Synthesis, Cellular Lieferung und In-vivo- Anwendung der Dendrimer-basierten pH-Sensoren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Entwicklung neuer Fluoreszenzsensoren auf Basis von Dun-Drummern mit verbesserten Eigenschaften für die pH-Bildgebung in vitro in lebenden Zellen und in vivo. Dies wird erreicht, indem zunächst pH-empfindliche Farbstoffe zusammen mit anderen Einheiten, wie z. B. Zielgruppen oder pH-Werten in empfindlichen Farbstoffen, an ein dendritisches Gerüst konjugiert werden. Und In-vitro-Messungen werden durchgeführt, um eine pH-Kalibrierungskurve neben dem pH-Wert in lebenden Zellen zu erzeugen.

Der Sensor wird durch Elektroporation zugeführt und pH-Karten werden mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie erstellt, um den pH-Wert im extrazellulären Raum des Gehirns abzubilden. Während der physiologischen und pathologischen neuronalen Aktivität wird der Sensor in das Gehirn von anästhesierten Mäusen mikroinjiziert. Die Fluoreszenzdaten werden dann mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie aufgenommen.

Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass es Drimmer-basierten Sensoren gelingt, pH-Änderungen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu messen, sowohl in lebenden Zellen als auch in vivo. Obwohl bereits mehrere Grippefarbstoffe mit pH-sensitivem Verhalten eingesetzt wurden, leiden diese unter mehreren Nachteilen, wie z. B. schlechter Beweglichkeit und Zellleckage. Darüber hinaus erlauben sie nicht die unüberlegte metrische absolute Messung.

Hier haben wir die Konation von pH-empfindlichen Farbstoffen mit dem genetischen Gerüst D demonstriert, und da die Leistungen eine genaue Messung mit der besonderen und zeitlichen Auflösung ermöglichen, könnte diese Methode ein nützliches Werkzeug sein, um physiologische und pathologische Prozesse zu untersuchen, die durch den pH-Wert in lebenden Zellen reguliert werden. Die Störung der pH-Regulation im Neurosystem ist mit verschiedenen Erkrankungen wie Schlaganfall und Epilepsie verbunden, und der verfügbare pH-Sensor erwies sich als wenig wirksam, was zum Design des vorgestellten Sensors führte. Obwohl dieses Met hier in der pH-h-Bildgebung angewendet wurde, handelt es sich um einen allgemeinen Ansatz, der auf andere biologisch relevante Spezies angewendet werden kann.

Durch die Wahl des Profit-Sensing-Farbstoffs macht der einfache und vielseitige synthetische Ansatz diese Verfahren unkompliziert. Heute wird das Verfahren von Giovanni re, Barbara ti, Marco Brody und Sebastian Suli vorgeführt, um pH-Indikatoren an Piam Demers zu konjugieren. Beginnen Sie damit, den Rimer in wasserfreiem DMSO bei einer Endkonzentration von 50 Mikromolaren aufzulösen.

Bereiten Sie 10 mikromolare Stammlösungen von Fluorescein NHS und Tetraethyl RUMINE NHS, auch bekannt als TMR in wasserfreiem Material, DMSO in einem kombinierten Mikrozentrifugenröhrchen vor, einen Milliliter G vier Peram Dederer-Lösung mit acht Äquivalenten oder 40 Mikroliter Fluorescein und acht Äquivalente oder 40 Mikroliter TMR. Das molare Verhältnis in der Mischung spiegelt die Menge der auf dem Demer geladenen Farbstoffe wider. Rühren Sie die Lösung 12 Stunden lang bei Raumtemperatur um.

Als nächstes verdünnen Sie das Gemisch eins bis 10 mit entionisiertem Wasser und laden Sie das Reaktionsgemisch in einen Dialysebeutel mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 10 Kilodalton, dialysieren Sie gegen deionisiertes Wasser und ersetzen Sie das Wasser im Reservoir dreimal innerhalb von 24 Stunden. Füllen Sie die Lösung am nächsten Tag in ein Glasfläschchen und frieren Sie sie einige Stunden lang bei minus 80 Grad ein. Wenn die Lösung vollständig gefroren ist, geben Sie die Durchstechflasche in einen Gefriertrockner und gefrieren Sie sie 24 Stunden lang.

Man erhält ein violettes Pulver, das wellig wird, erhält man einen Feststoff und löst es in mqe Wasser auf. Bei einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren. Geben Sie die Lösung in 50-Mikroliter-Aliquoten in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ab und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.

Für die In-vitro-Kalibrierung bereiten Sie eine 500 nanomolare Lösung von D-Drummer in zwei Millimolaren PBS in einem Quarz-Q-Tierarzt vor. Ein sehr verdünnter PBS-Puffer wird verwendet, um abrupte Änderungen des pH-Werts während der Titration zu vermeiden. Messen Sie die Emissionsspektren von Fluorescein und TMR und optimieren Sie die optischen Einstellungen des Fluorimeters, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen.

Führen Sie als Nächstes eine pH-Titration durch, indem Sie kleine Volumina von 0,1 normalem Natriumhydroxid und 0,1 normaler Salzsäure hinzufügen. Schütteln Sie nach jeder Zugabe den Q Vet, um ihn zu mischen. Warten Sie eine Minute auf die Äquilibrierung und messen Sie dann den pH-Wert mit Hilfe eines pH-Wertes.

Mikroelektroden-Emissionsspektren von Fluorescein und TMR sollten für jeden Schritt unverändert aufgezeichnet werden. In den optischen Einstellungen wird die Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit vom pH-Wert aufgetragen. Für die Titration sollte das Stäbchen-Domine-Signal nicht vom pH-Wert beeinflusst werden.

Das Fluoresceinsignal sollte eine sigmoidale Kurve aufweisen und mit einem Einzelbindungsmodell mit einem PK von 6,4 für die Elektroporation ausgestattet sein. Sechsmal 10 bis die fünften Helazellen in 72 Mikrolitern in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen zu den resuspendierten Zellen überführen. Dendri oder wässrige Lösung in einer Konzentration von zwei Mikromolaren zugeben, drei Milliliter Elektroporationspuffer in ein Mikroreinigungsröhrchen geben.

Anschließend wird mit einer 10-Mikroliter-Elektroporationsspitze das Zell- und Rimergemisch abgesaugt. Führen Sie anschließend die Mikropipette in die Pipettierstation ein und stellen Sie hier die Bedingungen für den Mikroaufreinigungsimpuls ein. Die Impulsspannung ist auf 1005 Volt eingestellt.

Die Pulsbreite ist auf 35 Millisekunden eingestellt, die Pulszahl auf zwei nach der Pulsplatte. 20 Mikroliter der elektroporierten Zellen auf Glasbodenschalen mit frischem Medium ohne Antibiotika. 12 Stunden nach der Elektroporation werden die Zellen mit einem konfokalen Mikroskop unter Verwendung eines Standard-Filtersets für Fluorescein und R Domine abgebildet.

Konzentrieren Sie sich auf die Probe und passen Sie die Laserleistung und die Detektorverstärkung an, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren. War die Elektroporation erfolgreich, sollten die Zellen in beiden Kanälen hell fluoreszieren. Die Lokalisierung hängt von der Größe und Ladung der verwendeten D ab. Oft.

Die lysosomale Lokalisation der Sonne, die als kleine perinukleäre Vesikel angesehen wird, liegt aufgrund von Endozytose oder Kompartimentalisierung vor. Wenn die lysosomale Lokalisation vorherrscht, bei der der größte Teil der Fluoreszenz in den Vesikeln lokalisiert ist und das Porensignal im Zytosol beobachtet wird. Dies bedeutet Toxizität und Messungen sollten verworfen werden.

Erfassen Sie die beiden Kanäle nacheinander, nehmen Sie mehrere Bilder auf und mitteln Sie die Bilder, um die Bildqualität zu verbessern. Um eine pH-Kalibrierkurve zu erstellen, verwenden Sie Puffer mit Opfor bei unterschiedlichen pH-Werten, um den intrazellulären und extrazellulären pH-Wert auf denselben Wert zu verklumpen. Nehmen Sie mindestens 20 Zellbilder pro pH-Wert auf und messen Sie mindestens fünf Punkte von pH 5,5 bis pH 7,5.

Es erinnert daran, dass der pH-Wert B sechs für Zellen giftig ist, aber nur für kurze Zeit toleriert werden kann, also nehmen Sie Bilder so kurz wie möglich auf. Wenn Sie Anzeichen von Apoptose sehen, verwerfen Sie die Zellen und starten Sie neu. Nach der Übernahme.

Verwenden Sie image J oder eine analoge Software für die Datenanalyse. Bestimmen Sie zunächst das Verhältnis von Grün zu Rot. Stellen Sie dann das Verhältnis zum pH-Wert dar, um einen linearen Trend zu erzeugen, der eine Kalibrierungskurve ergibt, die zur Umrechnung des Verhältnisses in den pH-Wert in zukünftigen Experimenten verwendet werden kann.

Für die In-vivo-Probenvorbereitung beginnen Sie mit C 57, schwarzen sechs J und weiblichen Mäusen zwischen dem 28. und 70. postnatalen Tag. Nachdem Sie die Mäuse mit Urethan betäubt haben, führen Sie eine Zehenkneifung durch, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig betäubt ist, und tragen Sie Augensalbe auf, um die kortikale Stressreaktion und das Hirnödem zu reduzieren. Während der Operation injizieren Sie zwei Milligramm Dexamethason pro Kilogramm Körpergewicht intramuskulär

Rasieren Sie anschließend mit einer chirurgischen Schere den Kopf des Tieres, legen Sie ein chirurgisches Tuch auf und tragen Sie 2,5%iges Lidocain-Gel auf die Kopfhaut auf. Schneide mit einer Schere den Hautlappen ab, der den Schädel beider Hemisphären bedeckt. Waschen Sie den freiliegenden Knochen mit Kochsalzlösung und mit einer Pinzette, entfernen Sie vorsichtig das Periost.

Dies sorgt für eine bessere Haftfläche. Für Kleber und Zahnzement tragen Sie einen speziell angefertigten Stahlkopfpfosten mit einer zentralen Bildgebungskammer auf und kleben ihn mit Cyanacrylat in einer Ebene, die ungefähr parallel zum Schädel über der interessierenden kortikalen Region verläuft. Befestigen Sie den Stift mit weißem Zahnzement.

Fixieren Sie den Kopf der Maus und führen Sie eine Kraniotomie mit einem Durchmesser von zwei bis drei Millimetern durch, indem Sie über die interessierende Region bohren. Häufig wird während des gesamten Bohrvorgangs eine Spritze verwendet, um frisches, steriles A CSF auf den Schädel aufzutragen, um die Erwärmung der Hirnrinde während der Operation zu minimieren. Nach der Kraniotomie wird das Tier in die Bildgebungsphase überführt, um den Kopf ruhig unter dem Objektiv zu halten.

Schrauben Sie die Bildgebungskammer an den verstellbaren Pfosten und setzen Sie einen speziell angefertigten Kunststoffmaulkorb auf, der mit Sauerstoff verbunden ist. Dadurch wird während des Experiments sauerstoffangereicherte Luft zur Verfügung gestellt, um die Atmung der Tiere zu unterstützen.

Um den Sensor in die Hirnrinde zu injizieren, wird eine Glaspipette mit einem Spitzendurchmesser von vier Millimetern und eine Silberchlorid-Elektrode geladen. Mit der ER-Lösung für einen mikromolaren Drimmer erleichtert die Elektrode die Aufzeichnung extrazellulärer Feldpotentiale mit einem Mikroinjektionsaufbau. Führen Sie die Pipette in einer Tiefe von ca. 150 Mikrometern in die Hirnrinde ein.

Injizieren Sie ein bis zwei Minuten lang bei einem Druck von 0,5 Pfund pro Quadratzoll, um den optischen Aufbau für die Bildgebung zu optimieren. Passen Sie die Laserleistung an, um Fotobleichen und Lichtschäden zu minimieren. In der Regel liegt die eingesetzte Laserleistung bei etwa 20 Milliwatt, und die PMT-Verstärkung wird konstant bei 667 Volt gehalten.

Stellen Sie die Laserwellenlänge so ein, dass der Sensor bei 820 Nanometern angeregt wird, und weisen Sie die Software so an, dass Fluoreszein- und Stäbchendomine-Fluoreszenz gleichzeitig durch Standard-FTSE- und TRIT-Filter detektiert wird. Stellen Sie außerdem die Erfassungsfrequenz für die Hintergrundkorrektur auf eine Bildrate von zwei Hertz ein. Erfassen Sie einen Darkframe mit geschlossenem Lasershutter, um das mittlere thermische Rauschen zu messen, das in den PMTs und auf dem Sockel entsteht.

Erfassen Sie schließlich pH-abhängige Fluoreszenzbilder und speichern Sie sie für die spätere Analyse. Analysieren Sie die Daten wie zuvor, um das In-vitro-Verhalten von Fluorescein und Pansen zu beurteilen. Auf dem Rimer geladen, wurde eine pH-Titration mit einem Fluorimeter durchgeführt.

Diese Abbildung zeigt eine typische Titration eines pH-Sensors. Fluorescein und Panme können separat bei 488 Nanometern bzw. 550 Nanometern angeregt werden, was ein minimales Übersprechen zwischen den beiden Kanälen ermöglicht, wie deutlich zu sehen ist. Fluorescein zeigt ein pH-abhängiges Verhalten, während sich das R-dominant-Signal im physiologischen pH-Bereich nicht signifikant ändert.

Das Verhältnis dieser beiden Signale hängt also nicht von der Sensorkonzentration ab, sondern nur vom pH-Wert. Als nächstes wurden zur intrazellulären Abgabe des Indikators Helazellen mit den Dederer-Sensoren elektroporiert und eine konfokale Bildgebung durchgeführt, wie in diesem Video beschrieben. Diese konfokalen Bilder zeigen die Zellen im Fluoreszeinkanal auf der linken Seite, den R-dominanten Kanal in der Mitte und auf der rechten Seite als metrische Karte des pH-Verhältnisses.

Es werden starke Fluorescein- und r-dominante Signale beobachtet, die zusammen lokalisieren und die Integrität der Sensorstruktur demonstrieren. Eine Verhältnismetrikkarte wird rekonstruiert, indem die beiden Bilder Pixel für Pixel geteilt und mit einer Pseudofarbskala dargestellt werden. Um die Sensorreaktion innerhalb der Zellen zu kalibrieren, wurde eine pH-Klemmung mit Ionophoren durchgeführt, wie hier gezeigt.

Indikatoren reagieren leicht auf den pH-Wert mit einer Änderung des Grün-Rot-Verhältnisses. Die resultierenden Daten wurden verwendet, um eine Kalibrierkurve für genaue pH-Messungen zu erstellen. Der lineare Trend in der Kalibrierung zeigt die Fähigkeit des Sensors, ohne Störung durch die zelluläre Umgebung auf den pH-Wert zu reagieren.

Um zu demonstrieren, wie Dendri-basierte Sensoren für die In-vivo-Bildgebung eingesetzt werden können, wurde eine pH-Bildgebung im Gehirn einer Dendri- oder injizierten anästhesierten Maus durchgeführt. Fluorescein- und r-dominant-Signale wurden gleichzeitig mit einer Anregung von 820 Nanometern erhalten, und die Verhältniskarte wurde Pixel für Pixel aufgebaut, ähnlich wie bei Messungen lebender Zellen. Bemerkenswert ist, dass die Indikatoren im extrazellulären Raum lokalisiert sind, während die nicht fluoreszierenden Bereiche im Bild Zellkörper oder kleine Blutgefäße identifizieren, um die Reaktion des Sensors auf den pH-Wert zu überprüfen.

Wir setzten die Hyperkapnoe ein. Es ist nämlich bekannt, dass Kohlendioxid das Gleichgewicht der Karbonatpuffer im Blut und im Gewebe verändert, was zu einer Übersäuerung des Gewebes führt. Wie in diesem Diagramm zu sehen ist, reicht das Einatmen von 30 % Kohlendioxid aus, um eine starke Reaktion des Sensors auszulösen, die bei der Drehzahlbeatmung der Maus vollständig reversibel ist.

Diese Ergebnisse zeigen das Potenzial von Offerer-basierten Sensoren, physiologische und pathologische Veränderungen des pH-Werts in lebenden Zellen und in vivo aufzuzeigen. A, unser Verfahren ist kompatibel mit anderen Messungen wie z.B. elektrophysiologischen Aufzeichnungen. Dies ermöglichte es, gleichzeitig komplementäre Informationen über den ablaufenden biologischen Prozess zu erhalten.

Diese Methode ebnete nach ihrer Entwicklung den Weg für Forscher in der Zellbiologie und Neurobiologie, um pH-regulierte Prozesse in Kulturzellen und in vivo zu erforschen.