Vorbereitung und In Vitro Charakterisierung der für Magnetresonanz-Kontrastmittel Dendrimer-basierten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Herstellung und Charakterisierung eines dendrimeren paramagnetischen Chelatbildes zu zeigen, das als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie verwendet werden kann, und seine Leistungsfähigkeit in einem bildgebenden Experiment zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der MRT-Kontrastmittel zu beantworten, wie z.B. die Eigenschaften und die Wirksamkeit von dendrimeren Kontrastmitteln. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die bequeme Herstellung des effizienten MRT-Kontrastmittels mit hohem Proteingehalt, wodurch eine einfache Charakterisierung gewährleistet wird.

Diese Methode kann auf weitere strukturelle Modifikationen und funktionelle Optimierungen von dendrimeren MRT-Kontrastmitteln ausgeweitet werden, was für potenzielle in vivo-Anwendungen von großer Bedeutung ist. Die Implikationen erstrecken sich auf die biomedizinische Forschung und die diagnostische Bildgebung, da die hohe molekulare Rate an dendrimeren Kontrastmitteln zu längeren Geweberetentionszeiten führt und das MRT-Signal erheblich verbessert. Zuerst lösen Sie ein Gramm des makrozyklischen Vorläufers DO3A-Tributylester in fünf Millilitern DMF.

Fügen Sie 0,67 Gramm Kaliumcarbonat hinzu und rühren Sie 45 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie 0,87 g tert-butyl-2-brom-4-4-nitrophenylbutatnoat in Portionen über eine Stunde hinzu und rühren Sie das Reaktionsgemisch 18 Stunden lang weiter. Entfernen Sie dann das ZMS mit einer Vakuumdestillation von Kolben zu Kolben bei 40 bis 60 Grad Celsius.

Reinigen Sie den Rückstand mit einer Kieselgelsäulenchromatographie, um einen runden Feststoff zu erhalten. Lösen Sie ein Gramm des Feststoffs in einem Gemisch aus 10 Millilitern Ethanol und 150 Mikrolitern einer sieben normalen Ammoniaklösung in Methanol. Geben Sie 150 Milligramm Palladium auf Aktivkohle und richten Sie den Flaschenreaktor im Hydrator ein.

Schütteln Sie die Mischung 16 Stunden lang unter einer 2,5 bar Wasserstoffatmosphäre. Gießen Sie eine Suspension von Kieselgur in Ethanol in einen Sinterglastrichter. Filtern Sie das Reaktionsgemisch durch die Kieselgur, um den Palladiumkohlenstoffkatalysator zu entfernen. Entfernen Sie das Lösungsmittel aus dem Filtrat auf einem Rotationsverdampfer.

Lösen Sie den resultierenden Feststoff in 15 Millilitern Dichlormethan und vier Äquivalenten Triethylamin auf. Fügen Sie dazu 1,3 Äquivalente Thiophosgen hinzu und rühren Sie die Mischung 16 Stunden lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch auf einem Rotationsverdampfer und reinigen Sie den Rückstand mit Kieselgel-Säulenchromatographie, um das DOTA-Monomer als hellbraunen Feststoff zu erhalten.

Bereiten Sie 66,7 Milligramm G4 PAMAM Dendrimer aus einer 10%igen Lösung in Methanol her, indem Sie das Lösungsmittel auf einem Rotationsverdampfer bei 40 Grad Celsius verdampfen. Lösen Sie das Dendrimer in vier Millilitern DMF auf. Geben Sie 0,105 Milliliter Triethylamin in die Dendrimerlösung und rühren Sie 45 Minuten lang bei 60 Grad Celsius.

Fügen Sie dann 354 Milligramm des Monomers in Portionen über eine Stunde hinzu. Bei 45 Grad Celsius 48 Stunden lang weiterrühren. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einer Vakuumdestillation von Kolben zu Kolben.

Packen Sie eine Größenausschluss-Chromatographiesäule, indem Sie lipophiles Gelfiltrationsmedium drei Stunden lang bei Raumtemperatur in Methanol schwenken. Sammeln Sie eine Milliliterfraktion mit Methanol als Eluent. Analysieren Sie die Brüche nach TLC.

Entfernen Sie das Lösungsmittel aus den Fraktionen, die den geschützten dendrimeren Chelator auf einem Rotationsverdampfer enthalten. Erfassen Sie ein Protonen-NMR-Spektrum der Verbindung und integrieren Sie die aromatischen und aliphatischen Regionen. Bestimmen Sie anhand dieser Werte die Anzahl der geschützten Makrozyklen vom DOTA-Typ, die an das G4-PAMAM-Dendrimer gekoppelt sind.

Um den Schutz des Produkts zu entschärfen, lösen Sie den Feststoff in fünf Millilitern Ameisensäure auf und rühren Sie die Mischung 36 Stunden lang bei 60 Grad Celsius. Entfernen Sie die Ameisensäure mit einem Rotationsverdampfer. Gefriertrocknen Sie die Rückstände, die aus dem Rotationsverdampfer entfernt wurden, um den dendrimeren Chelator zu erhalten.

Bestimmen Sie mit Hilfe der Protonen-NMR die Anzahl der makrozyklischen Einheiten, die an das Dendrimer gekoppelt sind. Lösen Sie den gefriergetrockneten Chelator in Wasser auf. Verwenden Sie 0,1 molares Natriumhydroxid, um den pH-Wert der Lösung auf 7,0 einzustellen.

Geben Sie eine Lösung von 113 Milligramm Gadolinium-III-Chlorid in einem Milliliter Wasser tropfenweise über einen Zeitraum von vier Stunden zur Chelatorlösung. Stellen Sie den pH-Wert regelmäßig mit 0,05 molaren Natriumhydroxid auf 7,0 ein. Rühren Sie die Mischung 24 Stunden lang bei Raumtemperatur um.

Fügen Sie dann über einen Zeitraum von vier Stunden portionsweise 158 Milligramm EDTA hinzu und korrigieren Sie den pH-Wert bei Bedarf wieder auf 7,0. Weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur umrühren. Packen Sie eine Größenausschlusschromatographiesäule mit hydrophilem Gelfiltrationsmedium, das in Wasser gequollen ist.

Konzentrieren Sie das Reaktionsgemisch, laden Sie das Gemisch auf die Säule und eluieren Sie es mit entionisiertem Wasser. Die gereinigte Probe wird in einer Zentrifugenfiltereinheit mit drei Kilodalton 30 Minuten lang bei 1.800 g zentrifugiert. Wiederholen Sie die Filtration etwa fünfmal, um überschüssiges Gadolinium und EDTA zu entfernen.

Bestätigen Sie das Fehlen von freien Gadolinium-Ionen im Filtrat mit einem Xylenol-Orangen-Test. Entfernen Sie flüchtige Bestandteile aus der filtrierten Probe und trocknen Sie die Rückstände gefriergetrocknet, um das dendrimere Kontrastmittel zu erhalten. Bereiten Sie eine Stammlösung von DCA in Wasser mit einer Konzentration zwischen fünf und 10 Millimolar vor.

Um die genaue DCA-Konzentration zu bestimmen, kombinieren Sie zunächst 360 Mikroliter der Stammlösung mit 60 Mikrolitern eines D2O- und tert-Butanol-Standards. Geben Sie 400 Mikroliter der Probe in ein äußeres NMR-Röhrchen. Legen Sie ein koaxiales NMR-Einsatzröhrchen mit einer Referenzlösung für tert-Butanol und Wasser in das Probenröhrchen.

Erfassen Sie ein Protonen-NMR-Spektrum und messen Sie die Frequenzverschiebung zwischen den tert-Butanol-Signalen der Referenz- und Probenlösungen. Berechnen Sie die DCA-Konzentration anhand der gezeigten Formel und korrigieren Sie das in der Probe zugesetzte tert-Butanol. Bestimmen Sie auf die gleiche Weise die Konzentration einer handelsüblichen GdDOTA-Lösung.

Geben Sie DCA- und GdDOTA-Lösungen in HEPES-Puffer- und Wasserkontrollen in zwei Sätze Kunststofffläschchen. Verschließen Sie die Fläschchen mit Kappen, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Laden Sie die 0,01 und 0,02 Millimolar DCA-Proben horizontal in eine 60-Milliliter-Spritze, eine der 0,5 und 1,0 Millimolar GdDOTA-Proben und zwei der Wasserkontrollen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie den zweiten Probensatz in eine zweite 60-Milliliter-Spritze laden. Füllen Sie jede Spritze mit einer millimolaren GdDOTA-Lösung und verschließen Sie die Spritzenspitzen. Legen Sie eine der Spritzen horizontal in einen MRT-Scanner, so dass die Proben vertikal zum Scanner stehen.

Schieben Sie die Spritzen in die Mitte des Scanners. Wählen Sie den anatomischen Scan aus, um die Spritze im Isozentrum des Magneten zu positionieren. Drücken Sie dann die Ampeltaste, um die anfänglichen Scanparameter anzupassen und den Scan zu starten.

Wählen Sie die Schnell-/Slow-Angle-Aufnahmemethode für die T1-gewichtete Bildgebung oder die schnelle Erfassung mit Entspannungsverbesserungsmethode für die T2-gewichtete Bildgebung. Verwenden Sie den Localizer-Scan, um die koronale Schicht für die vertikal ausgerichteten Proben auszuwählen. Optimieren Sie den Kontrast zu den Rauschaufnahmeparametern und erfassen Sie das Bild.

Verwenden Sie einen zirkulären ROI, um die durchschnittliche Signalamplitude und die Standardabweichung für den Hintergrund und für jede Probe zu bestimmen. Berechnen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis. NMR, MALDI-TOF MS und Elementaranalysen zeigten, dass durchschnittlich 49 makrozyklische Einheiten an das G4 PAMAM-Dendrimer konjugiert waren.

Die Konzentrationen sowie die longitudinalen und transversalen Relaxationszeiten von DCA-Lösungen wurden ebenfalls mit NMR bestimmt. Die erhaltenen Relaxivitätswerte wurden mit einem kommerziell erhältlichen und klinisch verwendeten GdDOTA-Monomer verglichen. Die DCA-Leistung wurde auch mit dem GdDOTA-Monomer verglichen.

Zwei Gruppen von Lösungen wiesen ähnliche Gadolinium-Konzentrationen auf, die durch die Anzahl der konjugierten makrozyklischen Einheiten bestimmt wurden, und die beiden anderen Gruppen wiesen ähnliche molekulare Konzentrationen auf. In einem T1-gewichteten Bildgebungsexperiment mit ähnlichen Gadolinium-Konzentrationen war das Signal-Rausch-Verhältnis für DCA etwas höher als für GdDOTA. Wenn die Lösungen nach Molekül ähnliche Konzentrationen aufwiesen, war das DCA-Signal-Rausch-Verhältnis etwa dreimal größer als das von GdDOTA.

In einem T2-gewichteten Bildgebungsexperiment war das Signal-Rausch-Verhältnis des DCA in beiden Konzentrationspaaren signifikant niedriger als das des GdDOTA, insbesondere bei höheren DCA-Konzentrationen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein gereinigtes und charakterisiertes MRT-Kontrastmittel auf Dendrimerbasis herstellt. Nach diesem Verfahren können verschiedene Arten von dendrimeren und nanoskaligen MRT-Kontrastmitteln hergestellt werden, indem die Einheiten des Moleküls modifiziert und bequem analysiert werden.

Nach der Beherrschung dieser Technik sollten die Forscher auf dem Gebiet der Entwicklung von MRT-Kontrastmitteln in der Lage sein, eine Reihe spezifischer Sonden für die Durchführung verschiedener funktioneller Studien vorzubereiten, die für die moderne molekulare Bildgebung von entscheidender Bedeutung sind.