Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lebensfähige, zellbeladene Konstrukte mit komplexer Geometrie unter Verwendung eines 3D-Bioprinters herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst humane stromale Zellen aus dem Fettgewebe aus der Kultur isoliert werden. Anschließend werden die Zellen mit frisch hergestellter oxidierten, RGD-konjugierter Alginate-Biotinte gemischt.

Im letzten Schritt werden die Zellen der Biomaterialien mittels Bioprinting extrudiert. Abschließend wird die Vitalität, Proliferation und Migration der biogedruckten Zellen mittels konfokaler Mikroskopie analysiert. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Verfahren, wie der Gerüstbildung und Zellbesiedelung, liegt darin, dass mit unserem Verfahren die Zellen und Zellaggregate direkt exakt dort platziert werden können, wo sie benötigt werden, um das Gewebe zu bilden.

Heute wird Sarah Grace Dennis, eine Doktorandin aus meinem Labor, die Prozedur demonstrieren. Beginnen Sie damit, 350.000 humane Stromazellen aus Fettgewebe in 15 Milliliter niedrigem Glukose-TMEM in einem behandelten T-75-Fläschchen zu säen, um sie in einem Zellkulturschrank zu vermehren. Wenn die Kultur eine Konfluenz von 80 % erreicht hat, entfernen Sie das Medium und waschen die Zellen mit fünf Milliliter DPBS ohne Calcium und Magnesium.

Anschießend inkubieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius in fünf Millilitern Trypsin und DPBS; wenn sich die Zellen gelöst haben, beenden Sie die enzymatische Reaktion mit drei Millilitern Zellkulturmedium und überführen die Zellen in ein 50-Milliliter-Konischgefäß. Danach zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren das Pellet in zwei Milliliter Zellkulturmedium. Anschließend zählen Sie die Zellen, übertragen ein 1,3 × 10⁶-Zell-Aliquot in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und zentrifugieren die Zellen erneut.

Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frisch hergestelltem Bio-Ink, wobei darauf zu achten ist, die Zellen gleichmäßig in der wässrigen Alginate-Lösung zu verteilen. Danach die Zellen in eine sterile, druckerkompatible 3-Milliliter-Spritze geben und eine sterile Kunststoffspitze mit 22 Gauge anschrauben. Schalten Sie nun den Bioprinter, die jeweiligen Dispenser-Computer und das zirkulierende Wasserbad ein.

Stellen Sie die Badtemperatur manuell auf vier Grad Celsius ein, um den Aktionsmechanismus und die Druckparameter für jeden Dispenser auf dem zugehörigen Dispenser-Computer einzurichten. Stellen Sie das Ausgabevolumen auf 230 Nanoliter, die Anzahl der Rückwärtsschritte auf null und die Abgaberate auf 10 Mikroliter pro Sekunde ein. Öffnen Sie anschließend die Designsoftware und das Programm zur Anzeige der USB-Kamera auf dem Computer.

Als Nächstes geben Sie manuell die Koordinaten für ein fünf mal fünf Punkteraster mit einem Abstand von 2,4 Millimetern zwischen den Tropfen ein. Speichern Sie das Programm und übertragen Sie es an den Roboter. Anschließend platzieren Sie eine mit Gelatine und Titandioxid gefüllte Petrischale auf der Druckplattform bei vier Grad Celsius und schließen sowie verriegeln Sie die Kammertür.

Mit der speicherprogrammierbaren Steuerung wurden die ultravioletten Lichtquellen initialisiert, um die Kammer zu sterilisieren. Nach 90 Sekunden öffnen Sie die Kammer, laden die Spritze mit der Suspension menschlicher stromaler Fettgewebszellen in Pistole eins ein, schließen und verriegeln die Kammertür und schalten mithilfe der speicherprogrammierbaren Steuerung das Lüftungssystem ein. Warten Sie 30 Sekunden, bis sich der Innendruck ausgeglichen hat, und führen Sie dann das Programm mit dem geometrischen Pfad und den Druckparametern während des gesamten Druckvorgangs aus.

Beobachten Sie die Anzeige der USB-Kamera auf dem Computer, um einen genauen und gleichmäßigen Druck zu bestätigen. Um die Lebensfähigkeit der biogedruckten Konstrukte zu quantifizieren, tauchen Sie diese in frisch zubereitete Farblösung ein. Anschließend stellen Sie die Konstrukte 15 Minuten im Dunkeln in den Kühlschrank, damit die Färbung einsetzen kann.

Danach mithilfe eines konfokalen Mikroskops die gefärbten Konstrukte abbilden: Wenn die Zellen gelb oder grün erscheinen, sind sie lebendig; erscheinen sie rot, sind die Zellen tot. Wie diese Ergebnisse zeigen, ermöglicht das Bioprinting die genaue und konsistente Ablagerung von Zellen und Hydrogelen an spezifischen dreidimensionalen Positionen mithilfe einer computergesteuerten Software. Die Computersoftware bestimmt die Position jedes Tröpfchens und steuert viele der Parameter für die Dosierung.

Eine der Voraussetzungen für eine erfolgreiche Bioprinting-Technik ist, dass die Zellen hier lebensfähig bleiben. Zellen, die wie gerade gezeigt in alginathaltiger Bio-Tinte gedruckt wurden, wurden eine Stunde sowie acht Tage nach dem Druck analysiert, wobei 98 % der Zellen am Tag null grün erschienen und lebensfähig waren, und am achten Tag noch 95 %. Wie die rote Färbung zeigt, wurden zu beiden Zeitpunkten nur wenige tote Zellen beobachtet, was die Eignung der alternativen Tinte für das Bioprinting bestätigt.

Weiterhin verbessert die mit RGD konjugierte Algin-Tinte die Anheftung der Zellen an die gedruckten Konstrukte, was zu einer verbesserten Zellausbreitung und -proliferation führt, wie an drei separaten Stellen des Hydrogels am Tag null und am Tag acht quantifiziert wurde. Hier wurde die Qualität der RGD-Peptid-Konjugation auf der Ginnet-Bio-Tinte mit der alleinigen Verwendung von Ginnet-Bio-Tinte am Tag acht verglichen. Die in der mit RGD konjugierten, gefärbten Ginnet-Probe beobachtete Zellausbreitung deutete auf eine erfolgreiche Einbindung des Peptids in die Ginnet hin, ein Phänomen, das in den nicht konjugierten Bioprint-Proben nach der Entwicklung deutlich fehlte.

Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet des Gewebegewebes den Weg, um die additive Fertigung als Mittel zur Herstellung lebender konstruierter Gewebe zu erforschen.