Methodik für die Studie des horizontalen Gentransfers in Staphylococcus aureus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine detaillierte Methodik zur Untersuchung der horizontalen Übertragung von DNA in Staphylococcus aureus bereitzustellen, indem die drei Haupttransferwege untersucht werden. Konjugation, Transduktion und natürliche Transformation. Bei dieser Methode geht es um den horizontalen Transfer von antibiotikaresistenten Genen in den humanen Krankheitserreger Staphylokokken aureus.

Der Hauptvorteil der hier vorgestellten Techniken besteht darin, dass wir drei Hauptmodi des Transfers testen können, einschließlich der kürzlich entdeckten natürlichen genetischen Transformation. Das Verfahren wird von Le Thuy, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert. Bereiten Sie zu Beginn des Experiments fünf Milliliter Übernachtkultur des Spender- und des Empfängerbakteriums in tryptischer Sojabrühe vor. Oder TSB-Medium mit bzw. ohne 32 Milligramm pro Liter Chloramphenicol.

Mit Schütteln bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag wird die optische Dichte der Übernachtkulturen auf eine mit frischem TSB-Medium umgestellt. Mischen Sie 0,5 Milliliter der Spenderkultur mit 0,5 Millilitern der Empfängerkultur.

Und fügen Sie der Mischung einen Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS hinzu. Anschließend wird das Bakteriengemisch mit einem Vakuumpumpensystem auf eine 0,45 Mikrometer große Filtermembran übertragen. Legen Sie die Filtermembranen auf eine Agarplatte aus Schafblut.

Inkubieren Sie die Platten einen Tag lang bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie die Filtermembran aus der Platte und hängen Sie sie in 10 Milliliter PBS. Wirbeln Sie die Mischung etwa eine Minute lang vor, um alle auf der Membran anhaftenden Bakterien zu sammeln.

Führen Sie eine serielle 10-fache Verdünnung der Bakteriensuspension mit frischem TSB durch. 100 Mikroliter der 0, 10, 4 verdünnten Proben auf TSB-Agar auffüllen. Oder TSA-Platten, die mit 32 Milligramm pro Liter Chloramphenicol und acht Milligramm pro Liter Tetracyclin ergänzt werden, um Transkonjugate auszuwählen.

100 Mikroliter der verdünnten Suspension mit acht Milligramm Tetracyclin pro Liter allein auf TSA-Platten auffüllen. Um die Gesamtzahl der Empfänger zu zählen. Nach der Inkubation werden doppelresistente Kolonien mittels Kolonie-PCR auf das Vorhandensein des CFR-Gens und ihre Empfindlichkeitsprofile analysiert.

Bestimmen Sie das Antibiogramm durch Messung der minimalen Hemmkonzentrationen (MICs) geeigneter Antibiotika gemäß der Standard-Mikrodilutionsmethode oder der Scheibendiffusionsmethode. Das Suszeptibilitätsprofil der Transkonjutiere muss mit dem des Empfängers identisch sein. Mit Ausnahme von Chloramphenicol und anderen Verbindungen, die vom CFR-Gen betroffen sind.

Um eine Tetracyclinresistenz auszuschließen, die durch den Spenderstamm entwickelt wurde. Bereiten Sie eine Übernachtkultur von N315-45 in fünf Millilitern Nährstoffbrühe vor, die mit 3,6 Millimolar Kalzium ergänzt wird. Bereiten Sie Subkulturen vor, indem Sie die Übernachtkultur um eins auf 1.000 in einem Endvolumen von 10 Millilitern in 50-Milliliter-Glasfläschchen verdünnen.

Züchten Sie die Bakterien eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln, 180 Umdrehungen pro Minute. Bereiten Sie als nächstes eine Reihe von verdünnten Phagen MR83a in NB-Calciumchloridmedium vor. Geben Sie 20 Mikroliter des verdünnten Phagen in die Bakterienkultur.

Bereiten Sie eine Kontrollkultur ohne Phageninfektion vor, die als Positivkontrolle für das Wachstum von Bakterienzellen dient. Anschließend züchten Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln bei 100 Umdrehungen pro Minute über Nacht. Wählen Sie am nächsten Tag ein oder zwei freigegebene Kulturfläschchen mit der höchsten Verdünnung des zugesetzten Phagen aus.

Füllen Sie die Kulturen in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen um. Geben Sie 250 Mikroliter Chloroform in die Röhrchen und mischen Sie die Kultur gründlich, indem Sie sie umdrehen. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 5.000 mal G für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius.

Füllen Sie die Überstände in frische Röhrchen um und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 Grad Celsius. Nährbrühe Agar-Medium zubereiten und in einem Wasserbad bei 55 Grad Celsius warm halten. Geben Sie autoklavierte 0,5 molare Calciumchloridlösung bis zu einer Endkonzentration von 3,6 Millimolar in das Medium.

Gießen Sie es in 90-Millimeter-Petrischalen NB-Calciumchlorid-Platten. Bereiten Sie eine Übernachtkultur von N315 in fünf Millilitern NB-Calciumchlorid bei 37 Grad Celsius unter Schütteln vor. Am nächsten Tag geben Sie 10 Mikroliter der Nachtkultur in 200 Mikroliter NB-Calciumchlorid und verteilen Sie es gleichmäßig auf der NB-Calciumchloridplatte.

Stoppen Sie das Verteilen, wenn die Oberfläche der Platte mit Flüssigkeit bedeckt ist. Lassen Sie den Teller dann fünf Minuten trocknen. Führen Sie eine serielle Verdünnung von eins bis 10 des zuvor zubereiteten Phagen mit NB-Calciumchlorid-Medium durch.

Verteilen Sie drei Mikroliter jeder Phagenverdünnung auf die mit Bakterien bedeckte Platte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius. Zählen Sie am nächsten Morgen die Plaque-Zahlen und berechnen Sie den Phagentiter mit der folgenden Gleichung.

Bereiten Sie die Übernachtkultur von N315, COL oder MU50 in fünf Millilitern NB-Calciumchlorid bei 37 Grad Celsius und Schütteln bei 180 Umdrehungen pro Minute vor. Nach der Übernachtkultur verdünnen Sie den Phagen in NB-Calciumchlorid auf 109 PFU pro Milliliter. Mischen Sie in einem 50-Milliliter-Glasfläschchen 500 Mikroliter Nachtkultur, 500 Mikroliter frisches NB-Calciumchlorid und einen Milliliter Phagen 109 PFU pro Milliliter.

Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln bei 100 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten. Nach der Inkubation werden 50 Mikroliter 20%iges Trinatriumcitrat in die Kulturen gegeben. Setzen Sie das sanfte Schütteln für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius fort.

Bereiten Sie den geschmolzenen Hirn-Herz-Aufguss oder BHI-Agar-Medium vor und bewahren Sie ihn in einem Wasserbad bei 55 Grad Celsius auf und behandeln Sie das Agar-Medium mit 32 Milligramm pro Liter Chloramphenicol. Füllen Sie dann die Bakterium-Phagen-Mischung in einen 100-Milliliter-Kolben um. Fügen Sie 50 Milliliter warmes BHI-Agar hinzu, das mit 32 Milligramm Chloramphenicol pro Liter ergänzt wird, und mischen Sie gut.

Gießen Sie die Mischung in die 90-Millimeter-Petrischale. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius. Weiterhin werden die erzeugten Kolonien, die Transduktanten, auf Resistenz getestet, indem die Kolonien auf neue BHI-Agarplatten übertragen werden, die mit 32 Milligramm pro Liter Chloramphenicol ergänzt werden.

Bestätigen Sie das Vorhandensein des CFR-Gens durch Kolonie-PCR. Kultivieren Sie die Empfängerzelle über Nacht in fünf Millilitern TSB bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Am nächsten Morgen werden 0,5 Milliliter der Nachtkultur in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.

Fältitieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Suspendieren Sie dann die Zellen mit 10 Millilitern CS2-Medium in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes züchten Sie die Bakterien bei 37 Grad Celsius und schütteln bei 180 Umdrehungen pro Minute für acht Stunden bis zur späten exponentiellen Phase.

Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern frischem CS2-Medium. Geben Sie 10 Mikrogramm gereinigtes Plasmid oder genomische DNA zur Zellsuspension.

Schütteln Sie die Kultur mit 180 Umdrehungen pro Minute. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern BHI-Medium.

Mischen Sie die Zellsuspension mit 90 Millilitern geschmolzenem BHI-Agar-Präparat mit 32 Milligramm pro Liter Chloramphenicol und fünf Mikrogramm pro Liter Tetracyclin im Kontrollexperiment. Gießen Sie die Mischung in die 90-Millimeter-Petrischalen und kühlen Sie sie schnell ab und lassen Sie den Agar fest. Replizieren Sie die Kolonien mit Zahnstochern auf Platten mit geeigneten Antibiotika, um ihre Resistenzeigenschaften zu bestätigen.

Das Konjugationsprotokoll ist nützlich für die Übertragung innerhalb der Spezies, bei der Staphylococcus epidermidis als CFR-Spender verwendet wurde. Und als Empfänger wurde der Staphylococcus aureus N315-Stamm verwendet. Das Protokoll, das für die Übertragung zwischen den Spezies verwendet wird, liefert ähnliche Ergebnisse mit demselben konjugativen Vektor bei verschiedenen konjugativen Spendern.

Dies ist die erste Arbeit, in der Details der natürlichen Transformation beschrieben werden. Die bereitgestellte Methodik wäre für den Forscher nützlich, um die Übertragung und Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen sowie die primäre Determinante beim humanen Krankheitserreger Staphylokokken aureus zu untersuchen.