Mikrowellen-unterstützte Funktionalisierung von Poly (Ethylenglycol) und On-Harz Peptide zur Verwendung in Kettenpolymerisationen und Hydrogelierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Funktionalisierung von Polyethylenglykol und Peptiden mit Methacrylatgruppen für nachfolgende Kettenpolymerisationen und die Hydrogelsynthese. Dies wird erreicht, indem zunächst Methacrylanhydrid und der UN-funktionalisierte Vorläufer in einem Szintillationsfläschchen kombiniert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Mikrowellenenergie zu verwenden, um das peg oder peptid zu funktionalisieren.

Als nächstes wird das PEG DM in Chlormethan gelöst, oder das Peptid wird vom Harz abgespalten. Und alle Seitenkettenschutzgruppen werden in einem säurebasierten Cocktail entfernt. Der letzte Schritt besteht darin, das PEG DM oder das Methacrylamid-funktionalisierte Peptid in Ether auszufällen.

Letztendlich wird die Protonen-NMR oder Maldi-Flugzeit-Massenspektrometrie verwendet, um eine erfolgreiche Funktionalisierung des peg- oder Peptidmakros zu zeigen. Hallo, mein Name ist Amy Van Hove. Ich bin Doktorandin in der Abteilung für Biomedizinische Technik an der University of Rochester.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Reaktion von PEG mit Methacrylfluorid besteht darin, dass die Reaktion deutlich schneller und umweltfreundlicher ist. Hallo, mein Name ist Brandon Wilson. Ich studiere Chemieingenieurwesen an der University of Rochester.

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Biomaterialien zu beantworten, z. B. wie Hydrogele, die mit PEG Dimethyl hergestellt werden, eingesetzt werden können, um die Verabreichung therapeutischer Zellen in Molekülen zu steuern. Hallo, ich bin Danielle Benoit, Assistenzprofessorin am Department of Biomedical Engineering an der University of Rochester. Diese Technik hat Auswirkungen auf die Entwicklung von Therapien für eine Vielzahl von Krankheiten, da die synthetisierten Verbindungen für Zell- und Arzneimittelverabreichungsanwendungen verwendet werden können.

Vor Beginn dieses Verfahrens trocknete pred die benötigten Gläser eine Stunde lang in einem Ofen, um eine Kontamination mit Wasser in einem großen Molkeschiffchen zu verhindern. Kommen Sie aus fünf Gramm Peg mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 100.000 Dalton. Falls vorhanden, entfernen Sie das Kunststoffstück vom Deckel eines Szintillationsfläschchens in der Chemikalienhaube.

Geben Sie 10 molare Überschüsse Methacrylanhydrid in ein zerrissenes Szintillationsfläschchen. Geben Sie dann PEG in die Durchstechflasche. Drehen Sie dann die Kappe locker auf das Fläschchen und stellen Sie das Fläschchen in die Mikrowelle.

Stellen Sie die Mikrowelle auf fünf Minuten auf maximale Leistung ein und tragen Sie hitzebeständige Handschuhe. Nehmen Sie die Durchstechflasche alle 30 Sekunden aus der Mikrowelle. Ziehen Sie dann die Kappe vollständig fest und wirbeln Sie die Probe 30 Sekunden lang ein.

Lösen Sie die Kappe, bevor Sie das Fläschchen wieder in die Mikrowelle stellen. Wiederholen Sie diese Schritte, bis die Lösung die vollen fünf Minuten in der Mikrowelle erhitzt wurde. Nachdem Sie das Fläschchen aus der Mikrowelle genommen haben, lösen Sie die Kappe und lassen Sie das PEG DM auf Raumtemperatur abkühlen.

Lösen Sie dann das PEG DM in 10 bis 15 Millilitern Dichlormethan auf. Fältitieren Sie das PEG DM in 10 x Überschuss an Prädathylether für 20 Minuten. Mit einem sieben Zentimeter großen Buckner-Trichter und einem 500-Milliliter-Kolben.

Sammeln Sie das PEG DM durch Vakuumfiltration. Übertragen Sie anschließend das gefilterte PEG DM in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, wobei eine große Nadel zur Belüftung durch die Kappe gestochen wird. Legen Sie das Röhrchen in eine Vakuumkammer und trocknen Sie das PEG DM über Nacht.

Nach der Entnahme des Rohres aus der Vakuumkammer das PEG DM in DI-Chlormethanfällung mit eiskaltem Dathylether rot auflösen. Um das nicht reaktive Meth-Acrylanhydrid nach der Filtration und Sammlung zu entfernen, trocknen Sie das PEG DM in einer Vakuumkammer auf die gleiche Weise wie zuvor. Für die Protonen-NMR-Analyse geben Sie etwa 10 Milligramm PEG TM in ein Szintillationsfläschchen und fügen Sie etwa einen Milliliter deuteriertes Chloroform hinzu.

Sobald die Probe aufgelöst ist, überführen Sie sie in ein sauberes NMR-Röhrchen. Sammeln Sie als Nächstes die Protonen-NMR-Spektren und lassen Sie die Proben mindestens 64 Scans lang bei Raumtemperatur laufen, um eine ausreichende Datenauflösung zu erhalten. Nach der Synthese des interessierenden Peptids durch Festphasensynthese lagern Sie es auf dem Harz in DMF bei vier Grad Celsius, bis es zur Verwendung bereit ist.

Anschließend wird das Peptidharz durch Filtration mit einem sieben Zentimeter großen Buckner-Trichter mit Filterpapier und einem 250-Milliliter-Kolben aufgefangen. Entfernen Sie das Kunststoffstück vom Deckel eines Szintillationsfläschchens und übertragen Sie das Harz auf das Fläschchen. Fügen Sie mit einer Einwegpipette gerade so viel Meth-Acrylanhydrid hinzu, dass das Harz bedeckt ist. Nachdem Sie die Kappe locker auf das Fläschchen gedreht haben, stellen Sie es in die Mikrowelle und stellen Sie den Timer auf drei Minuten.

Nehmen Sie das Fläschchen bei maximaler Leistung mit hitzebeständigen Handschuhen alle 15 bis 20 Sekunden aus der Mikrowelle. Nachdem Sie die Kappe vollständig festgezogen haben, wirbeln Sie die Probe 15 Sekunden lang ein. Lösen Sie die Kappe, bevor Sie das Fläschchen wieder in die Mikrowelle stellen.

Wiederholen Sie diese, bis die Lösung die vollen drei Minuten in der Mikrowelle erhitzt wurde. Lassen Sie die Peptidlösung mit einer kleinen Menge DMF und einem sieben Zentimeter großen Buckner-Trichter auf Raumtemperatur abkühlen, wenn der Deckel des Fläschchens gelöst ist. Mit Filterpapier und einem 250-Milliliter-Kolben.

Sammeln Sie das Peptidharz aus dem Fläschchen für die Spaltung und den Tiefenschutz. Übertragen Sie das Peptidharz in ein frisches Szintillationsfläschchen für 0,25 Millimol Arginin-haltiges Peptid. Fügen Sie jeweils 0,25 Milliliter Tri-ISO-Propylen, drei sechs Dioxid, ein Acht-Oktan-Diol, Thiol, deionisiertes Wasser und 18,0 Milliliter TFA hinzu.

Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf einem Labor-Erdbebenrotator vier Stunden lang bei Raumtemperatur gedreht. Wenn Sie fertig sind, fällen Sie das Peptid in 10 x Überschuss an Pre-Chill-Ethylether aus. Die Lösung gleichmäßig auf vier konische 50-Milliliter-Röhrchen verteilen, die vier Proben 10 Minuten lang bei 3.200 g zentrifugieren, um das Peptid nach der Zentrifugation zu sammeln, den Äther abfüllen und das Peptid in 100 Millilitern frischem Ethylether resuspendieren, aufgeteilt auf zwei konische 50-Milliliter-Röhrchen.

Wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang. Reanimation: Suspendieren des Peptids in 50 Millilitern frischem Äther zweimal für insgesamt vier Etherwäschen, nach dem letzten Zentrifugationsschritt wird der Abfallether dekantiert und das Peptid über Nacht unter Vakuum getrocknet. Um die Probe für die Maldi-Time-of-Flight-Analyse vorzubereiten, geben Sie ein bis zwei Milligramm des Peptids in ein 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen und lösen Sie die Probe in einem Milliliter Maldi-Lösungsmittel auf.

Anschließend wird eine Matrixlösung von 10 Milligramm pro Milliliter Alpha Sano-Vierhydroxykeramiksäure im Multis-Lösungsmittel hergestellt. Kombinieren Sie die Peptid- und Matrixlösungen in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis: Platzieren Sie einen Mikroliter der kombinierten Lösung auf drei separate Stellen auf der MALDI-Probenplatte. Trocknen Sie die Stellen mit einer Heißluftpistole.

Schneiden Sie dann jede Probe erneut und trocknen Sie sie. Sammeln Sie schließlich die MALDI-Flugzeitdaten und bestätigen Sie eine Zunahme des Molekulargewichts um 68 Gramm pro Mol aufgrund der Hinzufügung der Methacrylamidgruppe an das Endende des Peptids. Hier ist das NMR-Spektrum eines zwei Kilodalton linearen PEG DM dargestellt, das mit der mikrowellenunterstützten Methode für diese Reaktion funktionalisiert wurde.

Die Protonen-NMR-Analyse kann verwendet werden, um die prozentuale Funktionalisierung zwischen dem beobachteten und dem theoretischen Verhältnis der terminalen Methacrylatprotonen zu den zentralen PEG-Protonen zu berechnen. Die prozentuale Gesamtfunktionalisierung beträgt 91 % und dieses PEG DM ist für den Einsatz in der Hydrogelsynthese ausreichend funktionalisiert. Im Textprotokoll finden Sie Details zur Berechnung der prozentualen Funktionalisierung aufgrund der Vielzahl von Protonenpeaks, die bei der Protonen-NMR-Analyse von Pep-Peptiden auftreten.

Die Peptidfunktionalisierung lässt sich mit Hilfe der maldi-Flugzeit-Massenspektrometrie leichter untersuchen. Dies wird hier demonstriert, wo das Peptid G-K-R-G-D-S-G synthetisiert und einer Methacrylamid-Funktionalisierung unterzogen wurde, ein kleiner Teil des Peptids für die Molekulargewichtsbestimmung vor der Funktionalisierung gespalten wurde, was zeigte, dass der beobachtete Molekulargewichtspeak bei 676 Gramm pro Mol auftrat, dem erwarteten Molekulargewicht des Peptids, der Rest des Peptids vor der Spaltung nach der Methacrylamid-Funktionalisierung einer Methacrylamid-Funktionalisierung unterzogen wurde. Die beobachtete Molekulargewichtsspitze tritt bei 744 Gramm pro Mol auf, dem erwarteten Gewicht des Methacrylamid-funktionalisierten Peptids.

Um die Funktionalität sowohl des PEG DM als auch der Meth-Acrylamid-funktionalisierten Peptide zu demonstrieren, wurden PEG-Hydrogele mit und ohne 0,5 millimolares Meth hergestellt. Acrylamid-funktionalisierte GK R-G-D-S-G sind repräsentative Phasenkontrast- und Live-Dead-Fluoreszenzbilder von MSCs auf Peg-Gelen allein und auf Peg-Gelen, die das Meth-funktionalisierte Peptid enthalten. Die MSCs waren nicht in der Lage, an den UN-funktionalisierten Peg-Hydrogelen zu haften, aber nach Einschluss des Zelladhäsionspeptids RGD waren sie in der Lage, an der Hydrogeloberfläche zu haften und sich auf dieser zu verteilen.

Die Bilder mit lebenden Toten stellen nicht die Lebensfähigkeit der ausgesäten MSC-Population dar. Vielmehr sollen die Fluoreszenzbilder eine Abgrenzung zwischen Adhärenzzellen und kleinen Variationen in der Hydrogel-Topologie ermöglichen, was unter Phasenkontrast allein schwierig sein kann. Interessanterweise sind die nicht ausgebreiteten Zellen, die nur auf die PEG-Gele gesät wurden, sowohl für Calcium AM als auch für AUM Homodimer positiv, was darauf hindeutet, dass die Zellen zum Zeitpunkt der Bildgebung abstarben.

Einer der vielen Vorteile von PEG-Hydrogelen ist ihre hochgradig einstellbare Natur, die die spezifische Zusammensetzung des Stifts verändert. Hydrogel ermöglicht den Forschern ein hohes Maß an Kontrolle über Eigenschaften wie den Elastizitätsmodul, wie hier dargestellt. Es ist bekannt, dass sowohl das PEG-Molekulargewicht als auch der Gewichtsprozentsatz die Hydrogel-Maschenweite, das resultierende Hydrogel, die Steifigkeit und die Freisetzungsrate von verkapselten Arzneimitteln steuern.

Dies wurde durch die Herstellung von Hydrogelen mit unterschiedlichem Molekulargewicht PEG dm und die Untersuchung des resultierenden Hydrogelmoduls und der Maschenweite wie hypothetisch zur Erhöhung des Molekulargewichts des peg demonstriert. Macer bewirkte eine Erhöhung der Hydrogel-Maschenweite und eine Abnahme der Hydrogel-Steifigkeit, die Hydrogel-Maschenweite und die daraus resultierende Gelsteifigkeit können auch durch Veränderung des Gewichts kontrolliert werden. Der Prozentsatz der PEG-Hydrogele wurde mit unterschiedlichem Gewicht hergestellt.

Der prozentuale Anteil der linearen 10 Kilodalton PEG TM und der Hydrogel-Steifigkeit und der Maschenweite wurden wie hier dargestellt bestimmt, wobei eine Erhöhung des Gewichtsprozentsatzes von PEG zu einer signifikanten Abnahme der Maschenweite und einer Erhöhung der Hydrogelsteifigkeit führt. Hydrogele, die verkapseltes Rinderserumalbumin enthalten, wurden unter Verwendung von peg mit unterschiedlichem Molekulargewicht gebildet, wie hier gezeigt. Die Freisetzung von Rinderserumalbumin erfolgt aufgrund der größeren Maschenweite innerhalb des Hydrogels schneller aus Hydrogelen, die unter Verwendung von PEG TM mit höherem Molekulargewicht gebildet wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die PEG-DME-Auszeichnung mit der mikrowellenunterstützten Methode synthetisiert und wie man die Funktionalisierung mit der Protonen-NMR bewertet. Sobald man dieses Verfahren beherrscht, könnte man auch die Ringöffnung von hydrolytisch abbaubaren Gruppen nutzen, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie sich der Hydrogelabbau auf die Zellfunktion auswirkt. Sie sollten auch ein gutes Verständnis dafür haben, wie diese Technik verwendet werden kann, um selektiv Methacrylamid-Funktionalitäten in die Peptidsequenzen der Endtermini einzubauen, und wie diese Funktionalisierung mit Hilfe der Multi-Time-of-Flight-Massenspektrometrie bewertet werden kann.

Danke fürs Zuschauen.