Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, eine reproduzierbare transsklerale subretinale Injektionstechnik einzuführen, um menschliche retinale Pigmentepithelzellen oder RPE-Zellen mit minimalem Risiko einer Netzhautschädigung in den subretinalen Raum der Augen von Nagetieren zu bringen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein kleiner Schnitt in der temporalen Bindehaut hinter dem Limbus gemacht wird, um die darunter liegende Sklera freizulegen. Dann wird eine abgeschrägte 31-Gauge-Insulinnadel verwendet, um in den Sklerakernkomplex einzudringen, indem die Nadel 500 Mikrometer oder etwa die Hälfte der Spitze mit der abgeschrägten Seite nach oben in das Gewebe eingeführt wird, um ein Pilotloch zu erzeugen.

Als nächstes wird eine abgeschrägte 33-Gauge-Injektionsnadel, die an einer Spritze befestigt ist, in das Pilotloch geführt und in einem bestimmten Winkel und einer bestimmten Tiefe eingeführt, das Injektionsloch versiegelt sich selbst, nachdem die Nadel zurückgezogen wurde, und es ist kein Stich oder Gewebekleber erforderlich. Degenerative Retinopathien bestehen aus einem breiten Spektrum von Erkrankungen, an denen verschiedene retinale Zelltypen beteiligt sind. Die weltweit häufigste Krankheit, die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), tritt bei älteren Menschen auf und führt zur dauerhaften Erblindung.

Bei den pathologischen Veränderungen, die bei AMD auftreten, kommt es zu einer anfänglichen Degeneration der pigmentierten Epithelzellen der Netzhaut, kurz RPE. Der Verlust von RPE führt zu einer Dysfunktion der retinalen Fluorrezeptoren oder zum Tod. Die derzeitigen pharmakologischen Behandlungen für AMD im Frühstadium beschränken sich auf die Verlangsamung des Fortschreitens oder die Linderung der Symptome.

In Verbindung mit einem begrenzten regenerativen Potenzial der Netzhaut gibt es keine wirksame Behandlung zur Wiederherstellung des Sehvermögens. Das Neural Stem Cell Institute hat kürzlich eine Population adulter Stammzellen in der RPE-Zellpopulation identifiziert. Diese Zellen können als Quelle für die Stammzellersatztherapie verwendet werden.

Derzeit führt unser Institut präklinische Studien durch, um die Wirksamkeit und Sicherheit der RPE-Stammzelltransplantationstherapie in einem degenerativen RPE-Rattentiermodell zu untersuchen. In dieser Studie verwenden wir eine transskrale, subretinale Injektionstechnik, um RPE-Stammzellen in die Rattenaugen zwischen der Netzhaut- und der RPE-Schicht zu bringen. Unsere Methode ist ein einfaches und zuverlässiges Mittel, um Zellen erfolgreich in den subretinalen Raum zu bringen.

Sie benötigen die folgenden Reagenzien und Geräte: 1 % Tropicamid und 2,5 % Phenylephrin, frisch hergestellt aus 10 % Phenylephrin, durch Verdünnen in steriler 0,9 % Kochsalzlösung am Tag der Operation, werden verwendet, um die Pupille zu erweitern. Augenspülung wird verwendet, um das Auge zu spülen und das nicht operierte Auge feucht zu halten.

Ein Augengleitmittel wird verwendet, um das nicht operierte rechte Auge während der Operation feucht zu halten. 0,5% Proparacain wird als Lokalanästhetikum verwendet. Während der OCT-Untersuchung wird ein Augengleitmittel auf das operierte linke Auge aufgetragen.

Für diese Technik wird nur eine minimale Menge an Material und Ausrüstung benötigt. Detaillierte Informationen zu Geräten und Reagenzien, die bei dieser Technik verwendet werden, sind im Protokoll aufgeführt. Eine 10-Mikroliter-Spritze wird zur Injektion von Zellen verwendet.

Vor der Injektion montieren wir zunächst den Injektor und sterilisieren ihn mit Ethanol. Führen Sie eine sterile, abgeschrägte 33-Gauge-Nadel in die Spritze ein und schrauben Sie sie fest, um den Injektor zusammenzubauen. Spülen Sie den Injektor nacheinander fünf- bis sechsmal mit 100 % Ethanol, dann mit 70 % Ethanol und dann mit deionisiertem destilliertem Wasser.

Markieren Sie die Injektornadel mit einem sterilen schwarzen Markierungsstift in einer Position von 600 Mikrometern von der Nadelspitze entfernt. Setzen Sie den Injektor zur Injektion auf einen Mikromanipulator. Menschliche RPE-Zellen werden am Tag der Operation aufbereitet und in einer Eiswassermischung aufbewahrt.

Zerreiben Sie die Zellsuspension vorsichtig und beladen Sie den Injektor mit 1,2 Mikrolitern, die zusätzlichen 0,2 Mikroliter werden verwendet, um den Injektionsrückfluss zu kompensieren, um ein Volumen von einem Mikroliter Injektion zu gewährleisten. Tauschen Sie den mit der Zellsuspension gefüllten Injektor gegen den Mikromanipulator aus oder lassen Sie ihn von einem Assistenten vertikal halten, da RPE-Zellen dazu neigen, leicht in Lösungen zu sinken. Bereiten Sie das sterile Operationsfeld vor, indem Sie ein steriles OP-Pad mit einem darunter liegenden Heizkissen auf den Tisch des Präpariermikroskops legen.

Alle Verfahren, an denen Tiere beteiligt sind, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der State University of New York in Albany genehmigt. Wiegen Sie das Tier und betäuben Sie es mit dem Isofluran-Dampfabgabesystem, wie hier gezeigt. Bringen Sie die Ratte in den Operationsbereich, sobald sie anästhesiert ist, und platzieren Sie sie in einem Nasenkonus, der mit dem Isofluransystem verbunden ist, um die Narkose aufrechtzuerhalten.

Decken Sie den Körper der Ratte mit Gaze ab und kneifen Sie den Zeh der Ratte zusammen, um die Vollnarkose zu bestätigen. Tragen Sie einen Tropfen Augenschmiermittel auf das rechte Auge der Ratte auf und positionieren Sie die Ratte auf ihrer rechten Seite, wobei das linke Auge zur Injektion zur Decke, der Kopf zur rechten Hand des Chirurgen und der Rücken zum Chirurgen zeigt. Schneiden Sie alle Schnurrhaare ab, die das Auge bedecken.

Träufeln Sie eine kleine Menge Augenspülung für die Schläfenseite des linken Auges und sammeln Sie den Überschuss an der Nasenseite mit einem Baumwollapplikator, um das Auge zu spülen. Erweitern Sie die Pupille mit 1 % Tropicamid und 2,5 % Phenylephrin für eine optische Kohärenztomographie nach der Injektion oder OCT-Untersuchung, indem Sie jeweils einen Tropfen auftragen. Tragen Sie einen Tropfen Augenspülung auf, um das Auge feucht zu halten.

Tragen Sie einen Tropfen Proparacain auf das Auge auf und entfernen Sie den Überschuss mit einem Baumwollapplikator. Massieren Sie die Haut um das Auge herum sanft vier- bis sechsmal, um das Augenlid zu öffnen, so dass das Auge vorübergehend und leicht aus seiner Augenhöhle herausspringt, um einen einfachen Zugang zur Injektornadel zu ermöglichen. Greifen Sie mit Kräften die Bindehaut hinter dem Limbus und drehen Sie das Auge, um eine bessere Stelle für die Operation zu finden, ohne die Augenmuskulatur zu beschädigen.

Hebe die Bindehaut vorsichtig an, um ein Zelt zu bilden, und drehe das Auge nasal. Schneide dann mit einer Schere das Zeltdach ab, um eine kleine Öffnung in die Bindehaut zu machen und die Sklera freizulegen. Fassen Sie dann mit einer Pinzette den Rand der Bindehautöffnung neben dem Limbus und drehen Sie das Auge nasal, so dass die Pupillenachse in einem Winkel von etwa 30 Grad zum Boden steht.

Eine sterile, abgeschrägte 31-Gauge-Insulinnadel wird verwendet, um in den Sklerakernkomplex einzudringen, wobei eine Abschrägung nach oben zeigt und die Hälfte der Spitze oder etwa 500 Mikrometer in das Gewebe eingeführt wird, um ein Pilotloch für die Injektion zu schaffen. Ziehen Sie die Insulinnadel vorsichtig heraus, und es kann ein kleiner Bluterguss zu sehen sein. Bei Bedarf kann ein Augenspeer angelegt werden, um das Loch zu reinigen und die Blutung zu stoppen.

Führen Sie die mit RPE-Zellen beladene Injektornadel in einem Winkel von etwa 10 bis 15 Grad relativ zur lokalen Oberfläche der Sklera in das Pilotloch, um den subretinalen Raum zu erreichen, indem Sie die Nadel mit einer Länge von 500 Mikrometern vollständig in das Gewebe einführen und einen Abstand von 100 Mikrometern zwischen dem Punkt auf der Nadel, der vom Gewebe bedeckt ist, und dem Punkt des schwarzen Markers auf der Nadel lassen. Sagen Sie dem Assistenten, dass er den Kolben der Spritze drücken soll, um das entsprechende Zellvolumen zu injizieren. Halten Sie den Injektor nach der Injektion 25 bis 30 Sekunden lang an Ort und Stelle und ziehen Sie ihn dann langsam zurück.

Das Einspritzloch dichtet automatisch ab, und eine kleine Menge von etwa 0,2 Mikrolitern Rückfluss wird häufig beobachtet. Spülen Sie die Injektionsstelle dreimal mit steriler Augenspülung ab und fangen Sie den Überschuss mit einem Baumwollapplikator auf. Tragen Sie einen Tropfen Gleitmittel auf das operierte Auge auf und bringen Sie die Ratte zur OCT-Station, um die Position der transplantierten Zellen und die Größe der subretinalen Blase zu untersuchen.

Setzen Sie die Ratte wieder in den Aufgefangenen unter einer Wärmelampe, um ihre Körpertemperatur zu halten, sobald die OCT beendet ist. Beobachten Sie die Ratte, um sicherzustellen, dass sie aus der Narkose kommt, und überwachen Sie sie täglich auf Anzeichen von Beschwerden. Benachrichtigen Sie sofort den Tierarzt, wenn Bedenken bestehen.

Mit unserer Technik haben wir konsequent und erfolgreich humane RPE-Zellen in den subretinalen Raum gebracht. Unmittelbar nach der Transplantation führten wir eine OCT-Untersuchung durch, um die Injektionsstelle und die von den transplantierten Zellen erzeugte subretinale Blase zu beobachten. Dies dient als gutes Screening-Instrument, um die Qualität der Injektionen und den Grad der Netzhautschädigung oder Blutung zu beurteilen.

Helle Lichtreflexion um die Injektionsstelle und eine subretinale Blase, die mit der Zellsuspension gefüllt war, waren unter dem OCT-Scan zu sehen. Bei einer erfolgreichen Injektion sind keine Blutungen, kein Austritt von interokulärer Flüssigkeit oder eine Netzhautablösung um die Injektionsstelle oder den intravitrealen Raum zu beobachten, was das minimale Trauma zeigt, das durch die Injektion verursacht wird. Die operierten Rattenaugen wurden sieben Tage nach der Transplantation entkernt, fixiert und für die immunhistologische Analyse geschnitten.

Der humane Kernmarker, Hunu, und der RPE-Zellmarker, OTX2, wurden verwendet, um die transplantierten Zellen nachzuweisen. Eine positive Feststellung beider Marker zeigte, dass sich die transplantierten humanen RPE-Zellen im subretinalen Raum der Rattenaugen befanden. Diese transsklerale subretinale Injektionstechnik ist einfach und leicht zu erlernen.

Es verursacht weniger Operationstraumata und lässt die Netzhaut intakt, indem die Injektionsnadel durch die äußeren Schichten der Augenwand geführt wird, ohne die neurale Netzhaut zu beschädigen. Die quantifizierten Tropfen für die Pilotnadel und die Injektionsnadel im Gewebe und der während der Injektion verwendete Winkel ermöglichen eine zuverlässige Abgabe von Zellen in den subretinalen Raum mit viel höherer Genauigkeit und Erfolgsquote. Mit dieser Injektionsmethode haben wir konsistent und erfolgreich aus humanen RPE-Stammzellen gewonnene RPE-Zellen in den subretinalen Raum von RCS-Ratten gebracht.

Dieser Vorgang kann von jedem, der sich das Video ansieht, leicht wiederholt werden.