Zusammenbau und Verfolgung der mikrobiellen Gemeinschaftsentwicklung innerhalb einer Microwell Array Plattform
6. Juni 2017
Die Entwicklung der mikrobiellen Gemeinschaften hängt von einer Kombination von Faktoren ab, einschließlich Umweltarchitektur, Mitgliedshäufigkeit, Züge und Wechselwirkungen. Dieses Protokoll beschreibt eine synthetische, mikrogefertigte Umgebung für die gleichzeitige Verfolgung von Tausenden von Gemeinschaften, die in Femtoliter-Vertiefungen enthalten sind, wo Schlüsselfaktoren wie Nischengröße und Einschluss angenähert werden können.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die hochdurchsatzfähige parallele Analyse mehrteiliger mikrobieller Gemeinschaften in begrenzten Umgebungen unter Verwendung von Silizium-Mikrogefäße-Arrays. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine hochdurchsatzfähige, stark parallele Untersuchung fein lokalisierten mikrobiellen Wechselwirkungen ermöglicht, die für Industrie, Medizin und Umwelt von Bedeutung sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen biomedizinische Forschung und mikrobielle Ökologie zu beantworten, beispielsweise wie räumliche Einschränkungen, die auf feinen Skalen inhärent sind, deterministische und stochastische Parameter der Gemeinschaftsentwicklung beeinflussen, und welche wesentlichen Auswirkungen dies auf die Häufigkeit und Organisation mikrobieller Mitglieder hat.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Mikro-Wellen-Anordnungen. Schneiden Sie zunächst einzelne Mikro-Wellen-Chips aus Siliziumwafern, auf denen mehrere Anordnungen mit einem Diamantschreiber aufgebracht sind. Jeder einzelne Chip enthält Unteranordnungen von Vertiefungen mit Durchmessern zwischen fünf und 100 Mikrometern bei drei verschiedenen Abstandsdichten.
Auf jedem Chip wird das vollständige Motiv der Vertiefungen ebenfalls viermal wiederholt. Als Nächstes stellen Sie eine befeuchtete Kammer aus einer Pipettenspitzenbox und einem mit PBS getränkten Tuch her. Geben Sie dann je einen Tropfen von 150 Mikrolitern BSA-Lösung auf jeden Chip und inkubieren Sie die Chips eine Stunde lang bei Raumtemperatur in der Box.
Bereiten Sie derweil die Bakterien vor. Zentrifugieren Sie eine Kultur und resuspendieren Sie sie in 500 Mikrolitern frischem R2A-Medium mit zwei Prozent Glycerin. Messen Sie anschließend die Zelldichte der Kultur bei 600 Nanometern und stellen Sie die Konzentration auf eine optische Dichte von 0,02 ein.
Nach der Inkubation des Chips entfernen Sie die BSA-Lösung und spülen die Chips dreimal mit PBS. Nach dem Spülen trocknen Sie die Chips mit Stickstoffgas und bringen sie zurück in die befeuchtete Kammer. Geben Sie anschließend 150 Mikroliter Kultur-Suspension auf jeden trockenen Chip und inkubieren Sie die Chips eine Stunde lang bei vier Grad Celsius, damit die Bakterien Zeit haben, an die Vertiefungen zu binden, während die Zellteilung eventueller Kontaminationen langsam verläuft.
Um einen Chip für die Bildgebung vorzubereiten, stellen Sie zunächst einen mit Agarose beschichteten Deckelträger für jeden Chip her. Liquefizieren Sie ein kleines Volumen Agarose; etwa fünf Milliliter werden für jeden Deckelträger benötigt. Spülen Sie danach eine Seite eines Deckelträgers mit Ethanol und platzieren Sie ihn mittig mit der gespülten Seite nach oben auf einen Objektträger.
Danach zwei einen Millimeter dicke PDMS-Abstandshalter entlang der langen Kanten des Deckgläschens positionieren und das Deckgläschen so verschieben, dass ein Millimeter über den Objektträger hinausragt. Anschließend genügend Agarose auf das Deckgläschen geben, um es vollständig zu bedecken. Danach ein zweites Objektträgerplättchen verwenden, um die Agarose auf eine einheitliche Dicke zu glätten.
Bereiten Sie mehrere solcher Objektträgeraufbauten parallel vor. Sobald das Agarose zu erstarren beginnt, bringen Sie die Aufbauten auf vier Grad Celsius. Nach 15 Minuten Abkühlzeit schneiden Sie das überschüssige Agarose rund um die Deckgläser ab.
Danach die Baugruppen in Petrischalen geben und bei vier Grad Celsius lagern. Nach der Inkubation der Chips mit den Bakterien tauchen Sie die Chips einzeln für jeweils 10 Sekunden in ultrareines Wasser. Anschließend stellen Sie die nassen Chips einzeln auf die Kante über ein Tuch, bis der größte Teil der Flüssigkeit abgelaufen ist.
Entfernen Sie nun die Bakterien, die nicht in die Vertiefungen eingedrungen sind. Schneiden Sie ein Stück Klebeband in der Länge des Siliziumchips zu und befestigen Sie es auf der Parylenbeschichtung auf dem Silizium. Ziehen Sie dann das Klebeband ab, um die Parylenbeschichtung zu entfernen, und bereiten Sie unmittelbar danach das Umkehren des Chips vor.
Platzieren Sie nun den Chip auf einer Objektträgeranordnung, sodass die Mikrowellplatten mit dem Agarose in Kontakt kommen. Achten Sie sorgfältig darauf, den Chip nach Kontakt mit der Agarose nicht zu bewegen oder zu verschieben. Überführen Sie anschließend die komplette Anordnung in den Objektträgerhalter einer auf dem Mikroskoptisch montierten Umweltkontrollkammer und nehmen Sie Zeitrafferaufnahmen über die nächsten 24 Stunden in gewünschten Zeitabständen und bei 10facher Vergrößerung auf.
Verarbeiten Sie die Bildstapel mit herkömmlicher, frei verfügbarer Software. Importieren Sie zuerst die Bildsequenz. Laden Sie für die Mittelung die Korrektur- oder Dunkelfeldbilder.
Führen Sie anschließend eine Hintergrundsubtraktion durch. Geben Sie einen Radiuswert wie 135 Pixel an und wählen Sie „schiebender Paraboloid“. Entfernen Sie als Nächstes das durchschnittliche Dunkelfeldbild vom durchschnittlichen Beleuchtungsfeldbild, indem Sie die beiden Bilder auswählen und die Subtraktionsoperation verwenden.
Wenden Sie nun eine Beleuchtungskorrektur wie folgt an. Stellen Sie die Operation auf Division ein, setzen Sie i1 auf das Bild der Vertiefung, i2 auf das Korrekturbild, k1 auf den Mittelwert des Korrekturbildes und k2 auf null. Klicken Sie dann auf „Neues Fenster erstellen“.
Um das bakterielle Wachstum in den Mikrovertiefungen zu quantifizieren, wählen Sie zuerst die interessierenden Bereiche mit dem Mikroarray-Plug-in aus. Klicken Sie im Kartenmenü auf „Raster zurücksetzen“ und geben Sie die Zeilen, Spalten und Brunnendurchmesser an. Wählen Sie anschließend im Menü für die ROI-Form den Kreis aus.
Um das ROI-Array an das Bild anzupassen, kann das ROI-Array verschoben werden, indem die ALT- oder ALT+UMSCHALT-Taste gedrückt und das linke obere ROI mit der Maus ausgewählt wird. Um die Größe der ROIs anzupassen, halten Sie die UMSCHALT-Taste gedrückt und wählen Sie die untere rechte Ecke des ROI-Arrays aus. Um den Abstand zwischen den ROIs anzupassen, halten Sie die UMSCHALT-Taste gedrückt, während Sie die obere oder untere Seite des Arrays ziehen.
Sobald das ROI-Array über den Vertiefungen des Bildes liegt, klicken Sie auf „RT messen“. Daraufhin wird eine Tabelle mit allen Messwerten für jedes Bild oder jeden Zeitpunkt ausgegeben, die in eine Tabellenkalkulation zur Analyse kopiert werden kann. Das Wachstum von zwei Stämmen von Pseudomonas aeruginosa wurde verglichen. Ein Stamm exprimiert konstitutiv toxische Effektorproteine, die mit Typ-sechs-Sekretionssystemen assoziiert sind.
Die andere ist aufgrund eines Funktionsverlusts anfällig für die Pathogenese vom Typ sechs. Beide exprimieren ein unterschiedliches fluoreszierendes Protein. Koinkulturen wurden longitudinal und in verschiedenen Brunnengrößen untersucht.
Die Bakterien wurden einzeln sowie als Kokultur kultiviert. Das Wachstum über 20 Stunden wurde in 30-Minuten-Intervallen abgebildet. Nach Durchführung von Softwarekorrekturen an den Bilddaten wurden quantitative Wachstumsverläufe dargestellt.
In der Co-Kultur deuten die Daten nicht auf eine starke Änderung des Wachstums hin. Zur Vertiefung der Analyse wurde jede Trajektorie an eine modifizierte logistische Funktion mit drei Parametern angepasst: maximales Signal, maximale Rate und Lag-Zeit. Diese Analyse legt nahe, dass die Co-Kultur dieser Arten einen vernachlässigbaren Einfluss auf ihr Gesamtwachstum hatte und die in den Wachstumskurven beobachtete Variabilität höchstwahrscheinlich auf Umweltfaktoren zurückzuführen ist.
Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann der Aufbau bei sachgemäßer Durchführung innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, dass die Zellen kräftig wachsen, um die endgültigen Zell-OD-Werte korrekt einzustellen und gleichmäßige Augerschichten in den Chip-Assemblierungen zu erhalten, sowie beim Abziehen des Parylen sorgfältig vorzugehen. Mit Hilfe dieses Verfahrens können anschließend Fragen wie etwa, wie sich die Genexpression innerhalb jeder Gemeinschaft in Abhängigkeit von der Zusammensetzung und Organisation der Gemeinschaft verändert, durch die Analyse des genetischen Materials beantwortet werden.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Pseudomonas aeruginosa potenziell gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Kittel, Schutzbrille und ordnungsgemäße aseptische Techniken stets angewendet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Hochdurchsatzanalyse mikrobieller Gemeinschaften in begrenzten Umgebungen unter Verwendung von Silizium-Mikro-Well-Anordnungen. Es ermöglicht die Verfolgung mikrobieller Wechselwirkungen, die für verschiedene Bereiche wie Industrie und Medizin von Bedeutung sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobielle Ökologie
- Biomedizinische Forschung
- Umweltwissenschaften
Hintergrund
- Mikrobielle Gemeinschaften werden durch die Umweltarchitektur und Wechselwirkungen zwischen ihren Mitgliedern beeinflusst.
- Das Verständnis dieser Gemeinschaften kann Einblicke in ökologische und biomedizinische Fragestellungen liefern.
- Hochdurchsatzmethoden sind entscheidend für die Analyse komplexer Wechselwirkungen.
- Diese Studie nutzt mikrofabrizierte Umgebungen für eine präzise Verfolgung.
Zweck der Studie
- Um mehrteilige mikrobielle Gemeinschaften in begrenzten Räumen zu analysieren.
- Um zu untersuchen, wie räumliche Einschränkungen die Entwicklung der Gemeinschaft beeinflussen.
- Um die Auswirkungen auf die Häufigkeit und Organisation der mikrobiellen Mitglieder zu erforschen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Mikro-Well-Anordnungen aus Siliziumwafern.
- Verwendung von Anordnungen mit Vertiefungen im Bereich von fünf bis 100 Mikrometern.
- Screening mikrobieller Wechselwirkungen in Hochdurchsatzweise.
- Parallele Analyse von Gemeinschaftsdynamiken in begrenzten Umgebungen.
Hauptergebnisse
- Nachweis der Fähigkeit, simultan Tausende mikrobieller Gemeinschaften zu verfolgen.
- Identifizierung zentraler Wechselwirkungen, die von Nischengröße und Einschränkung beeinflusst werden.
- Erlangung von Erkenntnissen zu deterministischen und stochastischen Parametern der Gemeinschaftsentwicklung.
- Herausstellung der Bedeutung dieser Methode für industrielle und umweltrelevante Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen.
- Sie vertieft das Verständnis der Gemeinschaftsdynamik in begrenzten Umgebungen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um ökologische und biomedizinische Herausforderungen anzugehen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Diese Mikrotröpfchen-Array-Plattform ermöglicht die hochdurchsatzfähige parallele Analyse der Entwicklung mikrobieller Gemeinschaften in begrenzten Umgebungen und unterstützt die mechanistische Risikominimierung in der frühen Entdeckungsphase, indem räumliche Effekte und Wechselwirkungen auf das mikrobielle Wachstum quantifiziert werden. Die Methode liefert eine vorhersagbare Sicherheit bei der Zielvalidierung, indem aufgezeigt wird, wie feinabgestufte räumliche Beschränkungen deterministische und stochastische Parameter der Gemeinschaftsdynamik beeinflussen, und trägt damit direkt zur Relevanz translationsmedizinischer Biomarker und präklinischer Modelle bei. Ihre Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit unterstützt unternehmensweite Forschungs- und Entwicklungsabläufe in Anwendungen zum Screening antimikrobieller Zielstrukturen sowie zum phänotypischen Screening.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem quantifiziert wird, wie räumliche Einschränkung die Häufigkeit und Organisation von Mikroben in Co-Kultursystemen verändert.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch langfristige Verfolgung fluoreszenzmarkierter Stämme in definierten Mikrovertiefungen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Wirkstoffkandidaten durch die Messung von Wachstumsverläufen und Interaktionseffekten unter kontrollierten Nischenbedingungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Analyse vor, indem die mikrobielle Besiedlung in Arrays mit Welledurchmessern von 5 bis 100 Mikrometern standardisiert wird.
- Operativer Wert: Gewährleistet die Reproduzierbarkeit von Assays durch BSA-Passivierung, kontrollierte Inkubation und mit Agarose beschichtete Abbildungssubstrate, die Verdunstung und Drift minimieren.
- Skalierbarkeitswert: Ermöglicht die parallele Analyse von Tausenden von Gemeinschaften und unterstützt die Wiederverwendung der Plattform in Studien zu antimikrobiellen Wirkstoffen und Pathogenität.
Translationale und präklinische Forschung
- Übertragbarer Wert: Verbindet Interaktionsdaten aus der Entdeckungsphase mit der präklinischen Kontinuität, indem modelliert wird, wie räumliche Beschränkungen pathogene Ergebnisse in Pseudomonas aeruginosa-Ko-Kulturen beeinflussen.
- Mechanistische Ent风险ung: Quantifiziert vernachlässigbare Wachstumseffekte in der Ko-Kultur und trägt so dazu bei, das Risiko von Falsch-positiven Ergebnissen bei der Target-Validierung zu verringern.
- Vorhersagegenauigkeit: Nutzt eine modifizierte logistische Anpassung von Wachstumskurven, um das maximale Signal, die Wachstumsrate und die Lag-Phase für den vergleichenden Stammvergleich zu extrahieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung bis zur Identifizierung von Leitstrukturen ein und liefert quantitative Interaktionsdaten, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in antimikrobiellen Target-Programmen unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem aufgezeigt wird, wie räumliche Beschränkungen die Parameter der Gemeinschaftsentwicklung in Systemen mit mehreren Mitgliedern beeinflussen.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays sicher durch standardisierte Chip-Präparation, bakterielle Adhäsion bei 4 °C und zeitraffende Fluoreszenzbildgebung in 30-Minuten-Intervallen über 20 Stunden.
- Analytik: Erzeugt quantitative Wachstumsverläufe mittels Hintergrundsubtraktion, Beleuchtungskorrektur und fluoreszenzbasierter Messung in definierten Bildbereichen (ROI), wodurch ein statistischer Vergleich verschiedener Bedingungen ermöglicht wird.
- Translationale Forschung: Schafft Bezug zur präklinischen Relevanz, indem Wechselwirkungen, die von der Typ-VI-Sekretion abhängen, in Pseudomonas aeruginosa modelliert werden – einem Krankheitserreger mit biomedizinischer Bedeutung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung mikrobieller Interaktionen in industriellen, medizinischen und umweltbezogenen Anwendungen aufgrund ihres parallelen Durchsatzes und der präzisen Kontrolle in begrenzten Umgebungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung durch Quantifizierung mikrobieller Interaktionswirkungen in räumlich begrenzten Umgebungen.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch kontrollierte Chip-Herstellung, Fluoreszenzmarkierung und automatisierte Bildanalyse-Workflows.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung mechanistischer Unklarheiten bei der Identifizierung von antimikrobiellen Angriffspunkten in frühen Entwicklungsstadien.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung basierend auf quantitativen Interaktionsdaten aus Hochdurchsatz-Community-Arrays.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrobiologie, Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse-Software für die Einrichtung von ROIs und quantitative Messungen.
- Hängt von einer Infrastruktur für die Silizium-Mikrofertigung, Agarose-beschichteten Objektträgern und Umweltkontrollkammern ab, um eine stabile 24-Stunden-Bildgebung zu gewährleisten.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei der bakteriellen Aufbereitung, OD-Anpassung und Entfernung von Parylen, um eine wellspezifische Adhäsion sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode über Pseudomonas aeruginosa hinaus auf andere mikrobielle Modelle ausgeweitet wird, aufgrund von Unterschieden in der Oberflächenchemie und im Wachstumsverhalten.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Notwendigkeit aseptischer Techniken beim Umgang mit Pseudomonas aeruginosa sowie mögliche Variabilität zwischen den Wells bei Strukturen unter 10 Mikrometern.
