Überwachung räumliche Trennung in Oberflächen Colonizing mikrobiellen Populationen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die räumliche Verteilung mikrobieller Stämme während des Schwärmens, Gleitens oder der Biofilmbildung mittels Fluoreszenzmikroskopie zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der sozialen Mikrobiologie zu beantworten, beispielsweise wie räumliche Segregation mikrobielle Interaktionen beeinflusst. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Fitness und räumliche Verteilung mikrobieller Stämme einfach mithilfe mikroskopischer Techniken und der Bildanalyse von Teilsegmenten bewertet werden können.

Theresa Holscher, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Am Tag vor dem Experimentieren geben Sie drei Milliliter LB-Medium in ein Kulturgefäß und impfen es aus einer Gefriersock von B.subtilis an. Wiederholen Sie diese Animpfung mit einem separaten Gefäß für jeden interessierenden Stamm.

Die Röhrchen über Nacht in einen horizontal schüttelnden Inkubator bei 37 Grad Celsius stellen. Um Platten für Schwarm- und Gleitexperimente vorzubereiten, 20 Milliliter temperiertes LB-Medium in eine 90 Millimeter große Petrischale aus Polystyrol geben. Die Schale sofort schließen und mindestens eine Stunde lang seitlich in der sterilen Werkbank abkühlen lassen.

Bereiten Sie anschließend die Platten für die Biofilmbildungsexperimente vor, indem Sie zweimal je 25 Milliliter Agar in zwei Mal SG-Medium in eine 90 Millimeter große Petrischale geben. Schließen Sie die Platten unverzüglich und lassen Sie sie in Stapeln von vier oder weniger mindestens eine Stunde lang abkühlen. Beginnen Sie, indem Sie die LB-Agar-Schwarm- und Gleitplatten in eine laminare Luftströmungskabine stellen und die Deckel entfernen.

Lassen Sie die Platten 20 Minuten lang trocknen. Die Luftfeuchtigkeit auf den Platten ist bei diesen Experimenten entscheidend. Während überschüssige Feuchtigkeit es Bakterien ermöglicht, zu schwimmen, verhindert eine längere Trocknung Schwärmen und Gleiten.

Ebenso hängt die Struktur von Kolonie-Biofilmen von der Trockenheit des Mediums ab. Bestimmen Sie mithilfe eines Spektrophotometers die optischen Dichten der Übernachtkulturen bei 600 Nanometern. Geben Sie in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen dichte-normalisierte Mengen der Stämme, die grünes und rotes fluoreszierendes Protein produzieren, zu einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern zusammen.

Vortexen Sie das Gefäß drei Sekunden lang. Geben Sie mithilfe einer Mikropipette zwei Mikroliter der gemischten Kultur in die Mitte einer vorgetrockneten 90-Millimeter-LB-Agarplatte im laminaren Luftstromwerk. Lassen Sie die Platte 10 Minuten lang trocknen.

Schließlich die Platten in aufrechter Position bei 37 Grad Celsius inkubieren, um Kondensation auf der Oberfläche des Agars zu verhindern. Zuerst die zweifachen SG-Agar-Platten zur Trocknung 15 Minuten lang in eine laminare Luftströmungshaube stellen. Danach jeweils 100 µL der grünen und roten fluoreszierenden Proteine produzierenden Biofilmstämme, B.subtilis 168 Starterkulturen, in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben.

Versetzen Sie das Gefäß drei Sekunden lang im Vortex. Bereiten Sie Gefäße mit 100 Mikroliter LB-Medium vor und erzeugen Sie mithilfe der gemischten Kultur eine zehnfache Verdünnungsreihe der Inokulate. Geben Sie mit einer Mikropipette zwei Mikroliter der unverdünnten gemischten Kultur auf die zweifach konzentrierte SG-Agarplatte.

Wiederholen Sie dies mit Inokulaten für die Verdünnungen 10¹, 10², 10³ und 10⁴, wobei die Probenpunkte in gleichen Abständen angeordnet werden, um sechs bis neun Kolonien auf einer einzigen Petrischale kultivieren zu können. Inkubieren Sie die Platten aufrecht bei 30 Grad Celsius für ein bis drei Tage. Beginnen Sie, indem Sie die Platten auf die Bildgebungsplattform eines fluoreszenzdetektierenden Mikroskops stellen.

Bei Experimenten zu Gleit- und Schwarmbewegungen setzen Sie den Inokulationsursprung, die Mitte der Petrischale, in die Ecke des sichtbaren Feldes, um die radiale Kolonieausbreitung messen zu können. Stellen Sie die Vergrößerung auf die höchste Auflösung ein, die es ermöglicht, den größtmöglichen Bereich der 90-Millimeter-Platte abzubilden. Passen Sie die Belichtungszeit entsprechend der Stärke des Fluoreszenzsignals an.

Für die Biofilmanalyse wird eine Kolonie der Interesse im Zentrum des Sichtfelds positioniert. Die Vergrößerung wird auf die höchste Auflösung eingestellt, bei der die gesamte Kolonie sichtbar bleibt. Die Kolonien sind nun bereit zur Messung und Analyse.

Analysieren Sie abschließend die Daten wie im Textprotokoll beschrieben. Diese Abbildung zeigt das Wachstum einer typischen zweistrafigen, gemeinsam inokulierten Bacillus-subtilis-Kolonie. Schwärmen, eine flagellenabhängige kollektive Oberflächenbewegung, führt zu einer stark vermischten Population.

In diesem Zeitraffervideo wurde der anfängliche Inokulum in der Mitte der ausgestrichenen Platte platziert. Ein dünnschichtiges Schwärmen ist deutlich zu erkennen, und während sich der Kolonie entwickelt, erscheinen die beiden rot und grün fluoreszierenden Stämme vermischt und überlappend. Im Gegensatz dazu zeigen Aufnahmen des Gleitverhaltens klar definierte Wachstumssektoren, die den unterschiedlich markierten fluoreszierenden Stämmen entsprechen.

Dieses Video zeigt das Wachstum einer gleitenden, ko-inokulierten Kolonie, bei der die Stämme nicht funktionierende Flagellen aufweisen. Diese Kolonien können sich dennoch mittels einer Kombination aus sezerniertem Exopolysaccharid, Hydrophobin und Surfactin ausbreiten. Die resultierenden Kolonien weisen eine deutlich andere räumliche Wachstumsanordnung im Vergleich zum schwärmenden Stamm auf.

Biofilmbildende Kolonien, die mit unterschiedlichen Startzellkonzentrationen begannen, beeinflussten die räumliche Verteilung der resultierenden Kolonien stark. Kolonien, die mit einer hohen Zellkonzentration der gemischten Populationen initiiert wurden, wiesen geringe oder keine räumliche Sortierung auf. Im Gegensatz dazu konnten bei niedriger Initiatialkonzentration klare grüne und rote fluoreszierende Sektoren beobachtet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die relativen Häufigkeiten fluoreszenzmarkierter Stämme in mikrobiellen Kolonien bestimmt, räumliche Segregation untersucht und den Einfluss der Dichte von Gründerzellen analysiert.