Überwachung räumliche Trennung in Oberflächen Colonizing mikrobiellen Populationen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die räumliche Verteilung von mikrobiellen Stämmen während des Schwärmens, Gleitens oder der Biofilmbildung mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu beobachten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der sozialen Mikrobiologie zu beantworten, z. B. wie die räumliche Segregation die mikrobielle Interaktion beeinflusst. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Fitness und räumliche Verteilung von mikrobiellen Stämmen mit mikroskopischen Techniken und der Bildanalyse von Untersegmenten leicht beurteilt werden kann.

Verfahren wird von Theresa Hölscher, einer Doktorandin aus meinem Labor, vorgeführt. Am Tag vor dem Experiment werden drei Milliliter LB-Medium in ein Kulturröhrchen gegeben und aus einem Gefriervorrat mit B.subtilis inokuliert. Wiederholen Sie diese Inokulation mit einem separaten Röhrchen für jeden interessierenden Stamm.

Legen Sie die Röhrchen über Nacht in einen horizontalen Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius. Um Platten für Schwarm- und Gleitexperimente vorzubereiten, gießen Sie 20 Milliliter temperiertes LB-Medium in eine 90-Millimeter-Petrischale aus Polystyrol. Schließen Sie die Schüssel sofort und stellen Sie sie mindestens eine Stunde lang an eine Seite der sterilen Haube.

Bereiten Sie als Nächstes Platten für Kolonie-Biofilm-Experimente vor, indem Sie 25 Milliliter Agar zweimal SG-Medium in eine 90-Millimeter-Petrischale gießen. Verschließen Sie die Platten sofort und lassen Sie sie in Viererstapeln oder weniger mindestens eine Stunde lang abkühlen. Setzen Sie zunächst die LB-Agar-Schwarm- und Gleitplatten in eine Laminar-Flow-Haube ein und entfernen Sie die Deckel.

Lassen Sie die Platten 20 Minuten trocknen. Die Feuchtigkeit der Platten in diesen Experimenten ist entscheidend. Während überschüssige Feuchtigkeit Bakterien das Schwimmen ermöglicht, verhindert eine längere Trocknung ein Schwärmen und Verrutschen.

In ähnlicher Weise hängt die Struktur des Biofilms der Kolonie von der Trockenheit des Mediums ab. Bestimmen Sie mit einem Spektralphotometer die optischen Dichten von Starterkulturen über Nacht bei 600 Nanometern. In einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mischen Sie die auf die Dichte normierten Mengen der grün und rot fluoreszierenden Protein-produzierenden Stämme für insgesamt 200 Mikroliter.

Wirbeln Sie die Röhre drei Sekunden lang durch. Mit einer Mikropipette werden zwei Mikroliter der Mischkultur auf die Mitte einer vorgetrockneten 90-Millimeter-LB-Agarplatte in der Laminar-Flow-Haube gesprüht. Lege den Teller 10 Minuten lang zum Trocknen.

Zum Schluss inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius in aufrechter Position, um zu verhindern, dass sich Kondenswasser auf der Oberfläche des Agars ansammelt. Legen Sie zunächst die beiden SG-Agarplatten für 15 Minuten zum Trocknen in eine Laminar-Flow-Haube. Geben Sie anschließend jeweils 100 Mikroliter des grün und rot fluoreszierenden Protein-produzierenden Biofilmstamms B.subtilis 168 in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Wirbeln Sie die Röhre drei Sekunden lang durch. Bereiten Sie Röhrchen mit 100 Mikrolitern LB-Medium vor und erstellen Sie unter Verwendung der Mischkultur eine 10-fache Verdünnungsreihe von Impfmitteln. Mit einer Mikropipette werden zwei Mikroliter der unverdünnten Mischkultur auf die zweifache SG-Agarplatte aufgetragen

Wiederholen Sie dies mit Impfungen für die Verdünnungen 10 zu eins, 10 zu zwei, 10 zu drei und 10 zu den vier Verdünnungen, wobei die Flecken in gleichen Abständen angeordnet werden, damit sechs bis neun Völker auf einer einzigen Schale angebaut werden können. Inkubieren Sie die Platten ein bis drei Tage lang aufrecht bei 30 Grad Celsius. Platzieren Sie zunächst Platten auf der Bildgebungsplattform eines Fluoreszenz-Detektionsmikroskops.

Für Gleit- und Schwarmexperimente stellen Sie den Ursprung der Inokulation, die Mitte der Petrischale, auf die Ecke des sichtbaren Feldes ein, um die Messung der radialen Kolonieausdehnung zu ermöglichen. Stellen Sie die Vergrößerung auf die höchste Auflösung ein, die eine Abbildung des größtmöglichen Bereichs der 90-Millimeter-Platte ermöglicht. Passen Sie die Belichtungszeit entsprechend der Stärke des Fluoreszenzsignals an.

Positionieren Sie für die Biofilmanalyse eine Kolonie von Interesse in der Mitte des Sichtfelds. Stellen Sie die Vergrößerung auf die höchste Auflösung ein, die es ermöglicht, die gesamte Kolonie zu betrachten. Die Kolonien sind nun bereit für die Messung und Analyse.

Analysieren Sie abschließend die Daten, wie im Textprotokoll beschrieben. Diese Abbildung zeigt das Wachstum einer typischen co-inokulierten Bacillus subtilis-Kolonie mit zwei Stämmen. Das Schwärmen, bei dem es sich um eine von Flagellanten abhängige kollektive Oberflächenbewegung handelt, führt zu einer stark gemischten Population.

In diesem Zeitraffervideo wurde das erste Impfmittel in der Mitte der Platte platziert. Das Schwärmen der dünnen Schichten ist deutlich zu beobachten, und während sich die Kolonie entwickelt, erscheinen die beiden rot und grün fluoreszierenden Stämme gemischt und überlappen sich. Umgekehrt zeigen Bilder des Gleitverhaltens definierte Wachstumssektoren, die den unterschiedlich markierten fluoreszierenden Stämmen entsprechen.

Dieses Video zeigt das Wachstum einer gleitenden co-inokulierten Kolonie, in der die Stämme keine funktionierenden Flagellen haben. Diese Kolonien sind immer noch in der Lage, sich mit einer Kombination aus sekretiertem Exo-Polysaccharid, Hydrophobin und Surfactin auszubreiten. Die daraus resultierenden Kolonien zeigen im Vergleich zum schwärmenden Stamm eine ausgeprägte räumliche Wachstumspalette.

Die Zelldichten der Biofilm-produzierenden Kolonien beeinflussten stark die räumliche Anordnung der resultierenden Kolonien. Kolonien, die mit einer hohen Zelldichte der gemischten Populationen begonnen wurden, zeigten eine geringe oder keine räumliche Streuung. Im Gegensatz dazu konnten bei geringer Zelldichte zu Beginn klare, grüne und rot fluoreszierende Sektoren nachgewiesen werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die relativen Häufigkeiten von fluoreszenzmarkierten Stämmen in mikrobiellen Kolonien bestimmen, die räumliche Segregation untersuchen und den Einfluss der Gründerzelldichte untersuchen können.