Fünf-Punkt-Array mit einem Abstand von 2,4 Millimetern zwischen den Tropfen ein. Speichern Sie das Programm und senden Sie das Programm an den Roboter. Stellen Sie dann eine gelatinehaltige Petrischale mit Titandioxid auf den vier Grad Celsius heißen Druckertisch und schließen und verriegeln Sie die Kammertür.

Initialisieren Sie mit der speicherprogrammierbaren Steuerung die ultravioletten Lichtquellen, um die Kammer zu sterilisieren. Öffnen Sie nach 90 Sekunden die Kammer und laden Sie die Spritze mit der Stromazellsuspension des menschlichen Fettgewebes in die erste Pistole, schließen und verriegeln Sie die Kammertür und verwenden Sie die speicherprogrammierbare Steuerung, um das Lüftersystem einzuschalten. Warten Sie 30 Sekunden, bis sich der Innendruck ausgeglichen hat, und führen Sie dann das Programm mit dem geometrischen Pfad und den Druckparametern während des gesamten Druckvorgangs aus.

Beobachten Sie die Anzeige der USB-Kamera auf dem Computer, um einen genauen und gleichmäßigen Druck zu bestätigen. Um die Lebensfähigkeit der biogedruckten Konstrukte zu quantifizieren, tauchen Sie sie in frisch zubereitete Fleckenlösung. Lege die Konstrukte dann für 15 Minuten im Dunkeln in den Kühlschrank, damit der Fleck fest werden kann.

Dann werden die gefärbten Konstrukte anhand eines konfokalen Mikroskopbildes als lebendig eingestuft, wenn die Zellen gelb oder grün erscheinen, wenn sie rot sind, sind die Zellen tot. Wie diese Ergebnisse zeigen, ermöglicht das Bioprinting die genaue und konsistente Abscheidung von Zellhilfsmitteln und Hydrogelen an bestimmten dreidimensionalen Stellen mit Hilfe von computergestützter Software. Die Computersoftware bestimmt die Platzierung jedes Tröpfchens und steuert viele der Parameter für die Dosierung.

Eine der Voraussetzungen für eine erfolgreiche Bioprinting-Technik ist, dass die Zellen hier lebensfähig bleiben. Zellen, die mit alginischer Biotinte gedruckt wurden, wurden, wie gerade gezeigt, eine Stunde und acht Tage nach dem Druck analysiert, wobei 98 % der Zellen am Tag Null grün und lebensfähig erschienen und am achten Tag bis zu 95 %. Wie die rote Färbung zeigt, wurden zu beiden Zeitpunkten nur wenige tote Zellen beobachtet, was die Eignung der alternativen Tinte für das Bioprinting bestätigt.

Darüber hinaus verbessert die RGD-konjugierte Algin-Tinte die Bindung der Zellen an die gedruckten Konstrukte, was zu einer verbesserten Zellausbreitung und -proliferation führt, die in drei separaten Bereichen des Hydrogels auf einer Null und Acht quantifiziert wird. Hier wurde ein Vergleich der Qualität der RGD-Peptidkonjugation auf ginnet bio ink mit der alleinigen Verwendung von ginnet bio ink am achten Tag verglichen. Die Zellausbreitung, die in der RGD-konjugierten Ginnet-gefärbten Probe beobachtet wurde, deutete auf den erfolgreichen Einbau des Peptids in den Ginnet hin, ein Phänomen, das in den nicht konjugierten Bioprint-Proben nach seiner Entwicklung auffällig fehlte.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet des Tissue Engineering den Weg, die additive Fertigung als Mittel zum Zusammenbau lebender technischer Konstrukte zu erforschen.