Name: Zwei Techniken zum Erstellen Hypoparathyroid Mäuse: Parathyreoidektomie Mit GFP Drüsen und Diphtherie-Toxin-Mediated Parat Ablationssystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Lernen Sie zwei Methoden zur Erzeugung von Hypoparathyreoidismus-Mausmodellen: GFP-gesteuerte Parathyreoidektomie und Diphtherie-Toxin-vermittelte Ablation. Diese Techniken ermöglichen präzise Entfernung der Nebenschilddrüsen bei intakter Schilddrüsenfunktion.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH gewährt R01-DK100584 und China State Key Laboratory of Oral Diseases Offene Finanzierung SKLOD2015OF01 (RB). Wir danken Wenping Zhao, Tadatoshi Sato und Kelly Lauter um Hilfe.

Diese Studie wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) des Massachusetts General Hospital genehmigt. Erhalten Sie geeignete institutionelle Zulassung für diese Tierstudie vor Beginn. Einige Techniken haben könnten nach den örtlichen IACUC Anforderungen angepasst werden. 1. GFP-PTX Mäuse <ol><li> Erhalten PTHcre + Mäuse und Rosa-mTmG Mäuse bei 8 - 10 Wochen alt für eine weitere Paarung. </li><li> Rückkreuzungs die PTHcre + Mäusen (mixed 129; FVB Hintergrund) mit C57BL / 6 - Mäuse für 6 Generationen Mäusen C57BL / 6 - Hintergrund zu erhalten. </li><li> Inbreed PTHcre + Mäuse PTHcre + / + Mäuse 17 zu erhalten. HINWEIS: Genotypisierung ausführen zu können, extrahieren die DNA aus der Spitze des Schwanzes und verwenden Sie es für die PCR. Die PCR-Primer für Heterozygotie und Homozygotie des PTHcre Transgen zu überprüfen, sind wie folgt: Vorwärts-Primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, Primer A umkehren &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, forward Primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, Reverse - Primer B &#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Kreuz PTHcre + / + Mäuse 16 mit Rosa-mTmG Mäuse 18. Wean PTHcre; mTmG Welpen als 4 Wochen alt. </li><li> Anästhesieren 8 - 10 Wochen alt PTHcre; mTmG Mäuse durch ip Injektion von Tribromethanol (Avertin) bei 0,6 mg / g Körpergewicht oder anderen Mitteln wie Ketamin / Xylazin. Verwenden Buprenorphin 0,1 mg / kg sc alle 12 h als Analgetikum für 48 h nach der Operation entsprechend einem zugelassenen Protokoll. Sicherstellung einer angemessenen Tiefe der Anästhesie durch den Zeh Prise Rückzugsreflex oder andere Mittel. Legen Sie das Tier in Rückenlage. </li><li> Verlängern und bereiten den ventralen Halsbereich durch die Haut mit einzelnen Kanten Klingen rasieren. Desinfizieren Sie die rasierte Haut mit einem Povidonjodid antiseptisch Pad. </li><li> Decken Sie das Tier mit einem sterilen OP-Tüchern Kontamination der Operationsstelle zu reduzieren und autoklaviert Mikrofon verwendenrosurgical Instrumente zum chirurgischen Eingriff. </li><li> Schneiden Sie ein 2 cm Längsschnitt in der Haut mit einem chirurgischen Skalpell. Präparieren Faszie und drücken Sie die Speicheldrüsen an der Seite durch stumpfe Dissektion mit gekrümmten gezackten Pinzette. </li><li> Unter dem Präpariermikroskop Halogenlicht und ein 4 - 5fache Vergrößerung, schneiden und trennen Sie die paratracheal Muskeln mit scharfen Zangenspitzen und die Luftröhre aus. </li><li> Identifizieren Sie die Schilddrüse mit der rechten und linken Lappen neben der Luftröhre. </li><li> Schalten Sie die Lichtquelle Fluoreszenzlicht und visualisieren die beiden grünen fluoreszierenden Nebenschilddrüsen. HINWEIS: In der Regel werden die beiden Nebenschilddrüsen an oder nahe der Oberfläche der Schilddrüse befindet, aber gelegentlich werden sie weiter entfernt. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die grüne chirurgische Pinzette und Schere mit Nebenschilddrüsen. Verwenden steriler Gaze für Hämostase und sorgfältig zu prüfen, entlang der Luftröhre, um sicherzustellen, dass alle grünen Gewebe entfernt wurde. </li&gt; <li> Schließen Sie die paratracheal Muskeln durch unterbrochene Naht mit 6-0 Polyglactin 910 Nähten. Schließen Sie den Hautschnitt von Halsted Naht mit 6-0 Polyglactin 910 Nähten. </li><li> Optional: Injizieren Sie 10 ul / g Körpergewicht sterile normale 0,9% Natriumchloridlösung für die Mäuse für Flüssigkeitsersatz. </li><li> Legen Sie Tiere zu postoperativen einem separaten Käfig an einem warmen Inkubator (37 ° C) für die Körpertemperatur Erholung. Sobald die Mäuse wach und in der liegenden Position sind, setzen Pelletfutter und Wasser mit etwas Gelatine Essen auf dem Käfigboden. </li><li> Nach einer postoperativen Beobachtungszeit von 2 h, Maus an die Tierhaltung zurückkehren und lokale Anforderungen für die postoperative Pflege folgen. </li><li> 3 Tage nach Parathyreoidektomie, 10 &amp; mgr; l Schwanz Blut erhalten und zu messen Blut ionisiertem Ca ++ unter Verwendung eines Analysators wie dem Blutgassystem Ca ++ / pH - Analysator. Erfolgreiche Parathyreoidektomie Ergebnisse in Blut ionisiertem Ca ++ gleich oder niedriger als -2SD von scheinoperierten control Mäuse (1,20 mmol / L in unseren Experimenten von n = 30). </li></ol> 2. PTH-cre-IDTR Mäuse <ol><li> Erhalten PTHcre + und DTR fl / fl Mäusen bei 8 - 10 Wochen alt für die Paarung. </li><li> Rückkreuzungs die PTHcre Mäuse (mixed 129; FVB Hintergrund) mit C57BL / 6-Mäuse für 6 Generationen Mäusen C57BL / 6-Hintergrund zu erhalten. </li><li> Inbreed die PTHcre + (C57BL / 6 Hintergrund) Mäuse PTHcre + / + Mäuse 17 zu erhalten. HINWEIS: Zur Durchführung der Genotypisierung, DNA von Mäusen Schwanzspitzen wurde extrahiert und verwendet für die PCR. Genotypisierung Grundierungen: Vorwärts - Primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, Reverse - Primer A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, Vorwärts - Primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, Reverse - Primer B&#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Mate - PTHcre + / + Mäuse 16 mit DTR fl / fl Mäuse 19 PTHcre-IDTR Mäuse zu erhalten. </li><li> Bereiten Sie DT-Lösung durch Verdünnen diphtheriein Toxin-Pulver mit steriler Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 0,5 &amp; mgr; g / mL. Sterilfilter und speichern Aliquots bei -80 ° C. </li><li> Wählen Sie 8 - 10 Wochen alt PTHcre-IDTR Mäuse für die Injektion Experiment. Auftau DT Aliquot auf Raumtemperatur verabreichen DT intraperitoneal mit 5 ug / kg (10 &amp; mgr; l / g) Körpergewicht des Tieres. Für maximale Effizienz und mindestens Toxizität wird DT Verabreichung in einem 3-tägigen Intervall 17 für insgesamt 2 Injektionen wiederholt. </li><li> 3 Tage nach der zweiten Injektion nehmen 10 ul Schwanz Blut von jedem PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR-mTmG Maus und Blut Ca ++ messen mit Hilfe eines Blutgas - System Ca ++ / pH - Analysator. HINWEIS: Wir definieren Mäuse mit Blut Ca ++ ionisiert niedriger als 1,18 mmol / L wie hypoparathyroid Mäuse, die 2SD gleich unter dem Mittelwert der Fahrzeug-injizierten Kontrollmäusen (n = 22). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir demonstrieren die Technik der GFP-geführten Parathyreoidektomie mit transgenen Mäusen, die mit GFP-Expression selektiv in den Nebenschilddrüsen. In den PTHcre; mTmG Mäuse, die doppelte Fluoreszenz (die grüne GFP in Cre-Zellen exprimiert und rote Tomaten in nicht-Cre ausgedrückt Zellen) konnten wir eindeutig zu identifizieren und genau alle Nebenschilddrüsen entfernen, ohne die Schilddrüsen zu entfernen. Während wir den Einsatz der Doppelfluoreszenz mTmG Mäuse für die Fähigkeit zu identifizieren leuchtrot nicht Parat Gewebe bevorzugt, sollte sich unser Verfahren auch gut einzelnen fluoreszierenden Tiere wie die Tomate rot (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 mit Arbeit ( CAG-tdTomato) hze / J) Maus. Das Verfahren ist relativ einfach durchzuführen, erfordert etwa 20 min pro Maus, und führt zu einer starken und anhalt hypoparathyroid Phänotyp. Darüber hinaus ist ein weiterer Vorteil der GFP-positive Nebenschilddrüsen ist die einfache Detektion von aberrant Nebenschilddrüsen. Unsere Studien zeigen,Mislokalisation der Epithelkörperchen in etwa ein Viertel der B6 - Mäusen (Abbildung 1), die durch die grüne Fluoreszenz in unserem Mausmodell leicht erkannt werden. Im Gegensatz zu thyreo-Parathyreoidektomie vermeidet unserer Technik, um die Entfernung der Schilddrüse mit nachfolgender Bedarf für die Hormonersatz Schilddrüse und die unbekannte Wirkung der Entfernung von Calcitonin-produzierende C-Zellen der Schilddrüse. Fluoreszenzmarkierten Nebenschilddrüsen auch für andere Untersuchungen verwendet werden könnten, die die Isolierung der Nebenschilddrüsen erfordern. Die Begrenzung dieses Modells enthält die Forderung nach der Operation. Grund Mikrochirurgie Fähigkeiten und einem Präpariermikroskop mit einer fluoreszierenden Lichtquelle benötigt. Eine zweite Technik zum Erzeugen hypoparathyroid Mäuse, die die Notwendigkeit einer Operation beseitigt wird demonstriert. Diphtherietoxin behandelten PTHcre-IDTR Mäuse eine mildere hypoparathyroidism Phänotyp aufweisen, sondern einfach erfordern DT intraperitoneal in die Maus injiziert wird. Der kritische Teil for Erzeugung dieses Modells wurde die Optimierung der Dosis und Dosierungsschema. Hohe Dosen von DT führte zu Toxizität, aber niedrige Dosen verringert die Wirksamkeit des Ansatzes. Wir stellten fest, dass die Dosis Regiment von 2 Injektionen bei 5 ug / kg, verabreicht 3 Tage auseinander, führte zu zuverlässigen und stabilen Hypokalzämie ohne / minimale Sterblichkeit. Letztendlich hoffen wir, dass diese beiden Ansätze nützliche Mausmodelle für erworbene hypoparathyroidism bieten. Verwendung eines neuartigen langwirksamen PTH berichteten wir über die erste Verwendung beider dieser Modelle bei der Bestimmung der Wirksamkeit von neuen Arzneimitteln für Hypoparathyreoidismus 17.

Da die erste systematische Beschreibung der Nebenschilddrüsen in der Human- und in mehreren anderen Arten von Sandström im Jahr 1880 1, das Verständnis der Bedeutung dieser kleinen endokrine Organ für die menschliche Physiologie und Krankheit hat sich kontinuierlich verbessert. Nebenschilddrüsen sezerParatHormon (PTH), das wichtigste Regulator des Kalziumstoffwechsels. PTH ist auch ein wichtiges Hormon für Phosphat - Homöostase und Knochenumsatz 1, 2. Unbeabsichtigter Entfernung oder Beschädigung der Nebenschilddrüsen während Hals - Chirurgie ist die häufigste Ursache für Hypoparathyreoidismus, eine Krankheit , die durch einen niedrigen Blutkalzium, niedrige PTH gekennzeichnet und erhöhte Phosphor 1. Um eine bessere Studie erworbenen Hypoparathyreoidismus und Test neuartige Therapien, zuverlässige und leicht zugängliche Mausmodelle erforderlich sind. Mäuse werden weit verbreitet in der Forschung verwendet werden, weil eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen a sindvailable in dieser Spezies für mechanistische Studien in vivo ermöglicht. Während jedoch die chirurgische Parathyreoidektomie (PTX) bei Ratten verwendet werden können , 2, 3, 4, 5 und größeren Säugetieren 6, 7, 8, ist es technisch sehr anspruchsvoll in Mäusen wegen der geringen Größe der Drüsen und ihre variable anatomischen Verteilung 9. Daher wird in Mäusen thyreo-Parathyreoidektomie (TPTX) typischerweise durchgeführt, in denen die Schilddrüse und Nebenschilddrüsen zusammen 10 entfernt werden. Allerdings sind niedrige Schilddrüsenhormonspiegel ein potentieller Störfaktor in Experimenten, dieses Modell zu komplizieren. Zusätzlich C-Zellen in der Schilddrüse, die in Nagetieren wichtig in Calciumhomöostase Calcitonin, ein Hormon produzieren, werden auch beim Entfernen der th verlorenyroids 11. Mehrere genetische Mausmodelle von Hypoparathyreoidismus existieren, die den PTH-null - Maus 12, die GCM2-null - Maus 13 und der Maus Nuf mit einem aktivierenden Mutation in der Calcium-sensitiven Rezeptor (CaSR) 14, 15 umfassen. Jedoch sind diese genetische Defekte bereits während der embryonalen Entwicklung und die Funktion der Nebenschilddrüsen ist daher bereits während der Embryonalentwicklung beeinträchtigt. Dies kann die Entwicklung von Organen, wie beispielsweise das Skelett beeinflussen. Dies steht im Gegensatz zu Patienten mit postoperativen Hypoparathyreoidismus, die die Krankheit im späteren Leben zu erwerben. Außerdem zeigen einige dieser Mausmodelle frühen Letalität und verminderte Fruchtbarkeit, die ihre Anwendung 12, 13 weiter erschwert, 14. Wir entwickelten zwei neue Maus modelle für erworbene Hypoparathyreoidismus. Unter Verwendung genetisch Mäuse, die GFP speziell in den Nebenschilddrüsen ausdrücken lassen sich die Nebenschilddrüsen ohne Entfernung der Schilddrüse für die chirurgische Entfernung leicht identifiziert werden. Diese Maus wurde erzeugt , indem die PTH-Cre Maus kreuzt, die unter der Steuerung der 5,5 kb - Promotor PTH 16 mit dem ROSA mTmG Maus Cre - Rekombinase exprimiert. Die resultierenden PTHcre; mTmG Mäuse exprimieren das grün fluoreszierende Protein spezifisch in Nebenschilddrüsenzellen. Die zweite Maus-Modell verwendet die gleiche PTH-Cre, diesmal eine STOP-Kassette aus dem induzierbaren DTR Maus, was die Expression des Diphtherietoxin-Rezeptor spezifisch in den Nebenschilddrüsen zu entfernen. Eine systemische Verabreichung von DT zerstört Nebenschilddrüsenzellen, wodurch die Tiere ohne Operation hypoparathyroid. Die beiden Mausmodelle in dieser Studie präsentierten zeigen einen stabilen hypocalcämische Phänotyp über den dreimonatigen Beobachtungs period. Die Verfahren sind leicht durchzuführen, ist der Phänotyp reproduzierbar und die hypoparathyroid Mäuse eine hohe Überlebensrate 17 aufweisen.

<table><tbody><tr><td>ROSAmT/mG Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7676</td><td></td></tr><tr><td>PTH-Cre Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5989</td><td></td></tr><tr><td>iDTRmice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7900</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Polyglactin 910 Naht mit Nadel</td><td>Ethicon, Inc</td><td>J510G</td><td></td></tr><tr><td>Safety Single Edge Rasierklingen</td><td>American Safety Razor Company</td><td>66-0089</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Einweg-Skalpellfeder-Sicherheitsrasierer Co., LTD</td><td>72042-11</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod-Vorbereitungspads</td><td>Dynarex Corporation</td><td>1108</td><td></td></tr><tr><td>Lagen</td><td>Gaze Busse. Inc</td><td>BHD707</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % Natriumchloridlösung</td><td>HOSPIRA Worldwide, Inc</td><td>07983-09</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 29 g Insulinspritze</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>329622</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schnitttücher</td><td>3M</td><td>6640EZ</td><td></td></tr><tr><td>Dumstar Biology Pinzette</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument Co., Inc</td><td>RS-4984</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierfederschere</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>MILTEX.,Inc</td><td>V98-42</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Zum Auflösen des 2,2,2-Tribromethanol</td></tr><tr><td>Diphtherietoxin Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0564</td><td>In 0,9%iger Natriumchloridlösung bei 1 mg/ml als Stammlösung in -80 &#176 auflösen; C</td></tr><tr><td>Multicap Blutentnahme Kapillarröhrchen</td><td>Siemens Healthcare Diagnostics Ltd</td><td>855578</td><td>Für die Blutentnahme in iCa2+ Analysen mit dem RapidLab 348 Ca2+/pH-Analysator</td></tr><tr><td>RapidLab 348 Ca2+/pH-Analysator</td><td>Siemens Healthcare</td><td></td><td>Für die Analyse von iCa2+</td></tr></tbody></table>

zwei techniken zum erstellen hypoparathyroid mäuse: parathyreoidektomie mit gfp drüsen und diphtherie-toxin-mediated parat ablationssystem

Two Techniques to Create Hypoparathyroid Mice: Parathyroidectomy Using GFP Glands and Diphtheria-Toxin-Mediated Parathyroid Ablation

Hypoparathyreoidismus (HP) ist eine Erkrankung, die durch niedrige PTH-Werte gekennzeichnet ist, die zu Hypokalzämie, Hyperphosphatämie und niedrigem Knochenumsatz führen. Die häufigste Ursache der Erkrankung ist die versehentliche Entfernung der Nebenschilddrüsen während einer Schilddrüsenoperation. Neuartige Therapien für HP werden benötigt, aber ihre Erprobung erfordert zuverlässige Tiermodelle der erworbenen HP. 
Hier demonstrieren wir die Generierung von zwei Mausmodellen erworbener HP. Im GFP-PTX-Modell wurden Mäuse mit grün fluoreszierendem Protein (GFP), das spezifisch in den Nebenschilddrüsen (PTHcre-mTmG) exprimiert wird, durch Kreuzung von PTHcre+-Mäusen mit Rosa-mTmGfl/fl-Mäusen erzeugt. Grün fluoreszierende Nebenschilddrüsen lassen sich unter einem Fluoreszenzmikroskop leicht identifizieren und die Parathyreoidektomie wird in weniger als 20 Minuten durchgeführt. Nach einer fluoreszenzgesteuerten Operation sind Mäuse zutiefst hypokalzämisch. Im Gegensatz zur herkömmlichen Thyreo-Parathyreoidektomie bleiben bei diesem präzisen chirurgischen Ansatz die Schilddrüse und die Schilddrüsenfunktion intakt. Das zweite Modell, das keine Operation erfordert, basiert auf einem Diphtherie-Toxin-Ansatz. PTHcre-iDTR-Mäuse, die den Diphtherietoxin (DT)-Rezeptor spezifisch in den Nebenschilddrüsen exprimieren, wurden durch Kreuzung der induzierbaren DTR-Maus mit der PTHcre-Maus erzeugt. Nebenschilddrüsenzellen werden so empfindlich gegenüber Diphtherietoxin (DT) und können durch systemische Injektion von DT an Mäuse selektiv zerstört werden. Der resultierende hypokalzämische Phänotyp ist stabil.

Lage der Nebenschilddrüsen Zunächst erfasst wir die Verteilung der Nebenschilddrüsen von 54 PTHcre-mTmG Mäusen wie unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet Dissektion. 74% (40/54) Mäuse hatten zwei grüne Nebenschilddrüsen (1A, C, E), 26% (14/54) Mäuse hatten eine zusätzliche dritte Nebenschilddrüsen (Abbildung 1B, D, F). Keine Maus mit einer einzigen Drüse oder mehr als drei Drüsen beobachtet. Üblicherweise wurden Nebenschilddrüsen in der Nähe des oberen Rand der Schilddrüse (58%, 71/122; 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3)). 27% (33/122) Drüsen in der Nähe der unteren Grenze der Schilddrüse angeordnet waren (1C (1), D (3), F (1)) und 13% (16/122) aus der t entfernt angeordnethyroid Drüse (Abbildung 1B (3), E (1), F (2)). Unsere Ergebnisse stehen im Einklang mit und erweitern frühere Ergebnisse von 20 Standorten der Nebenschilddrüsen variiert. GFP-PTX Mäuse Die gesamte Operation aus der Narkose die Hautschnitt zur Schließung dauerte etwa 20 Minuten pro Maus. Die Überlebensrate von postoperativen Mäusen über einen 3-Monats-Beobachtungszeitraum betrug 96,3% (53/55). 92,4% (49/53) GFP-PTX Mäuse ionisierte Kalziumspiegel zeigten, dass 2 SD unter dem Mittelwert von scheinoperierten waren Kontrollmäuse oder niedriger. Der hypoparathyroid Phänotyp in den GFP-PTX-Mäuse (Hypokalzämie, niedriger PTH und erhöhte Serum-Phosphat) war stabil für die gesamte Beobachtungszeit von 3 Monaten. Wichtig ist, dass die Funktion der Schilddrüse nicht verschieden von scheinoperierten Tieren 3 Monate nach der Operation (TSH = 42 ± 24 vs. 30 ± 15 mU / l, p = 0,171; T4 = 30,0 ± 0,6 vs 3,1 ± 0,9 &amp; mgr; g / dl, p = 0,707 (Abbildung 2). PTH-cre-IDTR Mäuse DT injiziert PTH-Cre-IDTR Mäuse entwickelten Hypoparathyreoidismus (niedriger Blut ionisiertem Kalzium, erhöhter Blut Phosphor und unangemessen niedrig-normalen PTH-Spiegel). Wir haben bereits berichtet , dass einige PTH - positiven Zellen die Ablation von Diphtherietoxin entkommen, erklärt die messbaren zirkulierenden PTH und die deshalb den etwas milderen Phänotyp dieser Mäuse 17. Hypoparathyreoidismus in GFP-PTX Mäuse und PTH-cre-IDTR Mäuse Signifikante Verringerungen des Blut Ca ++ und Serum - PTH - Spiegel wurden in GFP-PTX - Mäuse 3 Tage nach der Operation beobachtet, im Vergleich zu Ebenen in scheinoperierten Mäusen (Ca ++ gefunden = 1,05 ± 0,40 vs. </em&gt; 1,30 ± 0,03 mmol / l, p &lt;0,05; PTH = 32 ± 22 vs. 580 ± 137 pg / ml, p &lt;0,05). Der hypoparathyroidism Phänotyp war stabil über der 3-monatigen Beobachtungsperiode (3A, nachgedruckt mit freundlicher Genehmigung von (Referenz # 17)). Nach 2 Injektionen von 5 ug / kg DT in 3 Tage-Intervall, einer Dosis und Therapie optimiert, um die geringste Menge an DT verwenden, um den maximal hypoparathyroid Phänotyp zu verleihen, injiziert die DT PTH-cre-IDTR Mäuse signifikante Hypokalzämie und reduzierte PTH zeigten im Vergleich zu Fahrzeugkontrollmäuse, die über die 90 Tage Beobachtungszeit anhielt (Ca ++ = 1,10 ± 0,07 mmol / l vs. 1,26 ± 0,05 mmol / l, p &lt;0,05; PTH = 218 ± 156 pg / ml vs. 572 ± 164 pg / ml, p &lt;0,05) (3B, mit freundlicher Genehmigung von (Referenz # 17 abgedruckt)). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig1.jpg" /> Abbildung 1: <strong&gt; Repräsentative Bilder der verschiedenen Standorte der Nebenschilddrüsen in 54 PTHcre-mTmG Mäuse unter Fluorescent Dissection Mikroskop. Die Mäuse hatten entweder zwei (A, C, E) oder drei (B, D, F) grün Nebenschilddrüsen. Die meisten Nebenschilddrüsen in der Nähe der oberen Grenze wurden (A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3) oder nahe dem unteren Rand der Schilddrüse (C (1), D (3), F (1)). In seltenen Fällen wurden ektopisch einige gelegen (B (3), E (1), F (2)). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig1large.jpg" target="_blank">um</a> die <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig1large.jpg" target="_blank">sehen eine größere Version dieser Figur.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig2.jpg" /> Abbildung 2: TSH und T4 Niveau der GFP-PTX Mäuse. 3 Monate nach der GFP-PTX, Serum wurde für TSH und T4 Measurem erhalten<html> ents. GFP-PTX Mäuse zeigten TSH - Konzentrationen (42 ± 24 mU / L) (A) und T4 - Konzentrationen (3,0 ± 0,6 &amp; mgr; g / dL) (B) , die aus Kontrollmäusen nicht unterschiedlich waren (TSH = 30 ± 15 mU / L, p = 0,171, n = 11, T4 = 3,1 ± 0,9, p = 0,707, n = 11). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig3.jpg" /> Abbildung 3: Blut Ca ++ und PTH - Spiegel in GFP-PTX Mäuse und DT injizierte PTH-cre-IDTR Mäuse. Beide GFP-PTX - Mäusen (A) und DT injiziert PTH-cre-IDTR Mäuse (B) zeigten stabile Hypokalzämie und reduziert die PTH - Spiegel über 3 Monate Beobachtungszeitraum (N = 6 - 8, *** p &lt;0,001) (neu gedruckt mit Genehmigung aus Lit. # 17).es / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Mäuse mit erworbenem Hypoparathyreoidismus wären nützlich für die Untersuchung neuartiger medikamentöser Therapien für Hypoparathyreoidismus. Es werden zwei Verfahren zur Herstellung solcher Mäuse demonstriert. Die GFP-PTX-Maus wird durch chirurgische Parathyreoidektomie erzeugt, die von grün fluoreszierenden Nebenschilddrüsen geleitet wird. Ein zweiter, nicht-operativer Ansatz basiert auf der parathormonspezifischen Expression des Diphtherietoxin-Rezeptors.

Zwei Techniken zum Erstellen Hypoparathyroid Mäuse: Parathyreoidektomie Mit GFP Drüsen und Diphtherie-Toxin-Mediated Parat Ablationssystem

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zwei Mausmodelle des erworbenen Hypoparathyreoidismus zu erstellen, die einfach anzuwenden sind, ein stabiles Phänotyp hervorbringen und die Schilddrüsenfunktion unbeeinflusst lassen. Der Hauptvorteil dieser beiden Modelle liegt darin, dass sie die gezielte Entfernung der Nebenschilddrüsen bei Mäusen ermöglichen, entweder durch eine fluoreszenzgeführte Operation oder durch die PTH-spezifische Expression des Diphtherietoxinrezeptors, wodurch die Zellen selektiv angegriffen und zerstört werden können, ohne die benachbarte Schilddrüse zu beeinträchtigen. Wir hoffen, dass unsere Mausmodelle in der Lage sein werden, zentrale Fragen auf dem Gebiet des Hypoparathyreoidismus zu beantworten.Zum Beispiel: Können PTH-Analog-Therapien helfen, normale Serumkalziumspiegel aufrechtzuerhalten, ohne die kalziuretische Ausscheidung zu erhöhen? Diese Modelle können auch zur Untersuchung weiterer klinischer Fragestellungen bei Hypoparathyreoidismus verwendet werden. Zum Beispiel: Ist die Knochenfestigkeit durch den Hypoparathyreoidismus beeinträchtigt, und verändert sie sich unter einer Behandlung?Fragen wie diese sind bei Patienten schwer zu beantworten, aber mithilfe dieser Mausmodelle können sie untersucht werden. Betäuben Sie zunächst acht- bis zehnwochige Mäuse, die gemäß einem genehmigten Protokoll GFP spezifisch in den Nebenschilddrüsen exprimieren. Bringen Sie das Tier in Rückenlage und überprüfen Sie eine ausreichende Narkosetiefe durch das Fehlen des Zehenreflexes oder auf andere Weise.Dehnen Sie den ventralen Halsbereich und bereiten Sie die Operation vor, indem Sie das Fell rasieren. Desinfizieren Sie die rasierte Haut mit einem Povidon-Jod-Antiseptikumstupfer und bereiten Sie anschließend die Inzisionsstelle gemäß Ihrem genehmigten Protokoll durch eine chirurgische Reinigung und alkoholische Spülung vor. Bedecken Sie danach das Tier mit sterilen chirurgischen Tüchern, um eine Kontamination der Operationsstelle zu verringern.Nachdem Sie mit einem chirurgischen Skalpell einen 2 cm langen Längsschnitt angelegt haben, verwenden Sie gebogene, gezahnte Pinzetten, um die Faszie zu dissezieren, und schieben Sie die Speicheldrüsen zur Seite. Betrachten Sie dann den Operationsbereich unter dem Dissektionsmikroskop und trennen Sie mit der Spitze einer scharfen Pinzette die paratrachealen Muskeln, um die Trachea freizulegen. Identifizieren Sie die rechte und linke Lobe der Schilddrüse, die sich neben der Trachea befinden.Schalten Sie dann die Lichtquelle auf fluoreszierendes Licht um und visualisieren Sie die beiden grün fluoreszierenden Nebenschilddrüsen. Nagetiere besitzen typischerweise nur zwei Nebenschilddrüsen. Falls Sie die beiden Nebenschilddrüsen neben der Schilddrüse auf jeder Seite nicht identifizieren können, sollte an ektopisch lokalisierte Nebenschilddrüsen gedacht werden, und eine sorgfältige Suche entlang der Luftröhre sollte durchgeführt werden.Verwenden Sie anschließend chirurgische Pinzette und Schere, um die grünen Nebenschilddrüsen vorsichtig zu entfernen, und prüfen Sie sorgfältig entlang der Luftröhre, ob sämtliches grünes Gewebe entfernt wurde. Verwenden Sie steriles Tupfermaterial zur Blutstillung. Verschließen Sie die paratrachealen Muskeln mit Einzelnahten.Schließen Sie den Hautschnitt mit Halstead-Nähten. Stellen Sie das Tier nach der Operation in einen separaten Käfig auf eine Wärmematte, um die Körpertemperatur wiederherzustellen. Sobald die Maus wach ist, legen Sie Pelletfutter und Wasser mit etwas Gelatinefutter auf den Käfigboden.Nach einer postoperativen Beobachtungszeit von zwei Stunden wird die Maus in die Tierhaltung zurückgebracht. Drei Tage nach der Parathyreoidektomie werden 10 Mikroliter Schwanzblut zur Bestimmung des ionisierten Kalziums mit einem Analysator wie dem Blutgasanalysesystem für Kalzium und pH-Wert untersucht. Wenn die Parathyreoidektomie erfolgreich war, liegt das ionisierte Kalzium im Blut bei gleichem oder geringerem Wert als zwei Standardabweichungen der sham-operierten Kontrollmäuse.Bereiten Sie zunächst eine Diphtherietoxin-Lösung vor, indem Sie Diphtherietoxin-Pulver mit steriler Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter verdünnen. Filtern Sie die Lösung steril und portionieren Sie sie. Injizieren Sie fünf Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht Diphtherietoxin in acht- bis zehnwochenalte Mäuse, die die Diphtherietoxin-Rezeptoren spezifisch in den Nebenschilddrüsen exprimieren.Drei Tage nach einer zweiten Injektion von Diphtherietoxin 10 Mikroliter Schwanzblut wie zuvor auf ionisiertes Calcium analysieren. Die folgenden Abbildungen zeigen repräsentative Bilder der verschiedenen Lokalisationen der Nebenschilddrüsen bei Mäusen, die GFP spezifisch in der Nebenschilddrüse exprimieren. Die Mäuse wiesen entweder zwei oder drei grüne Nebenschilddrüsen auf.Die meisten Nebenschilddrüsen befanden sich in der Nähe des oberen oder des unteren Rands der Schilddrüse. In seltenen Fällen waren einige Nebenschilddrüsen ektopisch lokalisiert. Einer der Vorteile unseres Mausmodells ist, dass die Schilddrüse intakt bleibt.Diese Abbildung zeigt die TSH-Spiegel von GFP-PTX-Mäusen drei Monate nach Parathyreoidektomie. Diese Abbildung zeigt T4-Messungen. GFP-PTX-Mäuse weisen TSH- und T4-Konzentrationen auf, die sich nicht von denen der Kontrollmäuse unterschieden.Dieses Bild zeigt die Blutkalziumspiegel und PTH-Spiegel bei GFP-PTX-Mäusen. Dieses Bild zeigt die Blutkalziumspiegel und PTH-Spiegel bei mit Diphtherietoxin injizierten PTHcre-iDTR-Mäusen. Sowohl GFP-PTX-Mäuse als auch mit Diphtherietoxin (DT) injizierte PTHcre-iDTR-Mäuse wiesen während eines Beobachtungszeitraums von drei Monaten eine stabile Hypokalzämie und verminderte PTH-Spiegel auf.Wenn die GFP-gesteuerte Nebenschilddrüsenentfernung einmal beherrscht ist, kann das gesamte Verfahren in etwa 20 Minuten durchgeführt werden. Eine einzige Injektion von Diphtherietoxin dauert nicht länger als eine Minute, wenn sie korrekt durchgeführt wird. Nach diesem Eingriff entwickeln diese Mäuse eine Hypoparathyreoidismus und können als präklinisches Krankheitsmodell verwendet werden.Es können Fragen beantwortet werden, wie beispielsweise die Wirksamkeit verschiedener PTH-Hormonanaloga bei der Behandlung einer Hypoparathyreoidismus. Vergessen Sie nicht, dass Diphtherietoxin gefährlich ist und dass Beschäftigte die üblichen Impfungen gegen Diphtherietoxin erhalten sollten. Persönliche Schutzausrüstung wie Masken und Handschuhe sollte stets getragen werden, während diese Verfahren durchgeführt werden.

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