Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen
11. August 2017
Wir bieten ein generalisiertes Protokoll basiert auf einer mikrofluidische Bioprinting Strategie für engineering-ein Microfibrous Kreislauf Bett, wo eine sekundäre Zelle Art weiter in den interstitiellen Raum dieser Microfibrous Struktur, vaskularisierte Gewebe und Organellen zu generieren ausgesät werden konnte.
Das übergeordnete Ziel dieser mikrofluidischen Bioprinting-Methode ist es, ein vaskularisiertes Gewebekonstrukt zu erzeugen. Diese Methode kann Schlüsselfragen in der Biofabrikation von vaskularisierten Geweben lösen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie vielseitig einsetzbar ist, um einen dreidimensionalen, formkontrollierten Gefäßbehälter für die Züchtung von vaskularisierten Geweben durch einen sekundären Zellaussaatprozess zu erzeugen.
Obwohl dieses Protokoll einen Einblick in die Entwicklung von vaskularisiertem Herzgewebe bietet, kann es auch auf viele andere Gewebetypen wie Leber, Haut und sogar Krebs angewendet werden. Allgemeine, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, können Schwierigkeiten haben, da die Einrichtung des Biodruckers möglicherweise nicht einfach ist. Um dieses Verfahren zu starten, konstruieren Sie einen konzentrischen mikrofluidischen Druckkopf mit zwei Schichten, indem Sie eine kleinere stumpfe Nadel, die als Kern dient, in die Mitte der größeren stumpfen Nadel einführen, die als Hülle dient.
Achten Sie darauf, dass die Kernnadel etwa einen Millimeter aus der Außenschale herausragt. Führen Sie danach eine 23-Gauge-Nadel in umgekehrter Richtung in den Lauf der zentralen Nadel ein. Machen Sie ein Loch an der Seite des Zylinders der äußeren Nadel und setzen Sie einen Metallverbinder in der gleichen Größe ein.
Mit Epoxidkleber versiegeln. Montieren Sie den Extruder mit einem Polymethylmethacrylat- oder PMMA-Halter auf den Kopf eines Biodruckers. Als nächstes für die Injektion der Biotinte und der Vernetzungslösung durch zwei PVC-Schläuche einzeln verbinden Sie die Einlässe des Druckkopfes mit einer Zweikanal-Spritzenpumpe.
Stellen Sie die Biotinte mit einer Mischung aus Alginat, gelMA und Photoinitiator her. Gelöst in 25 millimolaren HEPES-Puffern, der 10 % fötales Rinderserum oder FBS enthält. Stellen Sie dann eine Lösung von 0,3 molaren Calciumchlorid in HEPES-Puffer her, der 10 % FBS enthält, um als vernetzende Trägerflüssigkeit zu dienen.
Unmittelbar vor dem Bioprinting trypsinisieren Sie menschliche Nabelvenendothelzellen oder HUVECs für fünf bis 10 Minuten. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 800 U/min in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Resuspendieren Sie die Zellen in der Biotinte in einer Konzentration von fünf bis 10 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter, indem Sie langsam fünf- bis zehnmal pipettieren.
Verwenden Sie anschließend eine Zweikanal-Spritzenpumpe, um die Injektion der HUVECs laiden Bioink durch einen Kanal und der Vernetzungsflüssigkeit durch den anderen Kanal mit einer Durchflussrate von fünf Mikrolitern pro Minute zu starten. Lassen Sie die Flüsse bis zu einer Minute lang ununterbrochen laufen, bis sie sich stabilisieren. Danach starten Sie die Druckkopfbewegung, indem Sie die Abscheidungsgeschwindigkeit des Bioprinters von etwa vier Millimetern pro Sekunde beibehalten.
Dieses Bioprinting soll zu einer schnellen ionischen Gelierung der Alginatkomponente und zur Ablagerung eines Mikrofasergerüsts führen. Nachdem das Gerüst gedruckt wurde, vernetzen Sie die gelMA-Komponente 20 bis 30 Sekunden lang mit fünf bis 10 Milliwatt pro Quadratzentimeter UV-Licht, um eine chemische Gelierung zu erreichen. Entfernen Sie dann das überschüssige Calciumchlorid vom Gerüst, indem Sie es vorsichtig mit 37 Grad Celsius warmem PBS abspülen.
Kultivieren Sie dieses Gerüst in einem Endothelzellwachstumsmedium bei 37 Grad Celsius in fünf Volumenprozent CO2 für bis zu 16 Tage. Wechseln Sie das Medium mindestens alle zwei Tage. Überwachen Sie während der Kulturperiode die HUVECs unter einem Mikroskop, bis sie an die Peripherien der Gerüstmikrofasern wandern und lumenartige Strukturen bilden.
Entfernen Sie dann vorsichtig das gesamte Medium mit Kapillarkraft mit einem Stück sterilem Filterpapier aus dem intrastitiellen Raum des Gerüsts. Geben Sie sofort einen Tropfen Suspension eines sekundären Zelltyps wie Kardiomyozyten auf das Gerüst, so dass die Zellen den gesamten intrastitiellen Raum infiltrieren können. Danach inkubieren Sie dieses Gerüst in einem Inkubator für 30 Minuten bis zwei Stunden, damit die Zellen an den einzelnen Mikrofasern haften können.
Entfernen Sie nicht anhaftende Zellen, indem Sie das Gerüst vorsichtig mit PBS waschen. Kultivieren Sie dieses Gerüst in geeignetem Medium, bis das gewünschte vaskularisierte Gewebe gebildet ist. Das hier beschriebene mikrofluidische Bioprinting ermöglicht das direkte Bioprinting von mikrofibrösen Gerüsten unter Verwendung von niedrigviskosen Biotinten.
Ein Gerüst, das sechs mal sechs mal sechs Quadratmillimeter groß ist < mehr als 30 Mikrofasern enthält, könnte innerhalb von 10 Minuten biogedruckt werden. Drauf- und Seitenansichten von Gerüstmikroskopaufnahmen zeigen die hervorragende strukturelle Integrität während des Bioprinting-Prozesses. Erreicht durch die sofortige ionische Vernetzung der Alginatkomponente mit Calciumchlorid.
Nach mikrofluidischer Extrusion der Biotinte, Ionenvernetzung und Photovernetzung behielten HUVECs eine relativ hohe Lebensfähigkeit bei. Die Zellen vermehrten sich und wanderten von der anfänglich zufälligen Verteilung am Tag Null in die Peripherien der Mikrofasern am Tag 16. Neugeborene Ratten-Kardiomyozyten, die auf dem Gerüst ausgesät worden waren, reiften und bevölkerten das Gerüst.
Sie zeigten eine starke Expression von funktionellen kardialen Biomarkern. Wie sarkomerisches Alpha-Actinin und Connexin 43. Die konfokale Mikroskopie eines biogedruckten mikrofibrösen Gerüsts, das mit Kardiomyozyten besiedelt war, zeigte die Koexistenz von HUVECs und Kardiomyozyten.
HUVECs sind hauptsächlich an den Grenzen der Mikrofasern vorhanden, während die Kardiomyozyten die Außenseite der Mikrofasern umgeben. Die Zellen waren in der Lage, ihren spontanen und synchronisierten Schlag bis zu neun bis 28 Tage lang aufrechtzuerhalten. Abhängig von der Zellquelle und Konfiguration der Gerüste.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man vaskularisierte Gewebe mit der mikrofluidischen Bioprinting-Technik herstellt, sowie für die Herstellung von Druckköpfen und Bioprinter-Operationen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Herstellung des Druckkopfs und die Bedienung des Biodruckers für Personen, die noch nie einen verwendet haben, schwierig sein können. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die beiden Nadeln im Druckkopf konzentrisch zu machen und den Fluss stabilisieren zu lassen, bevor Sie mit dem Bioprinting beginnen.
Mit der Entwicklung dieser Technik verfügen Forscher auf dem Gebiet des Tissue Engineering und der Biofabrikation nun über ein weiteres Werkzeug, um vaskularisierte Gewebekonstrukte entweder für Regenerationszwecke in vivo oder für die Modellierung von Geweben in vitro zu erzeugen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Artikel präsentiert eine mikrofluidische Biodruckmethodik, die auf die Erzeugung vaskularisierter Gewebekonstrukte abzielt. Die Technik adressiert Herausforderungen in der Biofabrikation, indem sie die Erstellung eines dreidimensionalen vaskulären Bettes ermöglicht, das mit sekundären Zelltypen besiedelt werden kann.
Wichtige Studienkomponenten
Wissensgebiet
- Biofabrikation
- Mikrofluidik
- Gewebeengineering
Hintergrund
- Die Herstellung vaskularisierter Gewebe ist entscheidend für die Organoidentwicklung.
- Aktuelle Methoden stehen vor Einschränkungen bei der Erzeugung komplexer Gewebestrukturen.
- Mikrofluidisches Bioprinting bietet einen vielseitigen Ansatz zur Überwindung dieser Herausforderungen.
- Diese Technik kann für verschiedene Gewebetypen angepasst werden, einschließlich Herz-, Leber- und Hautgewebe.
Ziel der Studie
- Ein Protokoll für die Erstellung vaskularisierter Gewebekonstrukte zu entwickeln.
- Das Verständnis von Biofabrikationstechniken zu verbessern.
- Eine Grundlage für zukünftige Anwendungen im Gewebeengineering zu liefern.
Verwendete Methoden
- Konstruktion eines dualen, konzentrischen mikrofluidischen Druckkopfs.
- Nutzung einer kleineren stumpfen Nadel als Kern innerhalb einer größeren stumpfen Nadel.
- Einsaat von sekundären Zelltypen in die mikrofibrose Struktur.
- Anwendung der Methode auf verschiedene Gewebetypen jenseits von Herzgewebe.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll generiert erfolgreich ein vaskularisiertes Gewebekonstrukt.
- Demonstrierte Vielseitigkeit bei der Erzeugung verschiedener Gewebetypen.
- Bietet Einblicke in die Konstruktion komplexer Gewebestrukturen.
- Identifiziert potenzielle Herausforderungen für Neueinsteiger im Bioprinting-Prozess.
Schlussfolgerungen
- Die mikrofluidische Biodruckmethode ist effektiv für das vaskularisierte Gewebeengineering.
- Dieser Ansatz kann Fortschritte in der Organoidforschung erleichtern.
- Zukünftige Studien können ihre Anwendung auf andere Gewebetypen und -bedingungen erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Microfluidic bioprinting enables the engineering of vascularized tissue constructs with high structural fidelity, addressing a critical bottleneck in preclinical model development. By generating perfusable microvascular networks within hydrogel scaffolds, this method supports the creation of more physiologically relevant tissue models for drug screening and mechanistic studies. The approach enhances predictive confidence in early discovery by providing a tunable platform to study cell-cell interactions, tissue maturation, and functional responses under controlled conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of endothelial-pericyte or stromal cell interactions within a defined vascular niche to validate therapeutic targets involved in angiogenesis or vascular permeability.
- Operational Value: Provides a reproducible, microfluidically controlled system for generating vascularized scaffolds with consistent microfiber architecture and lumen formation.
- Predictive Value: Supports assessment of compound effects on vascular integrity and cell migration in a human-relevant, 3D microenvironment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized microfibrous scaffolds with encapsulated endothelial cells that form lumen-like structures, enabling quantitative assessment of vascular network formation over time.
- Operational Value: Compatible with dual-channel syringe pump bioprinting, allowing precise control over bioink and crosslinking fluid delivery for high-throughput scaffold fabrication.
- Assay Readiness: Produces scaffolds with >30 microfibers in a 6x6x6 mm volume within 10 minutes, supporting scalable preparation for downstream secondary cell seeding and compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables secondary seeding of cardiomyocytes or other parenchymal cells into the interstitial space, facilitating the study of vascularized tissue maturation and synchronized contractile function.
- Translational Continuity: Supports long-term culture (>16 days) with monitoring of cell migration, lumen formation, and biomarker expression (e.g., sarcomeric alpha actinin, connexin 43) to model tissue-level responses.
- Risk Mitigation: Allows evaluation of cell viability, proliferation, and functional maturation under perfusion-like conditions, reducing attrition due to poor vascular engraftment in later stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing a vascularized platform that bridges simple monocultures and complex in vivo models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vascular-dependent pathways by enabling controlled co-culture of endothelial and parenchymal cells in a defined 3D geometry.
- Screening: Delivers assay-ready scaffolds with reproducible microstructure and endothelialization, suitable for evaluating compound effects on vascular stability and tissue organization.
- Analytics: Enables quantitative readouts via confocal microscopy of cell distribution, lumen formation, and biomarker co-localization to assess tissue quality and functional maturation.
- Translational Research: Models vascularized tissue development from early endothelial network formation to secondary cell integration, supporting preclinical validation of vascular-targeted or regenerative candidates.
- Enterprise Reuse: The microfluidic printhead design and bioink system (GelMA-alginate with ionic/photocrosslinking) represent a reusable platform adaptable to multiple tissue types (cardiac, liver, skin) and secondary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by generating vascularized tissues with perfusable lumen-like structures and sustained cellular function (e.g., synchronized beating up to 28 days).
- Operational Value: Enables standardization of scaffold fabrication through microfluidic flow control, reducing variability in microfiber diameter, crosslinking efficiency, and cell distribution.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early insight into vascular compatibility and tissue-level responses, reducing late-stage failure due to inadequate vascularization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on their effects in a human-relevant, vascularized tissue model that recapitulates key structural and functional hallmarks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including concentric needle assembly and epoxy sealing to prevent leakage.
- Dependent on dual-channel syringe pump systems and UV photocrosslinking equipment for precise bioink delivery and GelMA stabilization.
- Necessitates optimization of cell concentration (5–10×10⁶ HUVECs/mL) and flow rates (5 µL/min) to ensure cell viability and uniform encapsulation during printing.
- Requires aseptic handling and sterile filter paper for medium removal during secondary cell seeding to avoid contamination and ensure proper infiltration.
- Limited by the need for post-printing rinsing to remove excess calcium chloride, which adds a manual step that must be standardized across batches.
