Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoidkomplexe für die Verwendung als Kontrastmittel für die Magnetresonanz-Tomographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Synthese, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanid-haltigen Komplexen, die zur Markierung biologischer Makromoleküle verwendet werden können. Dies wird erreicht, indem zuerst das Metallausgangsmaterial und der Ligand gemischt werden, während der pH-Wert der Lösung kontrolliert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den resultierenden Komplex mittels Dialyse zu reinigen.

Als nächstes muss das Fehlen von freiem Metall überprüft werden. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Charakterisierung der Eigenschaften des Komplexes, die für die Bildgebung relevant sind. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass sich die synthetisierten Komplexe durch Messungen der Entspannungsaktivität als Kontrastmittel verhalten.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Bildgebung zu beantworten, z. B. ob sich die Wasserkoordinationszahl eines Kontrastmittels bei der Bindung an ein Protein ändert. Im Allgemeinen wird es für Einzelpersonen, die diese Methode benötigen, schwierig sein, da eine sorgfältige Kontrolle des pH-Werts dazu führt, dass der LI für die biologische Bildung unbrauchbar wird. Die Dialyse- und Aktivitätsmessungen werden von Buda und Sashi vorgeführt.

Doktoranden aus meinem Labor: Um mit der Methation mit Lanthanidsalzen zu beginnen, lösen Sie zunächst ein Äquivalent des Liganden in Wasser auf, um eine 30 bis 265 millimolare Lösung herzustellen. Der Ligand Paraiso Benzyl DTPA wird hier in einer Konzentration von 73 Millimolar verwendet. Stellen Sie als Nächstes den pH-Wert der Ligandenlösung auf 5,5 bis sieben ein, indem Sie ein molares Ammoniumhydroxid hinzufügen.

In diesem Video werden nun 0,2 Milliliter der einen molaren Ammoniumhydroxidlösung verwendet, um ein bis zwei Äquivalente Lanthanidchlorid in Wasser zu lösen, um eine Lösung mit einer Konzentration von fünf bis 1000 Millimolar herzustellen. In Konzentrationen von 111 Millimolar kann entweder Euro-Biumchlorid oder Gadoliniumchlorid verwendet werden. Oft wird ein Überschuss an Metall verwendet, um die Lüftung bis zum Ende zu treiben und somit die Reinigung zu vereinfachen.

Als nächstes fügen Sie jede Lösung von Latansalzen unter Rühren zu der vorbereiteten Ligandenlösung hinzu. Stellen Sie nun den pH-Wert der resultierenden Reaktionsgemische durch Zugabe von 0,2 molar Ammoniumhydroxid auf 5,5 bis sieben ein. Hierbei werden insgesamt 0,5 Milliliter der 0,2 molaren Ammoniumhydroxidlösung zur Einstellung der Lösung verwendet.

Wenn der verwendete Ligand säureempfindliche funktionelle Gruppen enthält, passen Sie den pH-Wert während dieses Schritts mehrmals an. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den pH-Wert einstellen, denn wenn die Lösung zu basisch wird, werden basenempfindliche funktionelle Gruppen wie Isothiocyanat unbrauchbar. Für die Konjugation ist die Reaktion durch pH-Messungen genau zu überwachen.

Die Reaktion ist abgeschlossen, wenn der pH-Wert konstant bleibt. Für Liganden ohne basenempfindliche funktionelle Gruppen kann eine Aufarbeitung, die eine Erhöhung des pH-Werts beinhaltet, ebenfalls nützlich sein. Um mit der Dialyseuntersuchung zu beginnen, bestimmen Sie eine geeignete Länge des Dialyseschlauchs, um das Probenvolumen aufzunehmen, sowie eine zusätzliche Länge, um zusätzliche 10 % des Probenvolumens aufzunehmen. Befolgen Sie dann die Anweisungen des Herstellers, um den Schlauch auf diese Länge zu schneiden.

In diesem Video wurde eine Cutoff-Membran mit einem Molekulargewicht von 100 bis 500 Dalton verwendet, aber ein Cutoff-Schlauch mit größerem Molekulargewicht kann je nach Bedarf verwendet werden, wenn die Konjugation vor der Methation durchgeführt wird. Gegebenenfalls gemäß den Richtlinien des Herstellers den geschnittenen Dialyseschlauch einweichen und 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur Wasser Wasser erhitzen. Füllen Sie anschließend ein Dialysereservoir mit Wasser, das als Dialysat dient. Hier kommt ein Ein-Liter-Becher zum Einsatz.

Das Dialysatvolumen sollte etwa das 100-fache des Volumens der Probe betragen. Falten Sie nun ein Ende des Schlauches zweimal zusammen und sichern Sie den gefalteten Teil mit der Dialyseverschlussklemme. Wickeln Sie das Ende des Verschlusses mit einem Gummiband ein, um sicherzustellen, dass er während der Dialyse geschlossen bleibt.

Filtrieren Sie das zuvor vorbereitete Reaktionsgemisch durch einen 0,2-Mikron-Filter. Laden Sie dann das Filtrat in das offene Ende des Schlauchs. Achten Sie darauf, den Schlauch nicht zu zerreißen.

Achten Sie darauf, genügend Kopffreiheit zu lassen, um den Schlauch zu schließen. Falten Sie das verbleibende offene Ende des Schlauchs zweimal, sichern Sie es dann mit einem Verschluss und umwickeln Sie den Verschluss mit einem Gummiband. Befestigen Sie anschließend ein Glasfläschchen mit Luft mit einem anderen Gummiband an der Klemme an einem Ende des Dialyseschlauchs.

Befestigen Sie dann ein Fläschchen mit Sand an der anderen Klemme. Diese Fläschchen sorgen dafür, dass der Schlauch im Dialysat eingetaucht bleibt. Legen Sie nun den vollen Schlauch in das Dialysereservoir, das Dialysat enthält.

Rühren Sie das Dialysat mit einer magnetischen Rührplatte bei Umgebungstemperatur langsam auf. Stellen Sie sicher, dass die Rührgeschwindigkeit langsam bleibt und die Lösung dies nicht tut. Wirbel. Wechseln Sie den Dialat dreimal im Laufe eines Tages.

In diesem Video wird der Dialat bei 2,5, 6,5 und 11,5 Stunden geändert. Lassen Sie die Dialyse über Nacht für insgesamt 20 bis 28 Stunden fortsetzen. Sobald die Dialyse abgeschlossen ist, entfernen Sie den Schlauch aus dem Dialat und öffnen Sie vorsichtig einen Verschluss, um die Probe zu entnehmen.

Waschen Sie den Dialyseschlauch dreimal mit Wasser und kombinieren Sie die Spülungen mit der Probe. Zum Schluss entnehmen Sie hier unter reduziertem Druck das Wasser aus der Probe. Dies wird durch Gefriertrocknung erreicht.

Die Probe wird eingefroren und dann auf eine Gefriertrocknungsvorrichtung gelegt. Um das Vorhandensein von freiem Metall in der Probe zu beurteilen, bereiten Sie zunächst Acetatpuffer vor, indem Sie 1,4 Milliliter Essigsäure in 400 Millilitern Wasser lösen, und stellen Sie den pH-Wert mit einem molaren Ammoniumhydroxid auf 5,8 ein und fügen Sie Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 500 Millilitern zu erzeugen. Lösen Sie dann 0,3 Milligramm jedes Komplexes in 0,3 Millilitern Puffer auf.

Bereiten Sie nun den xol-orangefarbenen Indikator vor, der im Puffer mit einem pH-Wert von 5,8 16 Mikromolar betragen sollte. Geben Sie drei Milliliter dieser Indikatorlösung zu den zuvor gelösten Metallkomplexen. Erkennen Sie das Vorhandensein von freiem Metall durch Beobachtung eines Farbwechsels des Indikators von gelb nach violett.

Falls gewünscht, kann die Menge an freiem Metall durch Erstellen einer Kalibrierkurve quantifiziert werden. Wenn freies Metall übrig bleibt, sollte die Probe vor der Charakterisierung mittels Dialyse oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie weiter gereinigt werden. Um als nächstes die Wasserkoordinationszahl für eine Opiumprobe zu bestimmen, bereiten Sie eine Lösung von etwa einem Millimolar des opiumhaltigen Komplexes in Wasser vor und dann eine weitere Lösung der gleichen Konzentration in Deuteriumoxid.

Vor der Analyse muss die Deuteriumoxidlösung dreimal verdampft und in Deuteriumoxid gelöst werden, um Restwasser zu entfernen, das Spektrofluorimeter einschalten, die Wasserlösung in eine saubere Vete geben und die Vete in das Spektrofluorimeter geben. Führen Sie nun Anregung und Emissionen durch, um die Maxima für jeden bei etwa 395 Nanometern bzw. 595 Nanometern zu bestimmen. Führen Sie als Nächstes ein Phosphoreszenz-Zeitzerfallsexperiment mit den soeben ermittelten Anregungs- und Emissionswellenlängen und den hier angezeigten Parametern durch.

Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer vorbereiteten Deuteriumoxidlösung aus dem soeben erhaltenen Diagramm der Lumineszenzzerfallsdaten, dem natürlichen Protokoll der Intensität über der Zeit. Die Steigung dieser Linien sind die Abklingraten. In diesem Video wurde Microsoft Excel 2007 verwendet, um die natürlichen Log-Plots aus den Rohdaten zu generieren.

Verwende die Zerfallsraten in der Gleichung, die von Hors und Kollegen entwickelt wurde, die hier zu sehen ist. Wenn Ihr Ligand OH- oder NH-Gruppen enthält, die mit dem Metall koordiniert sind, muss die Gleichung vor der Verwendung geändert werden. Um zuerst die Relativitätsmessungen der Probe zu bestimmen, wählen Sie den gewünschten Anwendungsmodus auf dem Relaxationszeitanalysator aus, entweder T eins oder T zwei.

Hier wird die Einstellung T one ausgewählt. Bereiten Sie als nächstes eine Reihe von Proben vor, die unterschiedliche Konzentrationen des Lanthanid-haltigen Komplexes in einem Lösungsmittel enthalten. Hier wird Wasser als Lösungsmittel verwendet und Lösungen von zehn fünf zwei 0,5, 1,25, 0,625 und null verwendet.

Millimolar werden hergestellt. Es können auch andere Lösungsmittel oder Puffer verwendet werden, aber es ist wichtig, das Lösungsmittel als Rohling zu verwenden. Das endgültige Volumen der Probe ist spezifisch für das verwendete Instrument.

Legen Sie eine Probe in das Gerät und lassen Sie sie fünf Minuten lang ruhen, um sie auf die Temperatur des Instruments auszugleichen, die für das in diesem Video verwendete Gerät 37 Grad Celsius beträgt. Bestimmen Sie nun die Relaxationszeit in Sekundeneinheiten, indem Sie die Parameter der Software anpassen, um eine glatte Exponentialkurve für T eins oder T zwei zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Proben, einschließlich des Rohlings.

Berechnen Sie nun den Kehrwert der gemessenen Relaxationswerte T eins oder T zwei und zeichnen Sie. Diese Werte im Vergleich zur Lathan-Konzentration und die Einheiten von Millimolar passen das Diagramm mit einer geraden Linie an. Die Neigung der Anpassungslinie ist die Entspannungsaktivität, wobei R eins oder R zwei für T eins bzw. T zwei ist.

Hier sehen wir das allgemeine Schema der Vermittlung und Reinigung. Dieses Schema zeigt das allgemeine Verfahren für die Methation und die Gründe für die Wahl verschiedener Reinigungswurzeln. Hier sehen wir ein repräsentatives Lumineszenzzerfallsdiagramm, in dem der natürliche Zerfallslog über die Zeit aufgetragen wird: Die Steigungen der Linien, die aus ähnlichen Kurven generiert werden, die für Wasser- und Deuteriumoxidlösungen erforderlich sind, werden mit Gleichung eins verwendet, um die Wasserkoordinationszahl von opiumhaltigen Komplexen zu bestimmen.

Ein repräsentatives Beispiel für Livity Messungen ist hier zu sehen, wobei eine Steigung der Anpassungslinie die T one Livity der Probe ist. Neben der im Protokoll beschriebenen Charakterisierung der Wasserkoordinationszahl und des Lvivity ist es auch wichtig, die Endprodukte mit chemischen Standardtechniken zu charakterisieren. Die Identität der Verbindung kann mittels Massenspektrometrie ermittelt werden: Hier sind repräsentative Massenspektren dargestellt, die die diagnostischen Isotopenmuster für Gadolinium und opium enthaltende Komplexe zeigen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Endr-Spektroskopie, HPLC und Elementaranalyse durchgeführt werden, um die resultierenden Komplexe weiter zu charakterisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie lanthanidhaltige Komplexe, die zur Markierung biologischer Makromoleküle verwendet werden können, synthetisiert, gereinigt und charakterisiert werden können.