Name: Modifikation und Funktionalisierung der Guanidingruppe von Maßgeschneidert Precursors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Lernen Sie die Synthese alkylmodifizierter Guanidine für funktionalisierte Peptide. Diese Methode ist vollständig mit SPPS kompatibel und ermöglicht gezielte Therapien in der personalisierten Medizin.

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TGK erkennt die International Graduate School for Science and Engineering (IGGSE) der Technischen Universität München für ihre finanzielle Unterstützung. HK erkennt das Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) für ihre Unterstützung.

Hinweis: Alle Reagenzien und Lösungsmittel wurden von kommerziellen Lieferanten erhalten und ohne weitere Reinigung verwendet. Achtung: Bitte lesen Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Bitte verwenden Sie geeignete Schutzausrüstungen , wenn chemische Synthesen durchführen (zB Dunstabzugshaube, Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe). 1. Synthese des Precursors Guanidinylierung <ol><li> alkylierte Spezies <ol><li> methylierten Spezies <ol><li> Man löst 1,0 g N, N &#39;-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin (3,2 mmol, 1 eq.) Und 1,0 g Triphenylphosphin (PPh 3, 3,8 mmol, 1,2 eq.) In 10 ml trockenen Tetrahydrofuran (THF) in einer 50-ml-Rundkolben in einer inerten Atmosphäre ein Gummiseptum bei Raumtemperatur (RT) gemessen. Hinzufügen 194 &amp; mgr; l trockenem Methanol unter Verwendung einer Spritze (4,8 mmol, 1,5 eq.) Und Let es bei RT rühren. </li><li> Getrennt davon wurde eine Lösung mit 747 &amp; mgr; l von Diisopropylazodicarboxylat (DIAD, 3,8 mmol, 1,2 eq.) In 2 ml trockenem THF in einem kleinen Glasfläschchen vorzubereiten. Unter Rühren wurde die Lösung von DIAD in THF tropfenweise zu der Lösung von N, N &#39;-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin, PPh 3 und Methanol , um eine Spritze (über 15 min) verwendet. Lassen Sie die Lösung unter Rühren für 2 h bei RT. </li><li> Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt in 1 ml Dichlormethan (DCM) aufzulösen. Laden eine Flash-Säule (2,5 cm x 20 cm) mit 100 g Silica in 10% Ethylacetat (EtOAc) in einer Pentanlösung. Legen des gelösten Rohproduktes an der Säule und fügen Sie das Lösungsmittel unter Druck (1,5 bar). </li><li> Sammeln der Fraktionen (Lösungsmittelsystem: isokratisch 10% EtOAc in Pentan), um die gewünschte Verbindung identifizieren Fleck durch Dünnschichtchromatographie (TLC), und es sammeln (R f = 0,4, EtOAc / Pentan 1: 9, UV). Kombinieren, um das gewünschteFraktionen und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft am Rotationsverdampfer 0,85 g der Titelverbindung als gelbes, viskoses Öl (2,6 mmol, 81% Ausbeute) zu erhalten. Lagern Sie die Verbindung ergab bei RT für die weitere Verwendung. </li></ol></li><li> Hexylamin modifizierte Spezies <ol><li> Man löst 1,0 g N, N &#39;-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin (3,2 mmol, 1,0 Äq.), 0,9 g von Dde-6-Aminohexanol (3,8 mmol, 1,2 eq.) Und 1,0 g von PPh 3 (3,8 mmol, 1,2 eq.) in 10 ml trockenen THF in einer 50-ml - Rundkolben in Inertatmosphäre ein Gummiseptum bei RT verwendet wird . </li><li> Getrennt davon wurde eine Lösung mit 747 &amp; mgr; l von DIAD (3,8 mmol, 1,2 eq.) In 2 ml trockenem THF in einem kleinen Glasfläschchen vorzubereiten. Unter Rühren wird die Lösung von DIAD in THF tropfenweise zu der Lösung von N, N &#39;-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin, PPh 3 und Dde-6-Aminohexanol einer Spritze (über 15 min) unter Verwendung von . Lassen Sie die Lösung unter Rühren für 2 h bei RT. </li><li>Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer und nehmen die nach oben Rohprodukt in 1 ml DCM. Laden eine Flash-Säule (2,5 cm x 20 cm) mit 100 g Siliciumdioxid in einer Lösung von Pentan / EtOAc (2: 1). Übernehmen des gelösten Rohproduktes an der Säule und fügen Lösungsmittel unter Druck (1,5 bar). </li><li> Sammeln der Fraktionen (Lösungsmittelsystem: isokratische 2: 1 Pentan / EtOAc), um die gewünschten Fraktionen identifizieren mit TLC, und sammeln sie (R f = 0,66, 2: 1 Pentan / EtOAc, UV). Kombinieren der gewünschten Fraktionen und dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer 1,6 g der Titelverbindung als gelbes, viskoses Öl (2,8 mmol, 88% Ausbeute) zu erhalten. Lagern Sie die Verbindung ergab bei RT für die weitere Verwendung. </li></ol></li></ol></li><li> Acylierte Spezies (2 Reaktionsschritte) <ol><li> Man löst 1,4 g S -methylisothiuronium Hemisulfat (10 mmol, 1,0 eq.) Und 2,2 g Di (tert - butyl) dicarbonat (10 mmol, 1,0 eq.) In einem kräftig rührenzweiphasige Lösung von DCM / sat läuten. aq. NaHCO 3 und lassen Sie es für 24 h bei RT rühren. </li><li> Man trennt die Schichten im Scheidetrichter und extrahiert die wässrige Phase dreimal mit DCM. Vereinige die organischen Phasen, trockne sie mit Na 2 SO 4 und Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. Nehmen Sie das Rohprodukt bis in 1 ml Hexan. </li><li> Laden eine Flash-Säule (2,5 cm x 20 cm) mit 100 g Siliciumdioxid in einer Lösung von 4: 1 Hexan / EtOAc. Legen des gelösten Rohproduktes an der Säule. In Lösungsmitteln unter Druck. Identifizieren der gewünschten Fraktionen mit DC (Lösungsmittelsystem: 4: 1 isokratischen Hexan / EtOAc (UV - Detektion: 254 nm), und sammeln sie (R f = 0,30). </li><li> Kombinieren der gewünschten Fraktionen und dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer 1,1 g der Titelverbindung als gelbes, viskoses Öl (5,8 mmol, 58% Ausbeute) zu erhalten. Speichert das Reagenz, N - (tert - Butoxycarbonyl) - S -Methylisothiourea bei RT für die weitere Verwendung. </li><li> Man löst 250 mg N - (tert - Butoxycarbonyl) - S - methylisothioharnstoff (1,3 mmol, 1,0 eq.) In 10 ml trockenen N, N - Dimethylformamid (DMF) in einer 50-ml - Rundkolben in einer inerten Atmosphäre bei RT. Hinzufügen 440 &amp; mgr; l N, N-Diisopropylethylamin (DIPEA) (2,6 mmol, 2 Äqu.) Unter Verwendung einer Spritze. Unter Rühren wurde 245 &amp; mgr; l von Ac 2 O (5,2 mmol, 4,0 Äq.) Tropfenweise mit einer Spritze und läßt sie für 1 h bei RT rühren. </li><li> Hinzufügen eines Überschusses an Methanol (2 ml) zu der Mischung unter Verwendung einer Spritze und ließ es für 15 min bei RT rühren. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. Nehmen Sie das Rohprodukt bis in 1 ml DCM. </li><li> Laden eine Flash-Säule (2,5 cm x 20 cm) mit 60 g Siliciumdioxid in einer Lösung von 3: 1 Hexan / EtOAc 3: 1. Wenden Sie das gelöste Rohprodukt auf die Säule. Hinzufügen Lösungsmittel (3: 1 Hexan / EtOAc) und Druck (1,5 bar). Identifizieren der gewünschten Fraktionen mit DC (3: 1 Hexan / EtOAc, UV: 220 nm), und colLect sie (R f = 0,62). </li><li> Kombinieren der gewünschten Fraktionen und dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer 210 mg der Titelverbindung als weißer Feststoff (0,9 mmol, 70% Ausbeute) zu erhalten. Lagern Sie die Verbindung bei RT für die weitere Verwendung. </li></ol></li></ol> 2. Synthese von zyklischen Peptids Precursors <ol><li> Laden und TCP - Harz Capping <ol><li> 1.00 g 2-chlortriyl Chlorid (CTC) Harz (0,9 mmol / g) und 320 mg Fmoc-Gly-OH (1,2 Äq.) In eine 20 ml-Kunststoffspritze mit einer Fritte. Es wird eine Lösung von 313 &amp; mgr; l DIPEA (2 Äqu.) In 5 ml trockenem DCM und füge sie die Spritze. Lassen Sie es für 1 h bei RT drehen, um eine Dreheinheit. </li><li> Indessen bereitet eine 2-ml-Lösung von 5: 1 Methanol / DIPEA (v / v; Capping-Lösung). Fügen Sie die Capping-Lösung mit der Spritze und lassen Sie es für weitere 15 min drehen. Waschen des Harzes mit DCM (5 ×) und DMF (3x). </li></ol></li><li> On-Harz Fmoc - Entschützung<ol><li> Behandle den harzgebundene Fmoc-Gly mit 20% Piperidin in DMF für 10 min und dann für 5 min. Waschen des Harzes mit DMF (3x). </li></ol></li><li> On-Harz Kopplung von Fmoc-Orn (Dde) -OH <ol><li> Hinzufügen 934 mg Fmoc-L-Orn (Dde) -OH (2 eq.), 684 mg 1- [Bis (dimethylamino) methylen] -1 H -1,2,3-triazolo [4,5-b] Pyridinium-3-oxid-hexafluorphosphat (HATU) (2 Äq.) und 245 mg 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt) (2 Äq.) in ein kleines Glasfläschchen und löse es in 5 ml DMF. In 814 ul DIPEA. </li><li> Fügen Sie diese Lösung auf den Fmoc-Schutzgruppe entfernt, gewaschen und harzgebundenen Gly und lassen Sie es für 1 h drehen. Waschen des Harzes mit DMF (3x). </li></ol></li><li> On-Harz Fmoc - Entschützung <ol><li> Behandle den harzgebundene Fmoc-Orn (Dde) -Gly mit 20% Piperidin in DMF für 10 min und dann für 5 min. Waschen des Harzes mit DMF (3x). </li></ol></li><li> On-Harz Kopplung von Fmoc-Val-OH <ol><li> Hinzufügen 610 mg Fmoc-Val-OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) Und 245 mg HOAt (2 eq.) In ein kleines Glasfläschchen und löse es in 5 ml DMF. In 814 ul DIPEA. </li><li> Füge diese Lösung auf die Fmoc-Schutzgruppe entfernt, gewaschen, und harzgebundene Orn (Dde) -Gly und ließ sie für 1 h rotieren. </li></ol></li><li> On-Harz Fmoc - Entschützung <ol><li> Behandle den harzgebundene Fmoc-Val-Orn (Dde) -Gly mit 20% Piperidin in DMF für 10 min und dann für 5 min. Waschen des Harzes mit DMF (3x). </li></ol></li><li> On-Harz N- Methylierungs <ol><li> Waschen des Harzes mit DCM (3x). Man löst 887 mg 2-Nitrobenzolsulfonylchlorid (o -NBS-Cl, 4 eq.) In DCM und fügen Sie 1,2 ml 2,4,6-Collidin (10 eq.). </li><li> Fügen Sie die Lösung für das harzgebundene Peptid und lassen Sie es 20 Minuten lang bei RT inkubiert. </li><li> Das Harz wird mit CH 2 Cl 2 (3x) und mit THF (5 ×). Es wird eine Lösung mit 1,18 g PPh 3 (5 Äq.) Und 365 &amp; mgr; l Methanol in THF. Diese Lösung wird auf dieSpritze. </li><li> Es wird eine Lösung mit 883 &amp; mgr; l von DIAD in 2 ml THF und fügen sie die Spritze. Lassen Sie es für 15 min inkubiert. Das Harz wird mit THF (5x) und mit DMF (5 x). </li></ol></li><li> o -ns Entschützung <ol><li> Es wird eine Lösung mit 570 &amp; mgr; l Mercaptoethanol (10,0 Äq.) Und 672 &amp; mgr; l Diazabicycloundecen (DBU) in 2 ml DMF. Fügen Sie diese Lösung in die Spritze und lassen Sie es für 5 min inkubiert. </li><li> Wiederholen Sie die Entschützungsschritt und dann Waschen des Harzes mit DMF (5 x). </li></ol></li><li> On-Harz Kopplung von Fmoc - D-Phe-OH <ol><li> Hinzufügen 697 mg Fmoc-D-Phe-OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) Und 245 mg HOAt (2 eq.) In ein kleines Glasfläschchen und löse es in 5 ml DMF . In 814 ul DIPEA. </li><li> Füge diese Lösung auf die Fmoc-Schutzgruppe entfernt, gewaschen und harzgebundene Peptid und ließ sie für 1 h rotieren. </li></ol></li><li> On-Harz Fmoc - Entschützung <ol><li> Behandle das Harz-bound Peptid mit 20% Piperidin in DMF für 10 min und dann für 5 min. Waschen des Harzes mit DMF (3x). </li></ol></li><li> On-Harz Kopplung von Fmoc-Asp (Ot Bu) -OH <ol><li> Hinzufügen von 741 mg Fmoc - Asp (Ot Bu) -OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) Und 245 mg HOAt (2 eq.) In ein kleines Glasfläschchen und löse es in 5 mL DMF. In 814 ul DIPEA. </li><li> Füge diese Lösung auf die Fmoc-Schutzgruppe entfernt, gewaschen und harzgebundene Peptid und ließ sie für 1 h rotieren. </li></ol></li><li> Die Abspaltung des linearen Peptids von dem Harz <ol><li> Waschen des Harzes mit DCM (3x) und anschließend Herstellung von 10 ml einer Lösung von Hexafluorisopropanol (HFIP) in DCM (1: 4; v / v). </li><li> Fügen Sie die Lösung zu dem Harz und lassen Sie es für 15 min drehen. Sammeln Sie die Lösung in einem Rundkolben. Wiederholen der Spalt- und verdampfe das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer. </li></ol></li><li> Cyclisierung des linearen Peptids <ol><li> dissolve 384 mg NaHCO 3 (5,0 Äq.) und 582 &amp; mgr; l von Diphenylphosphorylazid (DPPA) (3,0 eq.) in 50 ml DMF und fügen Sie das Rohprodukt. Ließ es über Nacht rühren oder bis sich kein lineares Peptid mit ESI-MS (10 h) 17 beobachtet. </li><li> Unter vermindertem Druck, reduzieren das Lösungsmittel zu einem kleinen Volumen mit einem Rotationsverdampfer. Bereiten eine gesättigte wässrige Lösung von NaCl (Salzlösung). Unter Verwendung einer Pasteur-Pipette, fügen Sie das cyclisierte Peptid tropfenweise zu 40 ml einer gesättigten wässrigen NaCl-Lösung in ein Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugierte die Suspension (5.000 xg, 5 min) und wäscht den Niederschlag mit HPLC-Wasser (2x). Lyophilisieren das Produkt. </li></ol></li></ol> 3. Guanidinylierung und Entschützung in Lösung <ol><li> Guanidinylierung mit den maßgeschneiderten Vorläufern <ol><li> Man löst eine kleine Menge (beispielsweise 25 mg) des orthogonal entschützt zyklischen Peptid in einem kleinen Volumen DMF (zB 2 mL). In 2 eq. des Guanidinylierung Vorläufers und 2 eq. DIPEA zu der Lösung und lassen Sie es für 2 h bei RT rühren. </li><li> Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion mit HPLC-MS. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen das Lösungsmittel, wieder aufzulösen das guanidinylated zyklische Peptid in Acetonitril und semipräparative HPLC - Reinigung 16 durchzuführen. </li></ol></li><li> Die Entfernung der säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen <ol><li> Bereiten 2 ml einer Lösung, die Trifluoressigsäure (TFA), Wasser und Triisopropylsilan (TIPS) (95 / 2,5 / 2,5; v / v / v). Fügen Sie diese Lösung für das gereinigte Produkt in einem kleinen Glasfläschchen und lassen Sie es für mindestens 1 h bei RT rühren. Beachten Sie die vollständige Entfernung der Schutzgruppe mit ESI-MS 17. </li><li> Dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen. Bereiten eiskaltem Ether und gibt 10 ml in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Auszufällen, das entschützte Peptid in eiskaltem Ether mit einer Pasteurpipette durch Zugabe vontropft. Zentrifugierte die Suspension (5.000 xg, 5 min) um ein Pellet zu erhalten. </li><li> Wäscht den Niederschlag mit eiskaltem Ether und zentrifugiert es (5000 xg, 5 min, 2 x). Man löst das Produkt in 2 ml HPLC-Wasser reinigen und es mit semipräparative HPLC 16. </li></ol></li></ol> 4. Analytische Daten und Parameter für die Reinigung <ol><li> Analytische HPLC-ESI-MS <ol><li> Führen analytischen HPLC-ESI-MS mit einem LCQ-Massenspektrometers unter Verwendung einer C18-Säule (12 nm Porengröße, 3 &amp; mgr; m Teilchengrße, 125 mm × 2,1 mm), oder eine C8-Säule (20 nm Porengröße, 5 um Partikel Größe, 250 mm × 2,1 mm), mit H 2 O (0,1% v / v Ameisensäure) / Acetonitril (0,1% v / v Ameisensäure) als Eluenten. </li></ol></li><li> Semi-präparative HPLC <ol><li> Führen semipräparative HPLC ein präparativen HPLC-Instrument mit einer ODS-A-Säule (20 x 250 mm, 5 &amp; mgr; m), eine Fließgeschwindigkeit von 8 ml / min, und den linearen VerläufenH 2 O (0,1% v / v TFA) und Acetonitril (0,1% v / v TFA). </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der Vorläufer für Guanidinylierung ist ein orthogonal entschützt zyklische Peptid - Derivat, (c (OrnD (Ot Bu) Gf (N Me) V)), die durch ein Standard - Fmoc - Protokoll von Festphasen - Peptidsynthese (SPPS) synthetisiert wird. Ornithin wurde als orthogonal geschützten Derivat (Fmoc-Orn (Dde) -OH) verwendet, die mit Hydrazin in DMF nach der Cyclisierung des Peptidgerüstes entschützt werden können. Der Peptid-Vorläufer wird durch die Fällung der Verbindung und durch die anschließende Gefriertrock...

Zu den am häufigsten vorkommenden pharmakophorer Gruppen in natürlichen Liganden ist die Guanidingruppe, die in mehreren Interaktionen beteiligt ist 1, 2. Beispielsweise dient er als ein potenzieller vierfachen Wasserstoff-Donator in Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen und wird in der elektrostatischen Wechselwirkungen, wie Salzbrücken oder Kationen-π-Wechselwirkungen beteiligt. In der medizinischen Chemie ist diese Gruppe oft mit Drogen und Medikamenten - Kandidaten 4, gefunden , obwohl sehr oft als Guanidin - Mimetika 5, 6. Der Grund für die Entwicklung von Guanidin-Mimetika ist die Entfernung von der allgegenwärtigen, positiv geladenen Guanidingruppe, sowie die Einstellung der Lipophilie des Liganden. In peptidische Liganden, ist der einzige Guanidingruppe haltige Aminosäure Arginin, die in der bioaktive Region peptidische Liganden gefunden wird daher häufig. Ein sehr prominent Beispiel für eine argininhaltigen Ligandenfamilie ist die Unterfamilie der RGD-bindend Integrinen. Im Allgemeinen sind die Integrine eine Klasse von Zelladhäsionsrezeptoren, die in allen höheren Organismen über wichtige Funktionen übernehmen. Einige dieser Funktionen beinhalten die Zelladhäsion, Migration und das Überleben der Zelle. So werden sie auch in pathologischen Indikationen, wie Krebs und Fibrose beteiligt. Integrine sind heterodimere Transmembran-Proteine, die aus einer α- und einer β-Untereinheit, die 24 derzeit bekannten Integrin-Subtypen bilden; 8 von ihnen die Tripeptidsequenz Arg-Gly-Asp (RGD =) in ihren Liganden 7 erkennen. Die Bindungsregion an der Grenzfläche zwischen diesen beiden Subtypen in dem extrazellulären Teil befindet, die sogenannte Integrin - Kopfgruppe 8. die metallionenabhängige Adhäsionsseite (MIDAS) Region, die in der Beta-Untereinheit befindet und bindet die Carbonsäure in den Liganden (Seiten cha: RGD wird durch zwei gemeinsame Wechselwirkungen anerkanntin der Asp); und die Guanidingruppe in den Liganden, die in der alpha-Untereinheit befindet. Die meisten der Integrin - Untertypen sind promiskuitiv und zumindest einen Teil ihrer natürlichen extrazellulären Matrix (ECM) -Liganden 9 teilen. So ist für die Entwicklung von künstlichen Integrin-Liganden, der Schwerpunkt ist neben einer hohen Bindungsaffinität, die Selektivität Subtyp. Vor kurzem konnten wir ein Schlüsselelement für die Erzeugung von Subtyp selektiven Liganden enthüllen: die Guanidingruppe. Durch unterschiedliche Modifikationen können biselective Liganden für die αv- und α5-enthaltende Integrin - Subtypen in selektive Verbindungen , die durch einfache Modifikationen an der Guanidingruppe gedreht werden, der dann die verschiedene α-Untereinheiten 10 unterscheiden kann. In der Tasche der &amp; alpha; v interagiert die Guanidingruppe side-on über einen zweizähnigen Salzbrücke mit Asp218 11, 12. Diese Wechselwirkung cein auch in α5β1 beobachtet werden (hier mit Asp227 in α5), sondern zusätzlich ein End-Wechselwirkung der Guanidingruppe mit einem Gln - Rest (Gln221) wird 13 beobachtet. Somit modifizierten wir die Guanidingruppe in zwei entgegengesetzter Weise: in einem Fall durch die Seite-an blockierenden Zusammenwirken mit der Methylierung des N δ der Guanidingruppe, und im anderen Fall mit der Methylierung des Guanidin - N ω, Blockierung der End-on - Interaktion. Überraschenderweise führte diese kleine Änderung zu einer vollständigen Selektivität Verschiebung der Liganden. Neben der Alkylierung wurde eine neue Methode Funktionalisierung in dieser Publikation vorgestellt. Die klassische Funktionalisierung Verfahren für diese Art von pentapeptidic Ligand ist durch die Seitenketten - Konjugation einer Aminosäure nicht in 14 - Bindung (zB K in c (RGDfK)) beteiligt sind , 15. Hier,wir zeigen, dass die Funktionalisierung durch Modifizierung des Guanidin auch möglich ist - mit einem Acyl- oder alkylierte Linker - die für die Bindung von entscheidender Bedeutung ist. Die positive Ladung , die essentiell für die Bindung ist , beibehalten wird , und Modelle legen nahe , dass die langkettigen Punkte aus der Bindungstasche und somit eine ideale Möglichkeit für die Befestigung von weiteren Linkern Bereitstellung und Markierungseinheiten (zB einer Fluoreszenzmarkierung oder ein Chelator für molekulare imaging). In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf den Herstellungsschritten für die Modifikation der Guanidingruppe in Arginin-enthaltenden Liganden. Dies beinhaltet die Synthese von N ω -methylated Spezies sowie Guanidine mit längeren Linker - Einheiten. Die verschiedenen Modifikationen umfassen Acyl- und Alkylgruppen.

<table><tbody><tr><td>N,N&prime; -Di-Boc-1H-pyrazol-1-carboxamidin, 98%&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>434167&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Triphenylphosphin, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T84409&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran, >99,5</td>%<td>Carl Roth</td><td>4745</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran wasserfrei, 99,8</td>%<td>Carl Roth</td><td>5182</td><td></td></tr><tr><td>Methanol wasserfrei, 99,8%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>322415&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Diisopropylazodicarboxylat, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>225541&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan, für die Synthese, 99,5</td>%<td>Carl Roth</td><td>8424</td><td></td></tr><tr><td>Kieselgel für die Flash-Chromtaographie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60738&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>n-Pentan, 99%</td><td>Carl Roth</td><td>8720</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexan, 99%</td><td>Carl Roth</td><td>CP47</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetat, 99,5</td>%<td>Carl Roth</td><td>7338</td><td></td></tr><tr><td>Aminohexanol, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A56353&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><<tr><td>em>S-Methylisothioharnstoff-Hemisulfat, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M84445 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Di-tert-Butyldicarbonat, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>205249&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><<tr><td>em>N,N-Dimethylformamid, 99,8 %</td><td>Carl Roth</td><td>A529</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamin, 99,5 %</td><td>Carl Roth</td><td>2474</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureanhydrid, 99 %</td><td>Carl Roth</td><td>4483</td><td></td></tr><tr><td>Chlortratylharz</td><td>Carbolution</td><td>CC11006</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gly-OH, 98 %</td> <td>Carbolution</td><td></td><td></td>CC05014</tr><tr><td>Piperidin, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>104094&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Orn(Dde)-OH</td><td>Iris-Biotech</td><td>FAA1502</td><td></td></tr><tr><td>HATU, 99%</td><td>Karbolution</td><td>CC01011</td><td></td></tr><tr><td>HOAt, 99%</td><td>Karbolution</td><td>CC01004</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>Karbolution</td><td>CC05028</td><td></td></tr><tr><td>2-Nitrobenzolsulfonylchlorid, 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N11507&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>2,4,6-Collidine, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27690&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Mercaptoethanol, 99%&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Diazabicycloundecen, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>139009&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-D-Phe-OH, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47378&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98%</td><td>Karbolution</td><td>CC05008</td><td></td></tr><tr><td>Hexafluorisopropanol-Karbolution</td><td></td><td>CC03056</td><td></td></tr><tr><td>Diphenylphosphorylazid, 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>178756&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>TFA, 99,9%</td><td>Carl Roth</td><td>P088</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilan, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril, HPLC-Qualität</td><td>Carl Roth</td><td>HN44</td><td></td></tr></tbody></table>

modifikation und funktionalisierung der guanidingruppe von maßgeschneidert precursors

Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors

Die Guanidingruppe ist eine der wichtigsten pharmakophorer Gruppen in der medizinischen Chemie. Die einzige Aminosäure, die eine Guanidingruppe tragende ist Arginin. In diesem Artikel ist eine einfache Methode zur Modifikation der Guanidingruppe in peptidische Liganden zur Verfügung gestellt, mit einem Beispiel für RGD-bindende Integrin-Liganden. Es wurde vor kurzem gezeigt , dass die unterschiedliche Modifikation der Guanidingruppe in diesen Liganden für die selektive Modulation des Subtyps ermöglicht (beispielsweise zwischen den Subtypen &amp; agr; v und α5). Darüber hinaus wurde eine bisher unbekannte Strategie für die Funktionalisierung über die Guanidingruppe demonstriert und der Syntheseansatz wird in diesem Dokument überprüft. Die Modifikationen betreffen hier beschriebenen endständig (N ω) alkyliert und Guanidin - Gruppen acetyliert. Für die Synthese, maßgeschneiderte Vorläufermoleküle synthetisieren, die dann zu einer Reaktion mit einem orthogonal ungeschützten Amin unterzogen werden, um die pre zu übertragen-modifizierte Guanidingruppe. Für die Synthese von alkylierten Guanidinen, basierten auf Vorläufer N, N &#39;-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin wird verwendet acylierten Verbindungen zu synthetisieren, die Vorläufer der Wahl ein entsprechend acylierten Derivates von N - Boc - S ist - methylisothioharnstoff, die in ein- und zweistufigen Reaktionen erhalten werden können.

Der cyclische Peptidvorläufer wurde als ein lineares Peptid synthetisiert, cyclisiert und orthogonal Dde-Schutzgruppe entfernt. Nach der Fällung wurde die Reinheit der Verbindung mit HPLC-MS (Figur 1) analysiert. Um den Fortschritt der Reaktion zu überwachen, wurde eine HPLC - Analyse durchgeführt , nachdem die 2-h Reaktionszeit (Abbildung 2). Für größere Rückstände auf der Guanidingruppe, ist...

Ein Protokoll für die Synthese von alkylmodifizierte Guanidine, basierend auf der Verwendung der entsprechenden Vorstufen dargestellt.

Modifikation und Funktionalisierung der Guanidingruppe von Maßgeschneidert Precursors

The guanidine group is one of the most important pharmacophoric groups in medicinal chemistry. The only amino acid carrying a guanidine group is arginine. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen bequemen synthetischen Zugang zu Guanidin-funktionalisierten Peptiden zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Muskelpeptidchemie zu beantworten, wie z.B. die Entwicklung von Integrin-Liganden oder GPCR-Liganden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen einfachen, synthetischen Zugang zu funktionalisierten Guanidinen ermöglicht, die vollständig mit SPPS kompatibel sind.Die Technologie wird besonders wertvoll für taktile Moleküle sein, da die funktionellen Gruppen, die modifiziert werden, in der Regel sich verschlechternde Biomoleküle sind. In unserem Fall zielen wir auf Moleküle ab, die für die molekulare Bildgebung unterschiedlicher Eigenschaften einzelner Krebsarten und für deren spezifische Behandlung verwendet werden können; Ein wichtiges Thema für die personalisierte Medizin. Um dieses spezielle Verfahren zu beginnen, geben Sie ein Gramm Boc-Pyrazol-Carboxamaidin und ein Gramm PPh3 in einen 50-Milliliter-Rundkolben.Anschließend werden 10 Milliliter getrocknetes THF in einen 50-Milliliter-Rundkolben in einer inerten Atmosphäre über ein Gummiseptum gegeben. Mit einer Spritze 194 Mikroliter trockenes Methanol hinzufügen. Rühren Sie die Lösung bei Raumtemperatur um.Geben Sie mit einer Spritze eine vorbereitete Lösung von Diisopropylazodicarboxylat in THF tropfenweise über einen Zeitraum von 15 Minuten hinzu. Lassen Sie die Lösung dann zwei Stunden lang bei Raumtemperatur rühren. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck.Danach lösen Sie das Rohprodukt in einem Milliliter DCM auf. Lassen Sie dann eine Flash-Säule mit 100 Gramm Siliziumdioxid in 10% Ethylacetat in einer Pentanlösung geben. Laden Sie das gelöste Rohprodukt auf die Säule und fügen Sie das Lösungsmittel unter Druck hinzu.Sammeln, identifizieren und kombinieren Sie die Brüche, wie im Textprotokoll beschrieben. Anschließend wird das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck verdampft, um die gewünschte Verbindung als gelbes, viskoses Öl zu erhalten. Zuerst geben Sie ein Gramm Boc-Pyrazolcarboxamidin, ein Gramm PPH3 und 0,9 g Dde-6-Aminohexanol in einen 50-Milliliter-Rundkolben.Geben Sie dann 10 Milliliter trockenes THF in einer inerten Atmosphäre mit einem Gummiseptum hinzu. Anschließend lösen Sie die Ausgangsstoffe bei Raumtemperatur auf. Geben Sie mit einer Spritze eine vorbereitete Lösung von Diisopropylazodicarboxylat in THF tropfenweise über einen Zeitraum von 15 Minuten hinzu.Rühren Sie die Lösung zwei Stunden lang bei Raumtemperatur um. Verwenden Sie danach einen Rotationsverdampfer, um das Lösungsmittel unter reduziertem Druck zu entfernen. Das Rohprodukt wird in 1 Milliliter DCM gelöst.Laden Sie anschließend eine Flash-Säule mit 100 Gramm Siliziumdioxid in einer Zwei-zu-Eins-Lösung aus Pentan und Ethylacetat. Laden Sie das gelöste Rohprodukt auf die Säule und fügen Sie das Lösungsmittel unter Druck hinzu. Sammeln, identifizieren und kombinieren Sie die Brüche, wie im Textprotokoll beschrieben.Verdampfen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck, um das gewünschte Produkt zu erhalten. Lösen Sie zunächst 1,4 g S-Methylisothioharnstoff und 2,2 g boc-anhydrid in einer zweiphasigen Lösung aus DCM und gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat kräftig um. Lassen Sie die Mischung 24 Stunden bei Raumtemperatur rühren.Gießen Sie danach die Mischung in einen Scheidetrichter. Trennen Sie die Schichten und extrahieren Sie die wässrige Phase dreimal mit DCM. Kombinieren Sie dann die organischen Phasen.Trocknen Sie die kombinierten organischen Phasen mit Natriumsulfat. Nachdem Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer entfernt haben, lösen Sie das Rohprodukt in 2 Millilitern Hexan auf. Laden Sie eine Flash-Säule mit 100 g Siliziumdioxid in einer Vier-zu-Eins-Lösung aus Hexan und Ethylacetat.Danach wird das gelöste Rohprodukt auf die Säule geladen und das Lösungsmittel unter Druck hinzugefügt. Nachdem Sie die Fraktionen gesammelt und identifiziert haben, kombinieren Sie die gewünschten Fraktionen. Verdampfen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck, um 1,1 g Boc-S-Methylisothioharnstoff zu erhalten.250 mg des gesammelten Boc-S-Methylisothioharnstoffs werden in 10 Millilitern getrocknetem DMF in einem 50-Milliliter-Rundkolben in einer inerten Atmosphäre bei Raumtemperatur gelöst. Verwenden Sie eine Spritze, um 440 Mikroliter DIPEA hinzuzufügen. Mit einer Spritze 245 Mikroliter Essigsäureanhydrid tropfenweise unter Rühren zugeben.Lassen Sie die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur rühren. Verwenden Sie dann eine Spritze, um zwei Milliliter Methanol hinzuzufügen und rühren Sie 15 Minuten lang. Nachdem das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer entfernt wurde, lösen Sie das Rohprodukt in einem Milliliter DCM auf.Laden Sie eine Flash-Säule mit 60 g Siliciumdioxid in einer Drei-zu-Eins-Lösung aus Hexan und Ethylacetat. Laden Sie anschließend das gelöste Rohprodukt und fügen Sie das Lösungsmittel unter Druck hinzu. Sammeln, identifizieren und kombinieren Sie die Brüche, wie im Textprotokoll beschrieben.Verdampfen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck, um 210 Milligramm des gewünschten Produkts als weißen Feststoff zu erhalten. Lösen Sie zunächst eine kleine Menge des orthogonal entgeschützten zyklischen Peptids in einer kleinen Menge DMF auf. Fügen Sie zwei Äquivalente von DIPEA hinzu.Und zwei Äquivalente des Guanidinylierungsvorläufers. Lassen Sie die Lösung dann zwei Stunden lang bei Raumtemperatur rühren. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie das Lösungsmittel.Löse das guanidinylierte cyclische Peptid wieder in Acetylnitril auf und führe eine semi-präparative HPLC-Reinigung durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach wird in einem kleinen Glas eine vorbereitete Lösung aus Trifluoressigsäure, Wasser und Triisopropylsilan zu dem gereinigten Produkt gegeben. Rühren Sie diese Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur und beobachten Sie dann die vollständige Entschützung mit ESIMS.Geben Sie 10 Milliliter eiskalten Äther in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie mit einer Pasteur-Pipette das entschützte Peptid tropfenweise in den Äther. Die Suspension wird fünf Minuten lang bei 5.000 g zentrifugiert.Waschen Sie das Pellet danach mit eiskaltem Äther. In der Zentrifuge bei 5.000 mal g für fünf Minuten. Wiederholen Sie dieses Waschen und Zentrifugieren noch einmal.Lösen Sie dann das Produkt in 2 Millilitern Wasser in HBLC-Qualität auf und reinigen Sie das Produkt mit semi-präparativer HPLC, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Arbeit wird eine einfache Methode zur Modifikation der Guanidingruppe in peptidischen Glyginen vorgestellt. Der Verlauf der Reaktionen wird mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeitschromatographie überwacht.Bei größeren Rückständen auf der Guanidingruppe reichen zwei Stunden oft nicht aus, um die Reaktion abzuschließen. So wird die Reaktion fortgesetzt und die Verbindungen werden durch semi-präparative HPLC gereinigt. Eine kleine Menge wird dann mit DMSO verdünnt, um eine Stammlösung für die biologische Bewertung in einem al-ee-soo-ähnlichen Festphasenbindungsassay zu erhalten.Alle analysierten Verbindungen zeigen eine relativ hohe Affinität des Integranten-Subtyps alpha v beta drei und eine hohe Selektivität gegenüber dem Integranten-Subtyp alpha fünf beta eins. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir auf der Suche nach einer Standardmethode für die Guanidinylierung während der SPPS waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie maßgeschneiderte Guanidinylierungsvorläufer herstellen, um die Guanidingruppe Ihres Zielpeptids zu modifizieren oder zu funktionalisieren.

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