Name: Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoidkomplexe für die Verwendung als Kontrastmittel für die Magnetresonanz-Tomographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Lernen Sie die Synthese, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoidkomplexen als Kontrastmittel für die Magnetresonanz-Tomographie. Diese Methode ermöglicht die Markierung biologischer Makromoleküle für bildgebende Verfahren.

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Wir danken Anschubfinanzierung von der Wayne State University (MJA), einen Zuschuss von der American Foundation for Aging Research (SMV) und ein Pathway to Independence Career Transition Award (R00EB007129) aus dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering der National Institutes of Health (MJA).

1. Metallierung mit LnCl 3 Salze <ol><li> Lösen des Liganden in Wasser zu einer Lösung von 30-265 mm. Die Liganden 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-Diethylentriaminpentaessigsäure (p-SCN-Bn-DTPA) wurde in diesem Video bei einer Konzentration von 73 mM verwendet. </li><li> Den pH-Wert der Lösung von Ligand zwischen 5,5 und 7,0 durch Zugabe von 1 M NH 4 OH. In diesem Video wurden 0,2 ml der 1 M NH 4 OH-Lösung verwendet. </li><li> Lösen Sie 1-2 Äquivalente der LnCl 3 in Wasser zu einer Lösung mit einer Konzentration von 5-1000 mm herzustellen. In diesem Video wurden EuCl 3 und GdCl 3 in Konzentrationen von 111 mM verwendet. Ein Überschuss an Metall wird häufig verwendet, um die Metallierung zum Abschluss zu bringen und damit zu vereinfachen Reinigung. </li><li> Fügen Sie die Lösung von LnCl 3 zur Lösung des Liganden unter Rühren. </li><li> Nach der Zugabe von LnCl 3, den pH-Wert der resultierenden Reaktionsmischung auf zwischen 5,5 und 7,0 durch Zugabe von 0,2 M NH 4 OH. Insgesamt 0,5 ml der 0,2 M NH 4 OH-Lösung wurde in diesem Video verwendet. Wenn Ihr Liganden enthält säureempfindlichen funktionellen Gruppen, den pH-Wert mehrmals während dieses Schrittes. ACHTUNG - Wird die Lösung zu einfach, jede Basis sensitive funktionelle Gruppen, wie Isothiocyanat wird unbrauchbar für die Konjugation werden. </li><li> Überwachen Sie die Reaktion über pH-Messungen. Die Reaktion ist beendet, wenn der pH-Wert konstant bleibt. </li></ol> 2. Raising pH Aufarbeitung (nicht in diesem Video enthalten, aber gut für Liganden ohne Sockel-sensitive funktionelle Gruppen) <ol><li> Fügen Sie konzentrierte NH 4 OH auf die Reaktionsmischung auf pH-Wert von ≥ 11 einzustellen. Dieser Schritt wird jeder Niederschlag unkomplexierten Metall als unlösliches Hydroxid. </li><li> Den Überstand durch einen 0,2 um Filter. Wenn die Reaktionsmischung verstopft den Filter, Zentrifugieren und Dekantieren vor dem Filtern wird empfohlen. </li><li> Wenn eine Dialyse nicht durchgeführt werden, entfernen Sie unter vermindertem Druck (Rotationsverdampfer oder Gefriertrocknung wird empfohlen) Lösungsmittel. </li><li> Steps 2,1-2,3 kann wiederholt werden, wenn freie Lanthanoid bleibt. </li></ol> 3. Dialyse Aufarbeitung <ol><li> Schneiden Sie den Dialyseschlauch auf eine geeignete Länge (folgen Sie den Richtlinien des Herstellers), um das Probenvolumen zu halten, während verlassen Überlänge (ca. 10% des Probenvolumens). In diesem Video wurde eine 100-500 Dalton Molekulargewicht cut-off (MWCO) Membran verwendet, aber auch größere MWCO Schlauch kann nach Bedarf verwendet werden, wenn Konjugation ist vor Metallierung durchgeführt. Außerdem können Dialyse-Kassetten als Alternative zum Dialyseschlauch wenn gewünscht verwendet werden. </li><li> Gegebenenfalls basierend auf den Richtlinien des Herstellers, genießen den Schnitt Dialyseschlauch in Wasser 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Füllen Sie ein Dialyse-Reservoir (a 1 L Becherglas wurde in diesem Video verwendet wird) mit Wasser (Dialysat). Das Dialysat Volumen sollte ca. 100x, dass der Probe sein. </li><li> Falten Sie das eine Ende des Schlauchs zweimal und sichern Sie den gefalteten Teil des Schlauches mit einer Dialyse Verschluss spannen. Wickeln Sie das Ende des Verschlusses mit einem Gummiband um sicherzustellen, dass es während der Dialyse bleibt geschlossen. </li><li> Filter das Reaktionsgemisch durch einen 0,2 um Filter, und laden Sie das Filtrat in das offene Ende des Schlauches darauf achten, daß die Schläuche zerreißen. Achten Sie darauf, genügend Kopfraum zu verlassen, um den Schlauch zu schließen. </li><li> Falten Sie die verbleibenden offenen Ende des Rohres zweimal mit einem Verschluss zu sichern, und wickeln Sie den Verschluss mit einem Gummiband wie in Schritt 3.4. </li><li> Bringen Sie ein Glasfläschchen mit Luft, um die Klemme an einem Ende der Dialyseschlauch mit einem Gummiband. Bringen Sie ein Fläschchen mit Sand auf die andere Klemme. Diese Fläschchen sicher, dass der Schlauch in das Dialysat bleibt eingetaucht. </li><li> Stellen Sie den vollen Rohren in der Dialyse-Reservoir, das Dialysat enthält. </li><li> Stir das Dialysat mit einer magnetischen Rührplatte mit langsamer Geschwindigkeit (kein Vortex) bei Raumtemperatur. </li><li> Ändern Sie den Dialysat 3x im Laufe eines Tages (in diesem Video, das Dialysat wurde mit 2,5, 6,5 und 11,5 h geändert), und dann lassen Dialyse weiterhin über Nacht (für insgesamt von 20-28 h Dialyse). </li><li> Entfernen Sie den Dialyseschlauch aus dem Dialysat und vorsichtig öffnen Sie eine Schließung auf die Probe zu entfernen. Waschen Sie den Dialyseschlauch 3x mit Wasser und kombinieren das Waschwasser mit der Probe. </li><li> Entfernen Sie das Wasser unter vermindertem Druck. Bei der Gefriertrocknung wird in diesem Video verwendet. </li></ol> 4. Bewertung der Anwesenheit von freiem Metall <ol><li> Lösen Sie die Metall-Komplex in Acetatpuffer (Puffer Zubereitung: Lösen Sie 1,4 ml Essigsäure in 400 ml Wasser, den pH-Wert auf 5,8 mit 1 M NH 4 OH, und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 500 mL produzieren) und fügen Sie die Xylenol orange Anzeige (16 uM in pH 5,8-Puffer). In diesem Video, betrug 0,3 mg Komplex in 0,3 ml Puffer gelöst und 3 ml Indikator-Lösung versetzt. </li><li>Das Vorhandensein von freiem Metall durch Beobachtung einer Farbänderung des Indikators von gelb bis violett. </li><li> Falls gewünscht, kann die Menge des freien Metall durch die Schaffung einer Kalibrierkurve 1 quantifiziert werden. Alternativ kann der Farbstoff Arsenazo III statt Xylenolorange 2 verwendet werden. Wenn freies Metall bleibt, sollte die Probe weiter gereinigt werden mittels Dialyse, ein Entsalzungssäule oder High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) vor Charakterisierung. </li></ol> 5. Bestimmung der Wasser-Koordinationszahl (q) <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung der Eu III-haltigen Komplex (~ 1 mm) in H 2 O und eine andere Lösung der gleichen Konzentration in D 2 O. Vor der Analyse muss die D 2 O-Lösung verdampft und gelöst in D 2 O dreimal um das restliche H 2 O. entfernen </li><li> Fügen Sie die Wasser-Lösung, um eine saubere Küvette, und setzen Sie die Küvette in einem Spektrofluorometer. </li><li> Führen Anregungs-und Emissions-Scans, um die Maxima für jede (~ 395 nm und ~ 595 nm, jeweils) zu bestimmen. </li><li> Führen Sie eine Phosphoreszenz Zeit-Zerfall Experiment mit folgenden Parametern: Anregungs-und Emissionswellenlänge von Schritt 5.3, Anregung und Emission Spaltbreiten (5 nm), Flash-count (100), anfängliche Verzögerung (0,01 ms), maximale Verzögerung (13 ms) bestimmt und Verzögerungsinkrement (0,1 ms). Diese Bedingungen sind für die meisten Komplexe, aber die maximale Verzögerung und den inkrementellen Werten kann erhöht oder verringert werden für Arten mit sehr langen oder sehr kurzen Abklingzeiten. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.4 mit der D 2 O-Lösung in Schritt 5.1 vorbereitet. </li><li> Von der Lumineszenz-Zerfall Daten in 5,4 und 5,5 erhalten, Grundstück den natürlichen Logarithmus der Intensität als Funktion der Zeit. Die Steigung dieser Geraden sind die Abbauraten (τ -1) (Abbildung 2). In diesem Video wurde Microsoft Excel 2007 verwendet werden, um den natürlichen Logarithmus Plots aus den Rohdaten zu generieren. Verwenden Sie die Abbauraten in der Gleichung von Horrocks und Mitarbeiter (eq 1) 3 entwickelt. Wenn Ihr Liganden enthält OH-oder NH-Gruppen koordiniert, um das Metall, dann ist die Gleichung müssen vor Gebrauch 3 geändert werden. </li></ol> eq 1: <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="Gleichung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 1"> 6. Relaxivität Messungen <ol><li> Wählen Sie die gewünschte Anwendung Modus auf die Relaxationszeit Analysator: T 1 (longitudinale Relaxationszeit) oder T 2 (transversale Relaxationszeit). </li><li> Eine Reihe von Proben, die verschiedene Konzentrationen von Gd III-haltigen Komplex in einem wässrigen Lösungsmittel enthalten. In diesem Video wurde Wasser als Lösungsmittel und Lösungen von 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 verwendet, und 0 mM hergestellt wurden. Andere wässrigen Lösungsmitteln oder Puffer könnte verwendet werden, aber es ist wichtig, um das Lösungsmittel als Blindwert verwendet. Das endgültige Volumen der Probe ist spezifisch für das Instrument, das verwendet wird. </li><li> Legen Sie eine Probe in das Instrument und lassen es 5 min stehen lassen, um die Temperatur des Gerätes (37 ° C in diesem Video) ausgleichen. </li><li> Bestimmen Sie die Relaxationszeit (in Einheiten von s) durch Anpassung der Parameter der Software, um einen reibungslosen exponentiellen Kurve für T 1 oder T 2 (repräsentative Kurven für T 1 und T 2 sind in Abbildung 3 dargestellt) zu erhalten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6.3 und 6.4 für alle Proben, einschließlich der leeren. </li><li> Berechnen Sie die inverse der gemessenen T 1 oder T 2-Werte in Einheiten von s -1. </li><li> Zeichnen Sie die T 1 -1 oder T 2 -1 Werte im Vergleich zu Gd III-Konzentration (in Einheiten von mM). Wegen der hygroskopischen Natur der Gd III-Komplexe, bestätigen die Konzentration von Gd III mit Atomabsorptionsspektrometrie oder induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometrie. Fit das Grundstück mit einer geraden Linie. Ein Vertreter Grundstück ist in Abbildung 4 dargestellt. </li><li> Die Steigung der angepassten Linie ist die Relaxivität (r 1 oder r 2 für T 1 und T 2), gegliedert und verfügt über Einheiten mM -1 s -1. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Repräsentative Daten für die Schritte in diesem Protokoll sind in den Tabellen und Abbildungen Abschnitt aufgenommen worden. Neben der Wasser-Koordinationszahl und Relaxivität Charakterisierung in das Protokoll beschrieben, ist es wichtig, Endprodukte mit Standard-chemischen Verfahren zu charakterisieren. Die Identität der Verbindung kann mithilfe der Massenspektrometrie und Vertreter Massenspektren zeigen die diagnostischen Isotopenmuster für Gd III - und Eu III-haltige Komplexe sind in Abbildung 5 dargestellt. Darüber hinaus, für Nicht-Gd III <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Allgemeine Regelung für die Metallierung und Reinigung:. Scheme Darstellung der allgemeinen Vorschrift zur Metallierung und Gründe für die Wahl verschiedener Reinigungsverfahren Routen. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 Lumineszenz-Intensität Grundstück:. Representative Auftragung des natürlichen Logarithmus der Intensität als Funktion der Zeit aus Abschnitt 5. Die Steigungen der Linien von ähnlichen Kurven für Wasser-und D 2 O-Lösungen erworben generiert werden mit eq 1 verwendet, um das Wasser-Koordination Reihe von EU-III-haltige Komplexe zu charakterisieren. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3 Entspannung Abklingzeit Kurven:. Repräsentative Daten für (links) T 1 und (rechts) T 2 Erwerb. Abweichungen von diesen Kurvenformen erzeugen würde unzuverlässige Daten. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4 Relaxivität Bestimmung:. Ein Vertreter Auftragung von 1 / T 1 gegen die Konzentration von Gd III. Die Steigung der angepassten Linie ist Relaxivität und hat Einheiten mM -1 s -1. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5 Massenspektren:. Representative Massenspektren zeigen die diagnostischen Isotopenmuster für (links) Gd III-haltige Komplexe und (rechts) Eu III-haltige Komplexe. Der schwarze Gaussian Spitzen geben die theoretischen Isotopenverteilung und die roten Linien sind die eigentlichen Daten.

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Angesichts der zunehmenden Zahl von Publikationen, die Lanthanoid-basierte Kontrastmittel 4-14 zählen, ist es wichtig, dass Pflege in der Vorbereitung, Reinigung und Charakterisierung von Produkten, um reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse zu gewährleisten, wird übernommen. Diese Komplexe werden oft als schwierig zu reinigen und zu charakterisieren gegenüber organischen Molekülen aufgrund ihrer paramagnetischen Natur und die Empfindlichkeit eines funktionellen Gruppen, die für Biokonjugation verwendet ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagenzien und Geräte </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> EuCl 3 • 6 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203254-5G </td></tr><tr><td> p-SCN-Bn-DTPA </td><td> Makrocyclen </td><td> B-305 </td></tr><tr><td> Ammoniumhydroxid </td><td> EMD </td><td> AX1303-3 </td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech Cellulose-Ester (CE) Dialysemembran - 500 D MWCO </td><td> Fisher Scientific </td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td> Millipore IC Millex-LG Filter Units </td><td> Fisher Scientific </td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td> Xylenolorange Tetranatriumsalz </td><td> Alfa Aesar </td><td> 41379 </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Fluka </td><td> 49199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Cambridge Isotope Laboratories, Inc. </td><td> DLM-4-25 </td></tr><tr><td> Wasserreiniger </td><td> ELGA </td><td> Purelab Ultra- </td></tr><tr><td> Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie und Massenspektrometrie </td><td> Shimadzu </td><td> LCMS-2010EV </td></tr><tr><td> Relaxationszeit Analysator </td><td> Bruker </td><td> mq60 minispec </td></tr><tr><td> UV-VIS Spektralphotometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td> Gefriertrockner </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> pH-Meter </td><td> Hanna Instruments </td><td> HALLO 221 </td></tr><tr><td> Spektrofluorometer </td><td> HORIBA Jobin Yvon </td><td> Fluoromax-4 </td></tr><tr><td> Molecular Weight Calculator Version 6,46 von Matthew Monroe, 17. Oktober 2009 heruntergeladen </td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td> Molecular Weight Calculator </td></tr></tbody></table>

herstellung, reinigung und charakterisierung von lanthanoidkomplexe für die verwendung als kontrastmittel für die magnetresonanz-tomographie

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate-Liganden werden häufig verwendet, um Lanthanidionen Chelat, und die resultierenden Komplexe eignen sich als Kontrastmittel für die Kernspintomographie (MRI). Viele im Handel erhältliche Liganden sind besonders nützlich, da sie funktionelle Gruppen, die für schnelle, hochreine ermöglichen, und mit hoher Ausbeute Konjugation an Makromolekülen und Biomolekülen über aminreaktiven aktivierten Estern und Isothiocyanat-Gruppen oder Thiol-reaktive Maleinimide enthalten. Während Metallierung dieser Liganden wird als allgemein bekannt, im Bereich der Biokonjugation Chemie, subtile Unterschiede in Metallierung Verfahren müssen berücksichtigt werden bei der Auswahl Metall Ausgangsstoffe. Darüber hinaus mehrere Optionen für die Reinigung und Charakterisierung existieren, und die Auswahl der effektivsten Verfahren teilweise abhängig von der Auswahl der Ausgangsstoffe. Diese feinen Unterschiede sind oft in veröffentlichten Protokollen vernachlässigt. Hier ist es unser Ziel, gemeinsame Methoden für die Metallierung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoid-Komplexe, die als Kontrastmittel für die MRT (Abb. 1) verwendet werden können demonstrieren. Wir erwarten, dass diese Publikation ermöglicht biomedizinische Wissenschaftler Lanthanoid Komplexierung Reaktionen in ihr Repertoire von häufig verwendeten Reaktionen integrieren durch Lockerung der Auswahl der Ausgangsstoffe und Reinigungsverfahren.

Wir zeigen die Metallierung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoid-Komplexen. Die hier beschriebenen Komplexe können konjugiert werden, um Makromoleküle, damit diese Rückverfolgung Moleküle mittels Magnetresonanztomographie.

Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoidkomplexe für die Verwendung als Kontrastmittel für die Magnetresonanz-Tomographie

Liganden auf Polyaminopolycarboxylatbasis werden häufig zur Chelatisierung von Lanthanoid-Ionen verwendet, und die daraus resultierenden Komplexe sind als Kontrastmittel für ... nützlich.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Lanthanid-haltige Komplexe zu synthetisieren, zu reinigen und zu charakterisieren, die zur Markierung biologischer Makromoleküle verwendet werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst das metallhaltige Ausgangsmaterial und der Ligand unter Kontrolle des pH-Werts der Lösung miteinander vermischt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den resultierenden Komplex mittels Dialyse zu reinigen.Danach muss das Fehlen freier Metallionen überprüft werden. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Charakterisierung der für die Bildgebung relevanten Eigenschaften des Komplexes. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die zeigen, dass die synthetisierten Komplexe durch Messungen der Relaxivität als Kontrastmittel wirken.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Bildgebung beantworten, beispielsweise, ob sich die Wasserkordinationszahl eines Kontrastmittels bei der Bindung an ein Protein verändert. Im Allgemeinen haben Personen, die diese Methode benötigen, Schwierigkeiten, da eine ungenaue Kontrolle des pH-Werts dazu führt, dass das LI für die biologische Ausbildung nutzlos wird. Die Demonstration der Dialyse und der Aktivitätsmessungen wird Buda und Sashi übernehmen.Doktoranden aus meinem Labor: Um die Methylierung mit Lanthanid-Salzen zu beginnen, lösen Sie zunächst ein Äquivalent Ligand in Wasser, um eine Lösung von 30 bis 265 Millimolar herzustellen. Der hier verwendete Ligand Paraiso Benzyl DTPA liegt in einer Konzentration von 73 Millimolar vor. Anschließend stellen Sie den pH-Wert der Ligandlösung durch Zugabe von einmolarer Ammoniumhydroxidlösung auf einen Wert zwischen 5,5 und 7 ein.In diesem Video werden nun 0,2 Milliliter der einmolaren Ammoniumhydroxidlösung verwendet, um ein bis zwei Äquivalente Lanthanidchlorid in Wasser zu lösen, wodurch eine Lösung mit einer Konzentration von fünf bis 1000 Millimolar entsteht. Entweder Europiumchlorid oder Gadoliniumchlorid kann in Konzentrationen von 111 Millimolar verwendet werden. Häufig wird ein Überschuss an Metall eingesetzt, um die Reaktion zur Vollständigkeit zu treiben und dadurch die Reinigung zu vereinfachen.Fügen Sie anschließend jede Lösung der Lanthansalze unter Rühren zur vorbereiteten Ligandenlösung hinzu. Stellen Sie nun den pH-Wert der resultierenden Reaktionsgemische durch Zugabe von 0,2 molarer Ammoniumhydroxidlösung auf einen Wert zwischen 5,5 und sieben ein. Dabei werden insgesamt 0,5 Milliliter der 0,2 molaren Ammoniumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts verwendet.Wenn der verwendete Ligand säureempfindliche funktionelle Gruppen enthält, stellen Sie den pH-Wert während dieses Schritts mehrfach ein. Achten Sie darauf, vorsichtig beim Einstellen des pH-Werts vorzugehen, da sonst basischem empfindliche funktionelle Gruppen wie Isothiocyanat unbrauchbar werden, falls die Lösung zu basisch wird. Überwachen Sie die Konjugation genau durch pH-Messungen.Die Reaktion ist abgeschlossen, wenn der pH-Wert konstant bleibt. Bei Liganden ohne basisempfindliche funktionelle Gruppen kann eine Aufarbeitung, die eine Erhöhung des pH-Werts beinhaltet, ebenfalls nützlich sein. Um mit der Dialyseaufarbeitung zu beginnen, bestimmen Sie eine geeignete Länge an Dialysefolie, um das Probenvolumen sowie zusätzliche Länge für ein zusätzliches 10 % des Probenvolumens aufzunehmen. Befolgen Sie anschließend die Herstelleranweisungen, um die Folie auf diese Länge zu schneiden.In diesem Video wurde eine Membran mit einer Molekulargewichts-Trenngrenze von 100 bis 500 Dalton verwendet, aber gegebenenfalls können auch Dialyse-Schläuche mit höherer Molekulargewichts-Trenngrenze verwendet werden, wenn die Konjugation vor der Methylierung durchgeführt wird. Falls erforderlich, gemäß den Herstelleranweisungen den zugeschnittenen Dialyse-Schlauch und Wasser 15 Minuten bei Raumtemperatur einweichen lassen. Füllen Sie anschließend ein Dialyse-Behältnis mit Wasser, das als Dialysat dient. Hier wird ein Ein-Liter-Becherglas verwendet.Das Dialysatvolumen sollte etwa das 100-Fache des Probenvolumens betragen. Falten Sie nun ein Ende des Schlauchs zweimal und sichern Sie den gefalteten Bereich mit der Dialyseverschlussklemme. Wickeln Sie ein Gummiband um das Ende der Klemme, um sicherzustellen, dass sie während der Dialyse geschlossen bleibt.Filtrieren Sie die zuvor vorbereitete Reaktionsmischung durch einen 0,2-Mikron-Filter. Anschließend geben Sie das Filtrat in das offene Ende des Schlauchs. Achten Sie dabei darauf, den Schlauch nicht zu zerreißen.Stellen Sie sicher, dass genügend Platz verbleibt, um den Schlauch zu verschließen. Falten Sie das verbleibende offene Ende des Schlauchs zweimal und befestigen Sie es mit einer Verschlussklemme. Wickeln Sie anschließend ein Gummiband um die Klemme. Befestigen Sie danach ein Glasfläschchen, das Luft enthält, mithilfe eines weiteren Gummibands an der Klemme an einem Ende des Dialyse-Schlauchs.Befestigen Sie dann ein Gefäß mit Sand am anderen Klemmhalter. Diese Gefäße stellen sicher, dass die Schläuche im Dialysat eingetaucht bleiben. Legen Sie nun die kompletten Schläuche in das Dialysebehältnis, das Dialysat enthält.Rühren Sie das Dialysat mithilfe eines magnetischen Rührers bei Raumtemperatur langsam um. Achten Sie darauf, dass die Rührgeschwindigkeit gering bleibt und die Lösung nicht verwirbelt wird. Wechseln Sie das Dialysat innerhalb eines Tages dreimal.In diesem Video wird das Dialysat nach 2,5, 6,5 und 11,5 Stunden gewechselt. Lassen Sie die Dialyse über Nacht weiterlaufen, insgesamt 20 bis 28 Stunden. Sobald die Dialyse abgeschlossen ist, entfernen Sie das Röhrchen vom Dialysat und öffnen vorsichtig eine Verschlusskappe, um die Probe zu entnehmen.Spülen Sie das Dialysegerät dreimal mit Wasser und vereinigen Sie die Spülflüssigkeiten mit der Probe. Entfernen Sie abschließend das Wasser aus der Probe unter vermindertem Druck. Dies erfolgt durch Gefriertrocknung.Die Probe wird eingefroren und anschließend auf eine Gefriertrocknungsanlage gegeben. Um das Vorhandensein von freiem Metall in der Probe zu überprüfen, stellen Sie zunächst Acetatpuffer her, indem Sie 1,4 Milliliter Essigsäure in 400 Milliliter Wasser auflösen, den pH-Wert mit einmolarer Ammoniumhydroxidlösung auf 5,8 einstellen und Wasser hinzufügen, um ein Gesamtvolumen von 500 Millilitern zu erhalten. Lösen Sie danach jeweils 0,3 Milligramm des Komplexes in 0,3 Milliliter Puffer auf.Bereiten Sie nun den Xol-Orange-Indikator vor, der in dem Puffer mit pH 5,8 eine Konzentration von 16 Mikromolar aufweisen sollte. Geben Sie drei Milliliter dieser Indikatorlösung zu den zuvor gelösten Metallkomplexen hinzu. Weisen Sie das Vorhandensein freier Metallionen durch Beobachtung eines Farbumschlags des Indikators von gelb nach violett nach.Falls gewünscht, kann die Menge an freiem Metall durch Erstellung einer Kalibrierkurve quantifiziert werden. Bleibt freies Metall zurück, sollte die Probe vor der Charakterisierung weitergereinigt werden, beispielsweise mittels Dialyse oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie. Als Nächstes bereiten Sie zur Bestimmung der Koordinationszahl von Wasser für eine Opiumprobe eine Lösung von etwa einem Millimolar des Opium enthaltenden Komplexes in Wasser sowie eine weitere Lösung derselben Konzentration in Deuteriumoxid vor.Vor der Analyse muss die Deuteriumoxid-Lösung dreimal eingedampft und in Deuteriumoxid aufgenommen werden, um restliches Wasser zu entfernen; schalten Sie anschließend das Spektralfluorimeter ein, geben Sie die wässrige Lösung in eine saubere Küvette und platzieren Sie die Küvette in das Spektralfluorimeter. Führen Sie nun die Anregung und Emission durch, um die Maxima bei etwa 395 Nanometern bzw. 595 Nanometern zu bestimmen. Führen Sie danach ein Phosphoreszenz-Zerfallszeit-Experiment unter Verwendung der zuvor bestimmten Anregungs- und Emissionswellenlängen sowie der hier angezeigten Parameter durch.Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer hergestellten Deuteriumoxid-Lösung. Erstellen Sie anhand der gerade erhaltenen Lumineszenz-Zerfallsdaten ein Diagramm des natürlichen Logarithmus der Intensität über der Zeit. Die Steigungen dieser Geraden entsprechen den Zerfallskonstanten. In diesem Video wurde Microsoft Excel 2007 verwendet, um die Diagramme des natürlichen Logarithmus aus den Rohdaten zu erstellen.Verwenden Sie die Zerfallsraten in der hier gezeigten, von hors und Mitarbeitern entwickelten Gleichung. Wenn Ihr Ligand OH- oder NH-Gruppen enthält, die an das Metall koordiniert sind, muss die Gleichung vor der Anwendung modifiziert werden. Um zunächst die Relativitätsmessungen der Probe zu bestimmen, wählen Sie am Relaxationszeitanalysator den gewünschten Anwendungsmodus, entweder T eins oder T zwei.Hier wird die T-eins-Einstellung ausgewählt. Als Nächstes bereiten Sie eine Reihe von Proben vor, die unterschiedliche Konzentrationen des Lanthanid enthaltenden Komplexes in einem geeigneten Lösungsmittel enthalten. Hier wird Wasser als Lösungsmittel verwendet und Lösungen mit zehn fünf zwei 0,5, 1,25, 0,625 und null.Millimolare Lösungen werden hergestellt. Andere wässrige Lösungsmittel oder Puffer können verwendet werden, es ist jedoch wichtig, das Lösungsmittel als Blindwert zu verwenden. Das Endvolumen der Probe richtet sich nach dem verwendeten Instrument.Platzieren Sie eine Probe im Gerät und lassen Sie sie fünf Minuten lang stehen, um sich auf die Temperatur des Geräts einzustellen, die für die in diesem Video verwendete Einheit 37 Grad Celsius beträgt. Bestimmen Sie nun die Relaxationszeit in Sekunden, indem Sie die Parameter der Software so anpassen, dass eine glatte exponentielle Kurve für T1 oder T2 erhalten wird. Wiederholen Sie dies für alle Proben, einschließlich der Blindprobe.Berechnen Sie nun den Kehrwert der gemessenen T1- oder T2-Relaxationswerte und tragen Sie diese gegen die Lanthankonzentration in Millimolar (mM) auf. Fitten Sie die Daten mit einer Geraden. Die Steigung der angepassten Geraden entspricht der Relaxivität R1 bzw. R2 für T1 und T2.Hier sehen wir das allgemeine Schema für die Vermittlung und Reinigung. Dieses Schema zeigt den allgemeinen Ablauf der Methylierung und die Gründe für die Wahl unterschiedlicher Reinigungswegen. Hier sehen wir eine repräsentative Abklingkurve der Lumineszenz, in der der natürliche Logarithmus des Abklingens über der Zeit aufgetragen ist. Die Steigungen der Geraden, die aus ähnlichen Kurven für Wasser- und Deuteriumoxid-Lösungen gewonnen werden, werden zusammen mit Gleichung eins verwendet, um die Wasserkordinationszahl von Opioid enthaltenden Komplexen zu bestimmen.Ein repräsentatives Beispiel für Lebendigkeitsmessungen ist hier dargestellt, wobei die Steigung der angepassten Geraden die T-eins-Lebendigkeit der Probe angibt. Zusätzlich zur Beschreibung der Wasserkordinationszahl und der Lebendigkeitscharakterisierung, wie sie im Protokoll beschrieben ist, ist es ebenfalls wichtig, die Endprodukte mit standardmäßigen chemischen Methoden zu charakterisieren. Die Identität der Verbindung kann mittels Massenspektrometrie ermittelt werden; repräsentative Massenspektren, die die diagnostischen Isotopenmuster für Gadolinium- und Opium enthaltende Komplexe zeigen, sind hier dargestellt.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie ENDOR-Spektroskopie, HPLC und Elementaranalyse durchgeführt werden, um die resultierenden Komplexe genauer zu charakterisieren. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Lanthanid-haltige Komplexe synthetisieren, reinigen und charakterisieren kann, die für die Markierung biologischer Makromoleküle verwendet werden können.

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