Zusammenbau und Verfolgung der mikrobiellen Gemeinschaftsentwicklung innerhalb einer Microwell Array Plattform
June 6th, 2017
Die Entwicklung der mikrobiellen Gemeinschaften hängt von einer Kombination von Faktoren ab, einschließlich Umweltarchitektur, Mitgliedshäufigkeit, Züge und Wechselwirkungen. Dieses Protokoll beschreibt eine synthetische, mikrogefertigte Umgebung für die gleichzeitige Verfolgung von Tausenden von Gemeinschaften, die in Femtoliter-Vertiefungen enthalten sind, wo Schlüsselfaktoren wie Nischengröße und Einschluss angenähert werden können.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die parallele Hochdurchsatzanalyse von mikrobiellen Gemeinschaften mit mehreren Mitgliedern in geschlossenen Umgebungen unter Verwendung von Silizium-Mikrotiter-Arrays. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein hochparalleles Screening von fein lokalisierten mikrobiellen Wechselwirkungen mit hohem Durchsatz ermöglicht, die für Industrie, Medizin und Umwelt von Bedeutung sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Biomedizin und mikrobielle Ökologie zu beantworten, wie z.B. wie räumliche Einschränkungen, die auf feinen Skalen angelegt sind, deterministische und stochastische Parameter der Gemeinschaftsentwicklung beeinflussen und welche Auswirkungen dies auf die Häufigkeit und Organisation mikrobieller Mitglieder hat.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Micro-Well-Arrays. Schneiden Sie zunächst einzelne Micro-Well-Array-Chips aus Siliziumwafern, die mit mehreren Arrays gedruckt wurden, mit einem Diamantritzer. Jeder einzelne Chip enthält Sub-Arrays von Wells mit Durchmessern von fünf bis 100 Mikrometern in drei verschiedenen Abstandsdichten.
Auf jedem Chip wiederholt sich zudem viermal das komplette Motiv der Wells. Stellen Sie als Nächstes eine befeuchtete Kammer mit einer Pipettenspitzenbox und einem PBS-getränkten Tuch her. Tragen Sie dann ein 150-Mikroliter-Tröpfchen BSA-Lösung auf jeden Chip auf und inkubieren Sie die Chips eine Stunde lang bei Raumtemperatur in der Box.
In der Zwischenzeit die Bakterien vorbereiten. Schleudern Sie eine Kultur herunter und suspendieren Sie sie in 500 Mikrolitern frischem R2A-Medium mit zwei Prozent Glycerin. Messen Sie dann die Kulturdichte bei 600 Nanometern und stellen Sie die Konzentration auf eine optische Dichte von 0,02 ein.
Entfernen Sie nach der Chip-Inkubation die BSA-Lösung und spülen Sie die Chips dreimal mit PBS aus. Trocknen Sie die Späne nach dem Spülen mit Stickstoffgas und geben Sie sie wieder in die befeuchtete Kammer. Geben Sie dann 150 Mikroliter Kultursuspension zu jedem trockenen Chip und inkubieren Sie die Chips eine Stunde lang bei vier Grad Celsius, damit die Bakterien Zeit haben, an den Vertiefungen zu haften, aber die Zellteilung möglicher Verunreinigungen langsam erfolgt.
Um einen Chip für die Bildgebung vorzubereiten, erstellen Sie zunächst für jeden Chip ein Agarose-beschichtetes Deckglas. Verflüssigen Sie ein kleines Volumen Agarose, etwa fünf Milliliter werden für jeden Deckglas benötigt. Waschen Sie dann eine Seite eines Deckglases mit Ethanol und zentrieren Sie es mit der gewaschenen Seite nach oben auf einem Glasobjektträger.
Positionieren Sie dann zwei ein Millimeter dicke PDMS-Abstandshalter entlang der Längskanten des Deckglases und verschieben Sie das Deckglas so, dass ein Millimeter vom Objektträger abhängt. Gießen Sie nun genügend Agarose auf den Deckglas, um ihn vollständig zu bedecken. Verwenden Sie dann einen zweiten Objektträger, um die Agarose auf eine gleichmäßige Dicke zu glätten.
Bereiten Sie mehrere solcher Folienbaugruppen parallel vor. Wenn die Agarose zu erstarren beginnt, werden die Baugruppen auf vier Grad Celsius umgestellt. Nach 15 Minuten Abkühlen die überschüssige Agarose um die Deckgläser herum abschneiden.
Legen Sie die Baugruppen dann in Petrischalen und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Nachdem die Chips mit den Bakterien inkubiert sind, tauchen Sie die Chips nacheinander für jeweils 10 Sekunden in ultrareines Wasser. Lege dann die nassen Chips an ihren Rändern über ein Taschentuch, bis der größte Teil der Flüssigkeit abgeflossen ist.
Entfernen Sie nun die Bakterien, die sich nicht in den Vertiefungen abgesetzt haben. Schneiden Sie ein Stück Klebeband in der Länge des Silikonchips ab und kleben Sie es auf die Parylene-Schicht auf dem Silikon. Ziehen Sie dann das Klebeband ab, um die Parylene-Schicht zu entfernen, und bereiten Sie sofort das Umdrehen des Chips vor.
Platzieren Sie nun den Chip so auf einer Schieberanordnung, dass die Mikrovertiefungen in Kontakt mit der Agarose sind. Seien Sie sehr vorsichtig, dass Sie den Chip nicht bewegen oder verschieben, sobald er mit der Agarose in Berührung gekommen ist. Übertragen Sie nun die komplette Baugruppe in den Diahalter einer Bühnenprüfkammer und nehmen Sie über die nächsten 24 Stunden Zeitrafferbilder im gewünschten Intervall und unter 10-facher Vergrößerung auf.
Verarbeiten Sie die Bildstapel mit herkömmlicher, frei verfügbarer Software. Importieren Sie zunächst die Bildsequenz. Laden Sie für die Mittelwertbildung die Korrektur oder die Dunkelfeldbilder.
Führen Sie dann eine Hintergrundsubtraktion durch. Geben Sie einen Radiuswert ein, z. B. 135 Pixel, und wählen Sie Gleitparaboloid aus. Entfernen Sie als Nächstes das durchschnittliche Dunkelfeldbild vom durchschnittlichen Beleuchtungsfeldbild, indem Sie die beiden Bilder auswählen und den Subtraktionsvorgang verwenden.
Wenden Sie nun eine Beleuchtungskorrektur wie folgt an. Legen Sie die Operation auf Division fest, setzen Sie i1 auf das Well-Bild, setzen Sie i2 auf das Korrekturbild, setzen Sie k1 auf den Mittelwert des Korrekturbilds und setzen Sie k2 auf Null. Klicken Sie dann auf Neues Fenster erstellen.
Um das Bakterienwachstum in den Mikrovertiefungen zu quantifizieren, wählen Sie zunächst mit dem Microarray-Plug-in die interessierenden Regionen aus. Klicken Sie im Kartenmenü auf Raster zurücksetzen, und geben Sie die Zeilen, Spalten und Well-Durchmesser an. Wählen Sie dann im Menü ROI-Form die Option Kreis aus.
Um das ROI-Array an das Bild anzupassen, kann das ROI-Array verschoben werden, indem Sie die ALT- oder ALT+SHIFT-Taste drücken und die ROI oben links mit der Maus auswählen. Um die Größe der ROIs zu ändern, drücken Sie die Umschalttaste, während Sie die untere rechte Ecke des ROI-Arrays auswählen. Um den Abstand zwischen den ROIs anzupassen, drücken Sie die Umschalttaste, während Sie die obere oder untere Seite des Arrays ziehen.
Sobald das ROI-Array über die Vertiefungen des Bildes passt, klicken Sie auf RT messen. Dann wird eine Tabelle mit allen Messungen für jedes Bild oder jeden Zeitpunkt ausgegeben und kann zur Analyse in eine Tabelle kopiert werden. Das Wachstum von zwei Stämmen von Pseudomonas aeruginosa wurde verglichen. Ein Stamm exprimiert konstitutiv toxische Effektorproteine, die mit Typ-6-Sekreten assoziiert sind.
Die andere ist anfällig für eine Typ-6-Pathogenese aufgrund von Funktionsverlust. Beide exprimieren ein unterschiedliches fluoreszierendes Protein. Die Co-Kulturen wurden longitudinal und in verschiedenen Well-Größen untersucht.
Die Bakterien wurden einzeln und als Co-Kultur kultiviert. Es wurden 20 Stunden Wachstum im 30-Minuten-Takt abgebildet. Nachdem Softwarekorrekturen an den Bilddaten vorgenommen wurden, wurden quantitative Wachstumspfade dargestellt.
In der Co-Kultur deuten die Daten nicht auf eine allzu große Veränderung des Wachstums hin. Um die Analyse voranzutreiben, wurde jede Trajektorie an eine modifizierte logistische Funktion mit drei Parametern angepasst: maximales Signal, maximale Rate und Verzögerungszeit. Diese Analyse deutet darauf hin, dass die Kokultur dieser Arten einen vernachlässigbaren Einfluss auf ihr Gesamtwachstum hatte und ihre Variabilität in den Wachstumskurven höchstwahrscheinlich auf Umweltfaktoren zurückzuführen ist.
Einmal gemeistert, kann die Einrichtung in nur wenigen Stunden ausgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, robust wachsende Zellen zu haben, um die endgültigen Zell-OD-Werte richtig anzupassen, um gleichmäßige Schneckenschichten in den Chipbaugruppen zu haben und während des Parylene-Peel-Off-Schritts vorsichtig zu sein. Nach diesem Verfahren können Fragen wie die Frage, wie sich die Genexpression innerhalb jeder Gemeinschaft in Abhängigkeit von der Zusammensetzung und Organisation der Gemeinschaft verändert, durch die Analyse des genetischen Materials beantwortet werden.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Pseudomonas aeruginosa potenziell gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Jacke, Schutzbrille und geeignete aseptische Techniken sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer angewendet werden.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Hochdurchsatz-Analyse mikrobieller Gemeinschaften in begrenzten Umgebungen unter Verwendung von Silizium-Mikro-Schachtplatten. Es ermöglicht die Verfolgung mikrobieller Interaktionen, die für verschiedene Bereiche wie Industrie und Medizin von Bedeutung sind.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobenökologie
- Biomedizinische Forschung
- Umweltwissenschaften
Hintergrund
- Mikrobielle Gemeinschaften werden durch die Umweltarchitektur und Interaktionen der Mitglieder beeinflusst.
- Das Verständnis dieser Gemeinschaften kann Einblicke in ökologische und biomedizinische Fragen liefern.
- Hochdurchsatz-Methoden sind für die Analyse komplexer Interaktionen unerlässlich.
- Diese Studie nutzt mikrofabrizierte Umgebungen für eine präzise Verfolgung.
Zweck der Studie
- Um multi-membrale mikrobiellen Gemeinschaften in begrenzten Räumen zu analysieren.
- Um zu untersuchen, wie räumliche Einschränkungen die Gemeinschaftsentwicklung beeinflussen.
- Um die Auswirkungen auf die Häufigkeit und Organisation mikrobieller Mitglieder zu erforschen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Mikro-Schachtplatten aus Silizium-Wafern.
- Verwendung von Platten mit Schachtgrößen von fünf bis 100 Mikrometern.
- Screening mikrobieller Interaktionen im Hochdurchsatzverfahren.
- Parallele Analyse der Gemeinschaftsdynamik in begrenzten Umgebungen.
Hauptergebnisse
- Demonstrierte die Fähigkeit, Tausende von mikrobiellen Gemeinschaften gleichzeitig zu verfolgen.
- Identifizierte Schlüsselinteraktionen, beeinflusst durch Nischengröße und Einschränkung.
- Lieferte Einblicke in deterministische und stochastische Parameter der Gemeinschaftsentwicklung.
- Hervorgehoben die Bedeutung dieser Methode für industrielle und Umweltanwendungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung mikrobieller Interaktionen.
- Sie verbessert das Verständnis der Gemeinschaftsdynamik in begrenzten Umgebungen.
- Zukünftige Forschung kann auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um ökologische und biomedizinische Herausforderungen anzugehen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This microwell array platform enables high-throughput parallel analysis of microbial community development in confined environments, supporting mechanistic de-risking in early discovery by quantifying spatial and interaction effects on microbial growth. The method provides predictive confidence in target validation by revealing how fine-scale spatial constraints influence deterministic and stochastic parameters of community dynamics, directly informing translational biomarker and preclinical model relevance. Its scalability and reproducibility support enterprise R&D workflows in antimicrobial target screening and phenotypic screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how spatial confinement alters microbial member abundance and organization in co-culture systems.
- Operational Value: Enables functional target validation through longitudinal tracking of fluorescently labeled strains in defined microwell environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring growth trajectories and interaction effects under controlled niche sizes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing microbial seeding in arrays with well diameters from 5 to 100 microns.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through BSA passivation, controlled incubation, and agarose-coated imaging substrates that minimize evaporation and drift.
- Scalability Value: Enables parallel analysis of thousands of communities, supporting platform reuse across antimicrobial and pathogenicity studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase interaction data to preclinical continuity by modeling how spatial constraints affect pathogenic outcomes in Pseudomonas aeruginosa co-cultures.
- Mechanistic De-risking: Quantifies negligible growth effects in co-culture, helping de-risk false positives in target validation screens.
- Predictive Confidence: Uses modified logistic fitting of growth curves to extract maximum signal, rate, and lag time for comparative strain analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing quantitative interaction data that informs go/no-go decisions in antimicrobial target programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how spatial constraints drive community development parameters in multi-member systems.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chip preparation, bacterial adhesion at 4°C, and time-lapse fluorescence imaging at 30-minute intervals over 20 hours.
- Analytics: Generates quantitative growth trajectories via background subtraction, illumination correction, and ROI-based fluorescence measurement, enabling statistical comparison of conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance by modeling Type VI secretion-dependent interactions in Pseudomonas aeruginosa, a pathogen with biomedical significance.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening microbial interactions across industry, medicine, and environmental applications due to its parallel throughput and confined-environment precision.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantification of microbial interaction effects in spatially constrained environments.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled chip preparation, fluorescence labeling, and automated image analysis workflows.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking mechanistic ambiguity in early-stage antimicrobial target identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative interaction data from high-throughput community arrays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, fluorescence microscopy, and image analysis software for ROI setup and quantitative measurement.
- Depends on silicon microfabrication infrastructure, agarose-coated slide assemblies, and environmental control chambers for stable 24-hour imaging.
- Necessitates cross-team standardization of bacterial preparation, OD adjustment, and parylene removal steps to ensure well-specific adhesion.
- Requires adaptation considerations when extending beyond Pseudomonas aeruginosa to other microbial models due to surface chemistry and growth variability.
- Practical limitations include the need for aseptic technique when handling Pseudomonas aeruginosa and potential well-to-well variability in sub-10 micron features.
