Zwei Techniken zum Erstellen Hypoparathyroid Mäuse: Parathyreoidektomie Mit GFP Drüsen und Diphtherie-Toxin-Mediated Parat Ablationssystem

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zwei Mausmodelle des erworbenen Hypoparathyreoidismus zu generieren, die einfach zu verwenden sind, einen stabilen Phänotyp erzeugen und die Schilddrüsenfunktion intakt lassen. Der Hauptvorteil dieser beiden Modelle besteht darin, dass sie die präzise Entfernung von Nebenschilddrüsen bei Mäusen ermöglichen, entweder durch fluoreszenzgesteuerte Chirurgie oder durch PTH-spezifische Expression des Diphtherietoxin-Rezeptors, wodurch die Zellen selektiv angegriffen und zerstört werden können, ohne die benachbarte Schilddrüse zu beeinträchtigen. Wir hoffen, dass unsere Mausmodelle in der Lage sein werden, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des Hypoparathyreoidismus zu beantworten.

Können PTH-Analogtherapien beispielsweise dazu beitragen, einen normalen Serumkalziumspiegel aufrechtzuerhalten, ohne die Kalziumausscheidung im Urin zu erhöhen? Diese Modelle können auch zur Untersuchung anderer klinischer Fragestellungen beim Hypoparathyreoidismus verwendet werden. Ist zum Beispiel die Knochenstärke durch Hypoparathyreoidismus beeinträchtigt und verändert sie sich mit der Behandlung?

Fragen wie diese sind bei Patienten schwer zu beantworten, aber diese Mausmodelle können verwendet werden, um sie zu beantworten. Beginnen Sie mit der Anästhesie von acht bis 10 Wochen alten Mäusen und exprimieren Sie GFP spezifisch in Nebenschilddrüsen nach einem genehmigten Protokoll. Bringen Sie das Tier in Rückenlage und sorgen Sie für eine angemessene Narkosetiefe, indem Sie auf keinen Zehenkneifreflex oder andere Mittel verzichten.

Verlängern Sie den ventralen Halsbereich und bereiten Sie sich auf die Operation vor, indem Sie das Fell rasieren. Desinfizieren Sie die rasierte Haut mit einem antiseptischen Povidon-Jod-Pad und bereiten Sie dann die Inzisionsstelle mit einem chirurgischen Peeling und einer Alkoholspülung gemäß Ihrem genehmigten Protokoll vor. Decken Sie das Tier anschließend mit sterilen OP-Abdeckungen ab, um die Kontamination der Operationsstelle zu reduzieren.

Nachdem Sie mit einem chirurgischen Skalpell einen 2 Zentimeter langen Längsschnitt geschnitten haben, verwenden Sie eine gebogene, gezackte Pinzette, um die Faszie zu präparieren, und schieben Sie die Speicheldrüsen zur Seite. Während Sie dann die Operationsstelle durch ein Präpariermikroskop betrachten, verwenden Sie die Spitzen einer scharfen Pinzette, um die paratrachealen Muskeln zu durchtrennen und die Luftröhre freizulegen. Identifizieren Sie den rechten und linken Lappen der Schilddrüse, die sich neben der Luftröhre befinden.

Schalten Sie dann die Lichtquelle auf Fluoreszenzlicht um und visualisieren Sie die beiden grün fluoreszierenden Nebenschilddrüsen. Nagetiere haben in der Regel nur zwei Nebenschilddrüsen. Wenn Sie die beiden Nebenschilddrüsen neben der Schilddrüse auf jeder Seite nicht identifizieren können, sollten ektopisch gelegene Nebenschilddrüsen vermutet und eine sorgfältige Suche entlang der Luftröhre durchgeführt werden.

Verwenden Sie anschließend eine chirurgische Zange und eine Schere, um die grünen Nebenschilddrüsen vorsichtig zu entfernen, und überprüfen Sie sorgfältig entlang der Luftröhre, um sicherzustellen, dass das gesamte grüne Gewebe entfernt wurde. Verwenden Sie sterile Gaze zur Blutstillung. Verschließen Sie die paratrachealen Muskeln mit unterbrochenen Nähten.

Verschließen Sie den Hautschnitt mit Halstead-Nähten. Setzen Sie das postoperative Tier in einen separaten Käfig auf einem Wärmekissen, um die Körpertemperatur wiederherzustellen. Sobald die Maus wach ist, geben Sie Pelletfutter und Wasser mit etwas Gelatinefutter auf den Käfigboden.

Nach einer postoperativen Beobachtungszeit von zwei Stunden bringen Sie die Maus in die Tiereinrichtung zurück. Analysieren Sie drei Tage nach der Parathyreoidektomie 10 Mikroliter Schwanzblut auf ionisiertes Kalzium mit einem Analysator wie dem Blutgassystem, dem Kalzium- und pH-Analysator. Wenn die Parathyreoidektomie erfolgreich ist, beträgt das ionisierte Kalzium im Blut gleich oder weniger als minus zwei Standardabweichungen von denen von scheinoperierten Kontrollmäusen.

Beginnen Sie mit der Zubereitung der Diphtherietoxinlösung, indem Sie Diphtherietoxinpulver mit steriler Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter verdünnen. Die Lösung steril filtrieren und zuteilen. Injizieren Sie fünf Mikrogramm Diphtherietoxin pro Kilogramm Körpergewicht in acht bis 10 Wochen alte Mäuse und exprimieren Sie die Diphtherietoxin-Rezeptoren spezifisch in den Nebenschilddrüsen.

Drei Tage nach einer zweiten Injektion von Diphtherietoxin analysieren Sie wie zuvor 10 Mikroliter Schwanzblut auf ionisiertes Kalzium. Im Folgenden finden Sie repräsentative Bilder der verschiedenen Lokalisationen der Nebenschilddrüsen bei Mäusen, die GFP spezifisch in der Nebenschilddrüse exprimieren. Mäuse hatten entweder zwei oder drei grüne Nebenschilddrüsen.

Die meisten Nebenschilddrüsen befanden sich in der Nähe des oberen Randes oder in der Nähe des unteren Randes der Schilddrüse. In seltenen Fällen wurden einige Nebenschilddrüsen ektopisch lokalisiert. Einer der Vorteile unseres Mausmodells ist, dass die Schilddrüse intakt bleibt.

Diese Abbildung zeigt die TSH-Spiegel von GFP-PTX-Mäusen drei Monate nach der Parathyreoidektomie. Diese Abbildung zeigt die T4-Messungen. GFP-PTX-Mäuse wiesen TSH-Konzentrationen und T4-Konzentrationen auf, die sich nicht von denen der Kontrollmäuse unterschieden.

Dieses Bild zeigt die Kalziumspiegel und PTH-Spiegel im Blut bei GFP-PTX-Mäusen. Dieses Bild zeigt die Calciumspiegel und PTH-Spiegel im Blut von Mäusen, die mit Diphtherietoxin injiziert wurden. Sowohl GFP-PTX-Mäuse als auch DT-injizierte PTHcre-iDTR-Mäuse zeigten über einen dreimonatigen Beobachtungszeitraum eine stabile Hypokalzämie und reduzierte PTH-Spiegel

Sobald die GFP-geführte Parathyreoidektomie gemeistert ist, kann sie während des gesamten Eingriffs in etwa 20 Minuten durchgeführt werden. Eine einmalige Injektion von Diphtherietoxin dauert nicht länger als eine Minute, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren entwickeln diese Mäuse einen Hypoparathyreoidismus und können als präklinisches Krankheitsmodell verwendet werden.

Es können Fragen wie die Wirksamkeit verschiedener PTH-Hormonanaloga bei der Behandlung von Hypoparathyreoidismus beantwortet werden. Vergessen Sie nicht, dass Diphtherietoxin gefährlich ist und dass Arbeiter die üblichen Diphtherietoxin-Impfungen durchführen sollten. Bei der Durchführung dieser Eingriffe sollte immer persönliche Schutzausrüstung wie Masken und Handschuhe getragen werden.