Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Das übergeordnete Ziel dieser mikrofluidischen Bioprinting-Methode ist es, ein vaskularisiertes Gewebekonstrukt zu erzeugen. Diese Methode kann Schlüsselfragen in der Biofabrikation von vaskularisierten Geweben lösen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie vielseitig einsetzbar ist, um einen dreidimensionalen, formkontrollierten Gefäßbehälter für die Züchtung von vaskularisierten Geweben durch einen sekundären Zellaussaatprozess zu erzeugen.

Obwohl dieses Protokoll einen Einblick in die Entwicklung von vaskularisiertem Herzgewebe bietet, kann es auch auf viele andere Gewebetypen wie Leber, Haut und sogar Krebs angewendet werden. Allgemeine, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, können Schwierigkeiten haben, da die Einrichtung des Biodruckers möglicherweise nicht einfach ist. Um dieses Verfahren zu starten, konstruieren Sie einen konzentrischen mikrofluidischen Druckkopf mit zwei Schichten, indem Sie eine kleinere stumpfe Nadel, die als Kern dient, in die Mitte der größeren stumpfen Nadel einführen, die als Hülle dient.

Achten Sie darauf, dass die Kernnadel etwa einen Millimeter aus der Außenschale herausragt. Führen Sie danach eine 23-Gauge-Nadel in umgekehrter Richtung in den Lauf der zentralen Nadel ein. Machen Sie ein Loch an der Seite des Zylinders der äußeren Nadel und setzen Sie einen Metallverbinder in der gleichen Größe ein.

Mit Epoxidkleber versiegeln. Montieren Sie den Extruder mit einem Polymethylmethacrylat- oder PMMA-Halter auf den Kopf eines Biodruckers. Als nächstes für die Injektion der Biotinte und der Vernetzungslösung durch zwei PVC-Schläuche einzeln verbinden Sie die Einlässe des Druckkopfes mit einer Zweikanal-Spritzenpumpe.

Stellen Sie die Biotinte mit einer Mischung aus Alginat, gelMA und Photoinitiator her. Gelöst in 25 millimolaren HEPES-Puffern, der 10 % fötales Rinderserum oder FBS enthält. Stellen Sie dann eine Lösung von 0,3 molaren Calciumchlorid in HEPES-Puffer her, der 10 % FBS enthält, um als vernetzende Trägerflüssigkeit zu dienen.

Unmittelbar vor dem Bioprinting trypsinisieren Sie menschliche Nabelvenendothelzellen oder HUVECs für fünf bis 10 Minuten. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 800 U/min in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Resuspendieren Sie die Zellen in der Biotinte in einer Konzentration von fünf bis 10 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter, indem Sie langsam fünf- bis zehnmal pipettieren.

Verwenden Sie anschließend eine Zweikanal-Spritzenpumpe, um die Injektion der HUVECs laiden Bioink durch einen Kanal und der Vernetzungsflüssigkeit durch den anderen Kanal mit einer Durchflussrate von fünf Mikrolitern pro Minute zu starten. Lassen Sie die Flüsse bis zu einer Minute lang ununterbrochen laufen, bis sie sich stabilisieren. Danach starten Sie die Druckkopfbewegung, indem Sie die Abscheidungsgeschwindigkeit des Bioprinters von etwa vier Millimetern pro Sekunde beibehalten.

Dieses Bioprinting soll zu einer schnellen ionischen Gelierung der Alginatkomponente und zur Ablagerung eines Mikrofasergerüsts führen. Nachdem das Gerüst gedruckt wurde, vernetzen Sie die gelMA-Komponente 20 bis 30 Sekunden lang mit fünf bis 10 Milliwatt pro Quadratzentimeter UV-Licht, um eine chemische Gelierung zu erreichen. Entfernen Sie dann das überschüssige Calciumchlorid vom Gerüst, indem Sie es vorsichtig mit 37 Grad Celsius warmem PBS abspülen.

Kultivieren Sie dieses Gerüst in einem Endothelzellwachstumsmedium bei 37 Grad Celsius in fünf Volumenprozent CO2 für bis zu 16 Tage. Wechseln Sie das Medium mindestens alle zwei Tage. Überwachen Sie während der Kulturperiode die HUVECs unter einem Mikroskop, bis sie an die Peripherien der Gerüstmikrofasern wandern und lumenartige Strukturen bilden.

Entfernen Sie dann vorsichtig das gesamte Medium mit Kapillarkraft mit einem Stück sterilem Filterpapier aus dem intrastitiellen Raum des Gerüsts. Geben Sie sofort einen Tropfen Suspension eines sekundären Zelltyps wie Kardiomyozyten auf das Gerüst, so dass die Zellen den gesamten intrastitiellen Raum infiltrieren können. Danach inkubieren Sie dieses Gerüst in einem Inkubator für 30 Minuten bis zwei Stunden, damit die Zellen an den einzelnen Mikrofasern haften können.

Entfernen Sie nicht anhaftende Zellen, indem Sie das Gerüst vorsichtig mit PBS waschen. Kultivieren Sie dieses Gerüst in geeignetem Medium, bis das gewünschte vaskularisierte Gewebe gebildet ist. Das hier beschriebene mikrofluidische Bioprinting ermöglicht das direkte Bioprinting von mikrofibrösen Gerüsten unter Verwendung von niedrigviskosen Biotinten.

Ein Gerüst, das sechs mal sechs mal sechs Quadratmillimeter groß ist < mehr als 30 Mikrofasern enthält, könnte innerhalb von 10 Minuten biogedruckt werden. Drauf- und Seitenansichten von Gerüstmikroskopaufnahmen zeigen die hervorragende strukturelle Integrität während des Bioprinting-Prozesses. Erreicht durch die sofortige ionische Vernetzung der Alginatkomponente mit Calciumchlorid.

Nach mikrofluidischer Extrusion der Biotinte, Ionenvernetzung und Photovernetzung behielten HUVECs eine relativ hohe Lebensfähigkeit bei. Die Zellen vermehrten sich und wanderten von der anfänglich zufälligen Verteilung am Tag Null in die Peripherien der Mikrofasern am Tag 16. Neugeborene Ratten-Kardiomyozyten, die auf dem Gerüst ausgesät worden waren, reiften und bevölkerten das Gerüst.

Sie zeigten eine starke Expression von funktionellen kardialen Biomarkern. Wie sarkomerisches Alpha-Actinin und Connexin 43. Die konfokale Mikroskopie eines biogedruckten mikrofibrösen Gerüsts, das mit Kardiomyozyten besiedelt war, zeigte die Koexistenz von HUVECs und Kardiomyozyten.

HUVECs sind hauptsächlich an den Grenzen der Mikrofasern vorhanden, während die Kardiomyozyten die Außenseite der Mikrofasern umgeben. Die Zellen waren in der Lage, ihren spontanen und synchronisierten Schlag bis zu neun bis 28 Tage lang aufrechtzuerhalten. Abhängig von der Zellquelle und Konfiguration der Gerüste.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man vaskularisierte Gewebe mit der mikrofluidischen Bioprinting-Technik herstellt, sowie für die Herstellung von Druckköpfen und Bioprinter-Operationen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Herstellung des Druckkopfs und die Bedienung des Biodruckers für Personen, die noch nie einen verwendet haben, schwierig sein können. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die beiden Nadeln im Druckkopf konzentrisch zu machen und den Fluss stabilisieren zu lassen, bevor Sie mit dem Bioprinting beginnen.

Mit der Entwicklung dieser Technik verfügen Forscher auf dem Gebiet des Tissue Engineering und der Biofabrikation nun über ein weiteres Werkzeug, um vaskularisierte Gewebekonstrukte entweder für Regenerationszwecke in vivo oder für die Modellierung von Geweben in vitro zu erzeugen.