Name: Methodik für die Studie des horizontalen Gentransfers in Staphylococcus aureus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Lernen Sie Methoden zur Untersuchung horizontalen Gentransfers in Staphylococcus aureus durch Konjugation, Transduktion und natürliche Transformation. Diese Protokolle ermöglichen die Analyse von Antibiotikaresistenzgenen.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der Takeda Science Foundation, dem Pfizer Academic Contribution und dem JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).

HINWEIS: Die Stämme und Materialien , die in dieser Arbeit sind in Tabelle 1 und die Tabelle der Materialien aufgeführt sind. In den Übertragungsversuchen, N315 und COL cfr -positiver Derivate wurden als Spender des GRR - Gens (N315-45 und COL-45) verwendet. Diese Stämme wurden zuvor durch Konjugation erhalten, wobei als Spender einer klinischen cfr -positiver Staphylococcus epidermidis - Stamm (ST2), im Anschluss an die Standard - Konjugation Protokoll (siehe unten). Dieser Stamm beherbergte das cfr - Gen auf einem pSCFS7 artigen Plasmid 7. 1. Konjugation Verwendung der Filter-Mating-Methode HINWEIS: Ein S. aureus - Stamm N315 Durchführung des cfr - Gen (N315-45) 7 (Cm R) wurde als Spender verwendet. COL 8 oder 9 MU50 - Stämme (Tet R, Cm S) wurden als Empfänger verwendet. Doppelt-Lage - resistente Kolonien (Tet R, Cm R) in Gegenwart von 32 mg / l Chloramphenicol plus 8 mg / l Tetracyclin wachsen wurden als putative Transkonjuganten angesehen und die Anwesenheit von cfr durch Kolonie - PCR zu bestimmen , analysiert , und das zu bestimmen Empfänger Anfälligkeit Profil. <ol><li> Führen Konjugation nach einem zuvor beschriebenen Protokoll 10 mit einigen Änderungen: <ol><li> Bereiten Sie 5 ml über Nacht Kultur des Spenders und des Empfängers in CASO-Bouillon (TSB) Medium (mit und ohne 32 mg / l Chloramphenicol, jeweils) mit bei 37 ° C schüttelnd. </li><li> Stellen Sie die optische Dichte (OD 600) der Übernachtkulturen bis 1 (OD 600 = 1,0) durch frische TSB Medium. Mischungs 0,5 ml der Spenderkultur (N315-45) mit 0,5 ml des Empfängerkultur (COL oder MU50). 1 ml PBS zu dem Gemisch. </li><li> Übertragen Sie die Mischung von Bakterien auf einen 0,45 &amp; mgr; m Filtermembran using ein Vakuumpumpsystem. </li><li> Setzen Sie die Filtermembranen auf einem Schafsblutagarplatte. 1 Tag bei 37 ° C inkubieren. HINWEIS: In diesem Schritt angereicherten Medium notwendig ist, das Wachstum von doppelt-resistenten Zellen zu ermöglichen. </li><li> Mit der Filtermembran von der Platte und in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) suspendieren. Vortex gut alle angeschlossenen Bakterien auf der Membran zu sammeln. </li><li> Machen Sie eine serielle 10-fache Verdünnung der Bakteriensuspension durch frische TSB verwendet wird. Platte 100 ul der verdünnten Proben 0-10 -4 auf TSB - Agar (TSA) Platten mit 32 mg / l Chloramphenicol und 8 mg / L Tetracyclin zur Selektion von Transkonjuganten ergänzt. Platte 100 ul der verdünnten Suspension (10 -5 -10 -6) auf TSA - Platten mit 8 mg / l Tetracyclin allein die Gesamtzahl der Empfänger zu zählen. Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 18-24 Std. </li><li> Analysieren doppelt resistenten Kolonien (putative Transkonjuganten) für die Anwesenheit des cfr - Gens durch Kolonie - PCR 7 und ihre Anfälligkeit Profile (Antibiogramm). </li><li> Bestimmen Sie die Antibiogramm durch die minimalen Hemm - Konzentrationen (MHK) von geeigneten Antibiotika nach dem Standard Mikrodilutionsverfahren oder Plattendiffusionsverfahren 11. Die Anfälligkeit Profil der Transkonjuganten muss dem Empfänger identisch sein, mit Ausnahme von Chloramphenicol (und andere Verbindungen , die durch die cfr Gen betroffen). Diese Bestimmung ist wichtig, Tetrazyklin-Resistenz durch die Spenderstamm entwickelt, um auszuschließen. </li></ol></li></ol> 2. Phagentransduktion HINWEIS: Der Bakteriophage MR83a Zugehörigkeit zur Siphoviridae Familie (Labor stock) wurde in den Transduktionsexperimente verwendet. N315-45 wurde als cfr Spender für Phagen - Infektion eingesetzt. N315, COL oder MU50-Stämme wurden als Empfänger verwendet. Der Erwerb von cfr wurde durch die ab bestimmtility des Empfängerstamm in Gegenwart von 32 mg / l Chloramphenicol zu wachsen. Kolonien unter diesen Bedingungen wuchsen , wurden analysiert , um die Anwesenheit von cfr (durch Kolonie - PCR) zu bestimmen und die Suszeptibilität Profil zu bestimmen potentielle Kontamination auszuschließen. <ol><li> Phagenamplifikation auf dem Donator <ol><li> Bereiten Sie eine Nacht - Kultur von N315-45 in 5 ml Nährlösung , ergänzt mit 3,6 mM Ca 2+ (NBCaCl 2) bei 37 ° C unter Schütteln (180 rpm). HINWEIS: Kalzium wird für Phageninfektion erforderlich. Sehen Sie sich die Werkstoff - Tabelle. Nährlösung von anderen Unternehmen könnten Probleme haben, wie Calciumniederschlag. </li><li> Bereiten Subkulturen durch die Übernachtkultur verdünnt 1: 1.000 in einem Endvolumen von 10 ml NBCaCl 2 in 50 ml Glasflaschen oder Glasampullen. Wachsen die Bakterien für 1 Stunde bei 37 ° C unter Schütteln (180 rpm). </li><li> Bereiten Sie eine Reihe von verdünnten Phagen MR83a in NBCaCl 2 medium (10 -2, 10 -3, 10 -4, 10 -5 und 10 -6). Geben Sie 20 &amp; mgr; l des verdünnten Phagen in die Bakterienkultur. ferner einen Kontrollkultur ohne Phageninfektion, die für das Bakterienzellwachstum als positive Kontrolle dient und verwendet werden kann, die Phagentiter am nächsten Tag zu bestimmen. </li><li> Wachsen die Kulturen bei 37 ° C unter leichtem Schütteln (100 rpm) über Nacht. HINWEIS: Die Zellen in einem gewissen Ausmaß wachsen, wenn das infizierende Phage nicht im Überschuss vorhanden ist; Dann werden sie in Lyse Phase eintreten aufgrund der Phagenamplifikation durch den lytischen Zyklus. Die Kultur ohne Phagen wird die volle Wachstum zeigen, während Kulturen mit Phagen unterschiedliche Raten der Transparenz zeigen. </li><li> Wählen Sie eine oder zwei gelöscht Kulturfläschchen mit der höchsten Verdünnung des zugegebenen Phagen. </li><li> Übertragen Sie die Kulturen in 15 ml Zentrifugenröhrchen. In 250 ul Chloroform und gründlich mischen durch die Rohre zu invertieren. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 5000 <em&gt; xg für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Die Überstände in frische Röhrchen und lagern Sie sie bei 4 ° C bis zur Verwendung. HINWEIS: Die Phagen für mindestens ein paar Monate stabil ist, aber zu lange die Phagenpräparation Speicherung reduziert die Titer und Transduktionseffizienz. </li></ol></li><li> Die Messung des Phagen - Titer (Phagen - Plaque - Test) <ol><li> Bereiten Sie Nährlösung Agar (1,5% Agar) Medium; halten Sie es bei 55 ° C in einem Wasserbad warm. Hinzufügen autoklavierten 0,5 M CaCl &amp; sub2 ; -Lösung zu dem Medium bis zu einer Endkonzentration von 3,6 mM. Gießen Sie es in 90 mm Petrischalen (NBCaCl 2 Platten). </li><li> Bereiten Sie eine Nacht - Kultur von N315 in 5 ml NBCaCl 2 bei 37 ° C unter Schütteln; dies kann mit der Kontrollkultur ersetzt werden oben beschrieben (Schritt 2.1.3). </li><li> In 10 ul der Übernachtkultur in 200 ul NBCaCl 2 und gleichmäßig verteilt auf die NBCaCl 2 - Platte. Stoppen Sie die Verbreitung, wenn die Oberflächedie Platte wird mit Flüssigkeit bedeckt. Lassen Sie die Platte trocken. </li><li> Machen Sie eine serielle Verdünnung von 1:10 (von 10 -5 -10 -10) von zuvor hergestellten Phagen (Schritt 2.1.8) unter Verwendung von NBCaCl 2 Medium. </li><li> Spot 3 ul jeder Phagen-Verdünnung auf die Platte mit Bakterien bedeckt. </li><li> Die Platte über Nacht bei 30 ° C. </li><li> Zählen Sie die Plaque - Zahlen und berechnen die Phagen - Titer unter Verwendung der folgenden Gleichung: Plaque bildende Einheit (PFU) / ml = Anzahl der Plaques x Verdünnungsfaktor / getupft Volumen (3 x 10 -3 ml) </li></ol></li><li> Phagentransduktion HINWEIS: Der Pool Phagen im vorherigen Schritt (2.1.8) wird verwendet , um die Weiterleitung des cfr - Gens in die S. aureus - Stämme zu testen. In diesem Experiment wurden die Stämme N315, COL oder MU50 als Empfänger verwendet werden. <ol><li> Bereiten Sie die Nacht - Kultur von N315, COL oder MU50 in 5 ml NBCaCl 2 bei 37 ° C unter Schütteln (180 rpm). </li><li> verdünnen ter Phagen in NBCaCl 2 bis ~ 10 9 PBE / ml. </li><li> In einem 50 ml - Glasfläschchen, mischen 500 ul Nacht - Kultur, 500 ml frisches NBCaCl 2 und 1 ml Phagen (~ 10 9 pfu / ml); die erwartete Multiplizität der Infektion (MOI) muss 1. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C nicht überschreiten, wobei sanft (100 UpM) für 30 min schütteln. HINWEIS: Die Wärmebehandlung von Empfängerzellen unmittelbar vor der Zugabe von Phagen (52 ° C für 2 min , um die endogene Restriktionsenzyme zu inaktivieren) können die Effizienz 12 erhöhen. </li><li> In 50 ul 20% Na 3 -citrat. Weiter sanft bei 37 ° C für 30 min schütteln. HINWEIS: Na 3 -Citrat wirkt als moderate Chelator von Calcium. </li><li> Bereiten Sie geschmolzen Hirn-Herz-Infusion (BHI) Agar (1,5% Agar), Medium und halten sie bei 55 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Übertragen des Bakteriums-Phage Mischung in einen 100 ml Kolben, der 50 ml warmem BHI-Agar, supplementiert mit 32 mg / L chloramphenicol und gut mischen. Gießen Sie die Mischung in die 90 mm Petrischalen. HINWEIS: Dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis einer geringen Anzahl von wachsenden Kolonien (vermeintlichen Transduktanten). </li><li> Die Platte bei 37 ° C für 24 bis 48 Stunden. </li><li> Test Weitere die erzeugten Kolonien (Transduktanten) zum Widerstand durch die Kolonien auf neue BHI-Agarplatten mit 32 mg / l Chloramphenicol ergänzt übertragen. Bestätigen Sie die Anwesenheit des cfr - Gens durch Kolonie - PCR 7. </li></ol></li></ol> 3. Natürliche Transformation HINWEIS: Die natürliche Transformation Test in S. aureus wurde nach dem Verfahren in unserer früheren Studie 2 beschrieben durchgeführt. Das Derivat N315, N2-2.1 2, 7, wurde als Empfänger verwendet. In diesem Stamm wurde die sigH Locus dupliziert, um konstitutiv exprimieren Seufzen 2. Für detailed Verfahren, wie Seufzen-exprimierenden Kompetenz Varianten zu isolieren, finden Sie eine frühere Beschreibung 2. Wenn der Resistenzmarker übertragen werden Chloramphenicol nicht, pRIT-sigH (Cm R) verwendet werden SIGH auszudrücken, wie zuvor 2 beschrieben. Gereinigte Plasmid - DNA oder ganzen Extrakt aus cfr Erworben S. aureus COL-45 7 wird als Donor - DNA für die Transformation verwendet. <ol><li> Herstellung von Donor - DNA <ol><li> Kultivieren COL-45 über Nacht mit in einem 300 ml-Kolben bei 37 ° C schüttelnd enthaltend 50 ml TSB, ergänzt mit 32 mg / l Chloramphenicol. Kultur E. coli HST04 trägt pHY300 Plasmid (Tet R) , der das Plasmid für das Kontrollexperiment zu extrahieren. HINWEIS: HST04 (dam - / dcm -) fehlt die DNA Gene Methylase 13. Andere herkömmliche Stämme mit DNA Methylasen können auch nützlich seind, um die DNA-Donor herzustellen, weil die DNA-Methylierungsstatus nicht die Transformationseffizienz beeinflussen. Alternativ pT181 Plasmid aus dem S. aureus - Stamm gereinigt COL können auch 2 als positive Kontrolle für den Transformationsassay verwendet werden. </li><li> Sammle die Zellen durch Zentrifugation (8000 xg für 10 min bei 4 ° C). </li><li> Extrahieren Sie die Plasmide, die ein Plasmid-DNA-Extraktions-Kits oder einer herkömmlichen DNA-Reinigungsverfahren unter Verwendung der gesamten DNA zu reinigen. </li><li> Quantifizieren die gereinigte DNA von Spektrometer und halten sie bei 4 ° C bis zur Verwendung. HINWEIS: Verwenden Sie eine neue DNA-Präparation für die Transformation Assay, in der Regel weniger als eine Woche alt. Alte DNA-Präparate zu reduzieren, die Effizienz der Transformation. </li></ol></li><li> Transformation Test <ol><li> Kultur der Empfängerzelle (N2-2.1) über Nacht in 5 ml TSB bei 37 ° C unter Schütteln. </li><li> Übertragen 0,5 ml Übernachtkultur in ein 1,5-ml-Röhrchen. Precipitate , die Zellen durch Zentrifugation (10.000 × g für 1 min bei 4 ° C). </li><li> Suspend die Zellen mit 10 ml CS2 Medium in einem 50-ml-Tube. HINWEIS: CS2 Medium ist ein komplettes synthetisches Medium , das 2 in S. aureus Kompetenz für natürliche Transformation induziert (siehe die Zusammensetzung des Mediums in der Materialtabelle). Andere Standard - Labormedien, wie TSB oder BHI, sind nicht geeignet für die Transformation 2, 13. </li><li> Wachsen die Bakterien bei 37 ° C mit (180 Umdrehungen pro Minute), bis zur späten exponentiellen Phase Schütteln (ca. 8 h). </li><li> Ernte der Zellen durch Zentrifugation (5000 × g für 5 min bei 4 ° C). </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10 ml frischem Medium CS2. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; g gereinigter Plasmid oder Genom-DNA (Schritt 3.1.4) zu der Zellsuspension. Schütteln bei 37 ° C und 180 Upm für 2,5 Stunden. HINWEIS: Kürzere Inkubationszeiten mit DNA (&lt;2,5 h) führen zu geringeren transformationen Frequenzen. </li><li> Sammle die Zellen durch Zentrifugation (5000 × g für 5 min bei 4 ° C). </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10 ml BHI-Medium. Mischen der Zellsuspension mit 90 ml geschmolzenem BHI-Agar (55 ° C) Nahrungsergänzungsmittel mit 32 mg / l Chloramphenicol (oder 5 mg / L Tetracyclin in dem Kontrollexperiment). Gießen Sie die Mischung in die 90 mm Petrischalen. Geschwind kühl und lassen Sie die Agar verfestigt. </li><li> Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 2 Tage. </li><li> Replizieren erzeugten Kolonien (Trans) durch die Kolonien übertragen (unter Verwendung von Zahnstochern) auf neue BHI-Agar-Platten, die entsprechenden Antibiotika enthalten, ihre Widerstandseigenschaften zu bestätigen. Bestätigen Sie die erworbene Resistenz - Gen (cfr oder tetM) durch Kolonie - PCR - 7. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

<html> Diese Arbeit beschreibt die drei wichtigsten Methoden , um die HGT genetischen Determinanten im S. aureus zu studieren. Obwohl Transduktion und Konjugation seit Jahrzehnten untersucht wurde, wurde die Existenz der natürlichen Transformation erst vor kurzem 2 anerkannt. Somit ist S. aureus mit allen drei großen ausgestattet Modi von HGT und Testen alle von ihnen benötigt wird , um die mögliche Verbreitung Wege von genetischen Determinanten zu klären. Das Ziel dieser Arbeit ...

Staphylococcus aureus ist ein symbiotischer Gram-positive Bakterien, die die Haut und Nasenhöhle von Menschen und Tieren natürlich bewohnt. Diese Bakterienarten ist die häufigste Ursache von nosokomialen Infektionen in Krankenhäusern und medizinischen Einrichtungen. Darüber hinaus seine Fähigkeit, Widerstand gegen verschiedene antimikrobielle Verbindungen zu entwickeln, hat die Verwaltung der Infektionen durch dieses Bakterium in eine globale Besorgnis hervorgerufen hat. Zwei Hauptwege, die an der Verbreitung der Resistenz-Phänotypen sind bekannt: die klonale Verbreitung von resistenten Genotypen und die Verbreitung von genetischen Determinanten unter den bakteriellen Pool. Im Fall von S. aureus, verschiedene antibiotische Resistenzgene (sowie Virulenzdeterminanten) wurden gefunden mit mobilen genetischen Elementen (MGEs) 1 zugeordnet werden. Das Vorhandensein dieser Elemente in das Genom von S. aureus zeigt , dass die Übernahme und Übergabe von Genetic Material innerhalb der Bakterienpopulation könnte eine wichtige Rolle für S. aureus Anpassung und Entwicklung spielen. Transformation, Konjugation und Transduktion Phage: genetisches Material kann durch drei bekannte Mechanismen der HGT in Gram-positive Bakterien ausgetauscht werden. Transformation beinhaltet die Aufnahme von freier DNA. Zum Erwerb von Fremd-DNA, müssen Bakterienzellen eine besondere physiologische Phase zu entwickeln: die Kompetenz der Bühne. Wenn dieses Stadium erreicht ist, werden kompetente Zellen, die DNA in das Cytoplasma transportieren, neue genetische Determinanten erwerben. Im Fall von S. aureus, die Existenz von natürlichen Transformation kürzlich 2 nachgewiesen wurde. Im Einklang damit hat unsere Gruppe Licht auf die Relevanz der Expression des Seufzen Faktor Schuppen (ein kryptischer Faktor sekundäre Transkription Sigma) in der Kompetenz Stufe der Entwicklung und darüber , wie seine konstitutive Expression S. aureus von reachin fähig machtg die Kompetenz Stufe, die 2 für den Erwerb von resistenten Phänotypen durch natürliche Transformation ermöglicht. Konjugation ist ein Prozess, der die Übertragung von DNA aus einer lebenden Zelle (Spender) zu einem anderen (Empfänger). Beide Zellen müssen in direktem Kontakt sein, so dass die DNA ausgetauscht werden, während sie durch spezielle Strukturen geschützt werden, wie beispielsweise Rohre oder Poren. Der Transfer von DNA durch dieses Verfahren erfordert die konjugativen Maschinen. In S. aureus, ist der Prototyp konjugativen Plasmids PGO1, die den konjugativen Operon TraA 3 beherbergt. Phagentransduktion beinhaltet den Transfer von DNA von Zelle zu Zelle durch Bakteriophageninfektion und impliziert die Verpackung von bakterieller DNA, viraler DNA statt, in die Phagen-Capsid. Die meisten von S. aureus - Isolate werden von Bakteriophagen 1 lysogeniert. Bei Stressbedingungen kann Prophagen aus dem bakteriellen Genom herausgeschnitten werdene und Schalten in den lytischen Zyklus. Dies sind die drei bekannten Mechanismen für die DNA Übertragung in S. aureus. Es gibt einige zusätzliche Transfermechanismen, beispielsweise &quot;pseudo-Transformation&quot; 2 und Phagen-ähnlichen Systemen in der Übertragung von Pathogenitätsinseln 4. Vor kurzem berichteten eine Gruppe , dass &quot;Nanoröhren&quot; bei der Übertragung von zellulären Materialien beteiligt sind (einschließlich Plasmid - DNA) zwischen benachbarten Zellen 5, 6, aber ein Follow-up - Studie wurde von anderen Gruppen bisher nicht erschienen. Diese Arbeit stellt die notwendige Methodik HGT in S. aureus zu studieren , indem sie die drei wichtigsten Übertragungswege Adressierung Konjugation, Transduktion und natürliche Transformation. Die Ergebnisse mit diesen Methoden gewonnen wurden verwendet , um die Übertragung des cfr - Gen (Chloramphenicol / Florfenicol Widerstand) zu studieren , unterS. aureus - Stämme 7. Diese drei Techniken sind vielseitige Werkzeuge für die Untersuchung von MGE Übertragung in S. aureus.

<table><tbody><tr><td>Tryptische Sojabrühe (TSB)&nbsp;</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td>211825</tr><tr><td>Gehirn Herz Infusion (BHI)</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td>211059</tr><tr><td>Nährstoffbrühe Nr. 2</td><td>Oxoid</td><td>CM0067</td><td></td></tr><tr><td>Schafblut-Agar</td><td>Eiken Chemical Co., Ltd.</td><td>E-MR96</td><td>Tryptisches Soja-Agar zugesetzt mit 5% (v/v) Schafsblut laut Hersteller.&nbsp;</td></tr><tr><td>Agar-Pulver</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>010-08725</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat (Trinatriumcitrat-Dihydrat)</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>Celluloseester gerastert 0,45 &mu; L HAWG Filter</td><td>Merck Milipore</td><td>HAWG 02500</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12243</td><td></td></tr></tbody></table>

methodik für die studie des horizontalen gentransfers in<em&gt; staphylococcus aureus</em

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Ein wichtiges Merkmal der wichtigsten opportunistischen Humanpathogen Staphylococcus aureus ist seine außerordentliche Fähigkeit, schnell eine Resistenz gegen Antibiotika zu erwerben. Genomic Studien zeigen , daß S. aureus trägt viele Virulenz und Resistenzgene in mobilen genetischen Elementen befindet, was darauf hindeutet , dass der horizontale Gentransfer (HGT) spielt eine kritische Rolle in S. aureus Evolution. Jedoch eine vollständige und detaillierte Beschreibung der Methode zu untersuchen HGT in S. aureus verwendet noch fehlt, insbesondere in Bezug auf natürliche Transformation, die in diesem Bakterium kürzlich berichtet wurde. Diese Arbeit beschreibt drei Protokolle , die für die in vitro Untersuchung der HGT in S. aureus geeignet sind , Konjugation, Phagentransduktion und natürliche Transformation. Zu diesem Zweck das cfr - Gen (Chloramphenicol / Florfenicol Widerstand), die die Phenicolen verleiht, Lincosamides, Oxazolidinone, Pleuromutilinen und Streptogramin A (PhLOPSA) -Widerstand Phänotyp, verwendet wurde. Die Mechanismen , durch die S. aureus genetischen Materialien auf andere Stämme über zu verstehen ist wesentlich , um die schnelle Erfassung des Widerstands Begreifen und hilft , die Arten der Verbreitung berichtet in Überwachungsprogrammen oder zur weiteren Vorhersage der Ausbreitung Modus in der Zukunft zu klären.

Die hier dargestellten Ergebnisse wurden bereits veröffentlicht (aus Referenz 7 mit Zustimmung des Herausgebers angepasst). Wir untersuchten die möglichen Übertragungswege des GRR - Gen, das Linezolid Widerstand mit niedrigem Pegel bewirkt , und die Expression des PhLOPSA-Resistenz - Phänotyp 14, 15 in S. aureus - Stämme, durch drei Mechanismen der HGT zu untersuchen. <p class="jove_c...

Wir beschreiben hier drei verschiedene Protokolle für die in vitro Untersuchung der Konjugation, Transduktion, Transformation und natürliche in Staphylococcus aureus.

Methodik für die Studie des horizontalen Gentransfers in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine detaillierte Methodik zur Untersuchung der horizontalen Übertragung von DNA in Staphylococcus aureus bereitzustellen, indem die drei Haupttransferwege untersucht werden. Konjugation, Transduktion und natürliche Transformation. Bei dieser Methode geht es um den horizontalen Transfer von antibiotikaresistenten Genen in den humanen Krankheitserreger Staphylokokken aureus.Der Hauptvorteil der hier vorgestellten Techniken besteht darin, dass wir drei Hauptmodi des Transfers testen können, einschließlich der kürzlich entdeckten natürlichen genetischen Transformation. Das Verfahren wird von Le Thuy, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert. Bereiten Sie zu Beginn des Experiments fünf Milliliter Übernachtkultur des Spender- und des Empfängerbakteriums in tryptischer Sojabrühe vor. Oder TSB-Medium mit bzw. ohne 32 Milligramm pro Liter Chloramphenicol.Mit Schütteln bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag wird die optische Dichte der Übernachtkulturen auf eine mit frischem TSB-Medium umgestellt. Mischen Sie 0,5 Milliliter der Spenderkultur mit 0,5 Millilitern der Empfängerkultur.Und fügen Sie der Mischung einen Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS hinzu. Anschließend wird das Bakteriengemisch mit einem Vakuumpumpensystem auf eine 0,45 Mikrometer große Filtermembran übertragen. Legen Sie die Filtermembranen auf eine Agarplatte aus Schafblut.Inkubieren Sie die Platten einen Tag lang bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie die Filtermembran aus der Platte und hängen Sie sie in 10 Milliliter PBS. Wirbeln Sie die Mischung etwa eine Minute lang vor, um alle auf der Membran anhaftenden Bakterien zu sammeln.Führen Sie eine serielle 10-fache Verdünnung der Bakteriensuspension mit frischem TSB durch. 100 Mikroliter der 0, 10, 4 verdünnten Proben auf TSB-Agar auffüllen. Oder TSA-Platten, die mit 32 Milligramm pro Liter Chloramphenicol und acht Milligramm pro Liter Tetracyclin ergänzt werden, um Transkonjugate auszuwählen.100 Mikroliter der verdünnten Suspension mit acht Milligramm Tetracyclin pro Liter allein auf TSA-Platten auffüllen. Um die Gesamtzahl der Empfänger zu zählen. Nach der Inkubation werden doppelresistente Kolonien mittels Kolonie-PCR auf das Vorhandensein des CFR-Gens und ihre Empfindlichkeitsprofile analysiert.Bestimmen Sie das Antibiogramm durch Messung der minimalen Hemmkonzentrationen (MICs) geeigneter Antibiotika gemäß der Standard-Mikrodilutionsmethode oder der Scheibendiffusionsmethode. Das Suszeptibilitätsprofil der Transkonjutiere muss mit dem des Empfängers identisch sein. Mit Ausnahme von Chloramphenicol und anderen Verbindungen, die vom CFR-Gen betroffen sind.Um eine Tetracyclinresistenz auszuschließen, die durch den Spenderstamm entwickelt wurde. Bereiten Sie eine Übernachtkultur von N315-45 in fünf Millilitern Nährstoffbrühe vor, die mit 3,6 Millimolar Kalzium ergänzt wird. Bereiten Sie Subkulturen vor, indem Sie die Übernachtkultur um eins auf 1.000 in einem Endvolumen von 10 Millilitern in 50-Milliliter-Glasfläschchen verdünnen.Züchten Sie die Bakterien eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln, 180 Umdrehungen pro Minute. Bereiten Sie als nächstes eine Reihe von verdünnten Phagen MR83a in NB-Calciumchloridmedium vor. Geben Sie 20 Mikroliter des verdünnten Phagen in die Bakterienkultur.Bereiten Sie eine Kontrollkultur ohne Phageninfektion vor, die als Positivkontrolle für das Wachstum von Bakterienzellen dient. Anschließend züchten Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln bei 100 Umdrehungen pro Minute über Nacht. Wählen Sie am nächsten Tag ein oder zwei freigegebene Kulturfläschchen mit der höchsten Verdünnung des zugesetzten Phagen aus.Füllen Sie die Kulturen in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen um. Geben Sie 250 Mikroliter Chloroform in die Röhrchen und mischen Sie die Kultur gründlich, indem Sie sie umdrehen. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 5.000 mal G für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius.Füllen Sie die Überstände in frische Röhrchen um und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 Grad Celsius. Nährbrühe Agar-Medium zubereiten und in einem Wasserbad bei 55 Grad Celsius warm halten. Geben Sie autoklavierte 0,5 molare Calciumchloridlösung bis zu einer Endkonzentration von 3,6 Millimolar in das Medium.Gießen Sie es in 90-Millimeter-Petrischalen NB-Calciumchlorid-Platten. Bereiten Sie eine Übernachtkultur von N315 in fünf Millilitern NB-Calciumchlorid bei 37 Grad Celsius unter Schütteln vor. Am nächsten Tag geben Sie 10 Mikroliter der Nachtkultur in 200 Mikroliter NB-Calciumchlorid und verteilen Sie es gleichmäßig auf der NB-Calciumchloridplatte.Stoppen Sie das Verteilen, wenn die Oberfläche der Platte mit Flüssigkeit bedeckt ist. Lassen Sie den Teller dann fünf Minuten trocknen. Führen Sie eine serielle Verdünnung von eins bis 10 des zuvor zubereiteten Phagen mit NB-Calciumchlorid-Medium durch.Verteilen Sie drei Mikroliter jeder Phagenverdünnung auf die mit Bakterien bedeckte Platte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius. Zählen Sie am nächsten Morgen die Plaque-Zahlen und berechnen Sie den Phagentiter mit der folgenden Gleichung.Bereiten Sie die Übernachtkultur von N315, COL oder MU50 in fünf Millilitern NB-Calciumchlorid bei 37 Grad Celsius und Schütteln bei 180 Umdrehungen pro Minute vor. Nach der Übernachtkultur verdünnen Sie den Phagen in NB-Calciumchlorid auf 109 PFU pro Milliliter. Mischen Sie in einem 50-Milliliter-Glasfläschchen 500 Mikroliter Nachtkultur, 500 Mikroliter frisches NB-Calciumchlorid und einen Milliliter Phagen 109 PFU pro Milliliter.Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln bei 100 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten. Nach der Inkubation werden 50 Mikroliter 20%iges Trinatriumcitrat in die Kulturen gegeben. Setzen Sie das sanfte Schütteln für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius fort.Bereiten Sie den geschmolzenen Hirn-Herz-Aufguss oder BHI-Agar-Medium vor und bewahren Sie ihn in einem Wasserbad bei 55 Grad Celsius auf und behandeln Sie das Agar-Medium mit 32 Milligramm pro Liter Chloramphenicol. Füllen Sie dann die Bakterium-Phagen-Mischung in einen 100-Milliliter-Kolben um. Fügen Sie 50 Milliliter warmes BHI-Agar hinzu, das mit 32 Milligramm Chloramphenicol pro Liter ergänzt wird, und mischen Sie gut.Gießen Sie die Mischung in die 90-Millimeter-Petrischale. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius. Weiterhin werden die erzeugten Kolonien, die Transduktanten, auf Resistenz getestet, indem die Kolonien auf neue BHI-Agarplatten übertragen werden, die mit 32 Milligramm pro Liter Chloramphenicol ergänzt werden.Bestätigen Sie das Vorhandensein des CFR-Gens durch Kolonie-PCR. Kultivieren Sie die Empfängerzelle über Nacht in fünf Millilitern TSB bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Am nächsten Morgen werden 0,5 Milliliter der Nachtkultur in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.Fältitieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Suspendieren Sie dann die Zellen mit 10 Millilitern CS2-Medium in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes züchten Sie die Bakterien bei 37 Grad Celsius und schütteln bei 180 Umdrehungen pro Minute für acht Stunden bis zur späten exponentiellen Phase.Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern frischem CS2-Medium. Geben Sie 10 Mikrogramm gereinigtes Plasmid oder genomische DNA zur Zellsuspension.Schütteln Sie die Kultur mit 180 Umdrehungen pro Minute. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern BHI-Medium.Mischen Sie die Zellsuspension mit 90 Millilitern geschmolzenem BHI-Agar-Präparat mit 32 Milligramm pro Liter Chloramphenicol und fünf Mikrogramm pro Liter Tetracyclin im Kontrollexperiment. Gießen Sie die Mischung in die 90-Millimeter-Petrischalen und kühlen Sie sie schnell ab und lassen Sie den Agar fest. Replizieren Sie die Kolonien mit Zahnstochern auf Platten mit geeigneten Antibiotika, um ihre Resistenzeigenschaften zu bestätigen.Das Konjugationsprotokoll ist nützlich für die Übertragung innerhalb der Spezies, bei der Staphylococcus epidermidis als CFR-Spender verwendet wurde. Und als Empfänger wurde der Staphylococcus aureus N315-Stamm verwendet. Das Protokoll, das für die Übertragung zwischen den Spezies verwendet wird, liefert ähnliche Ergebnisse mit demselben konjugativen Vektor bei verschiedenen konjugativen Spendern.Dies ist die erste Arbeit, in der Details der natürlichen Transformation beschrieben werden. Die bereitgestellte Methodik wäre für den Forscher nützlich, um die Übertragung und Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen sowie die primäre Determinante beim humanen Krankheitserreger Staphylokokken aureus zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Cafini, F., et.al. Methodik zur Untersuchung des horizontalen Gentransfers bei Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die kompetenzinduzierte DNA-Aufnahme in Staphylococcus aureus durch natürliche Transformation. Ein Chloramphenicol-empfindlicher Stamm, der so entwickelt wurde, dass er konstitutiv einen Sigma-Faktor exprimiert, wird unter nährstofflimitierenden Bedingungen kultiviert, um die Kompetenz zu verbessern, und dann mit Spender-DNA inkubiert, die ein...

Kompetenzinduzierte DNA-Aufnahme in Staphylococcus aureus

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein Gen von Interesse auszuschalten, das an der Plasmidkonjugation beteiligt ist, und anschließend die Auswirkungen seiner Abwesenheit mit Hilfe von Paarungsassays zu analysieren. Die Funktion des Gens wird mit Hilfe von Deletions- oder Punktmutationen auf eine bestimmte Region seiner Sequenz weiter untersucht.

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

Mit dem Ziel, die Verhaltensweisen der verschiedenen bakteriellen konjugative DNA-Elemente unter verschiedenen Bedingungen zu verstehen, beschreiben wir ein Protokoll für die Unterschiede in der Konjugation Frequenz mit hoher Auflösung, einzuschätzen, wie effizient das Spender-Bakterium Konjugation initiiert.

Hochauflösende Vergleich der bakteriellen Konjugation Frequenzen

Hier beschrieben ist eine Methode zur Analyse von bakteriellen Genexpression in tierischem Gewebe auf zellulärer Ebene. Diese Methode bietet eine Ressource für das Studium der phänotypische Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation in Reaktion auf die Umwelt Gewebe während einer Infektion auftreten.

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Diese analytische Berechnungsplattform bietet praktische Anleitungen für Mikrobiologen, Ökologen und Epidemiologen, die sich für die Genomik der Bakterienpopulation interessieren. Insbesondere zeigte die hier vorgestellte Arbeit, wie man Folgendes durchführt: i) phylogenie-geführte Kartierung hierarchischer Genotypen; ii) frequenzbasierte Analyse von Genotypen; iii) Verwandtschafts- und Klonalitätsanalysen; iv) Identifizierung der Abstammungsdifferenzierung der akzessorischen Loci.

Heuristisches Mining von hierarchischen Genotypen und akzessorischen Genomloci in Bakterienpopulationen

Die Konjugation vermittelt den horizontalen Gentransfer, indem sie Plasmid-DNA über zwei verschiedene Zellen mobilisiert und so die Verbreitung nützlicher Gene erleichtert. Diese Arbeit beschreibt eine weit verbreitete Methode zur effizienten Detektion des konjugativen Plasmidtransfers, die auf der Verwendung von Differentialmarkern im konjugativen Plasmid, Spender und Empfänger basiert, um die Transkonjugation zu erkennen.

Nachweis eines horizontalen Gentransfers, der durch natürliche konjugative Plasmide in E. coli vermittelt wird

In diesem Manuskript stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Beurteilung des Überlebens von Antibiotika für Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus zur Verfügung, indem wir Plasmide in P. aeruginosa und S. aureus transformieren, um Reporterstämme zu erzeugen und phänotypische Varianten, wie z.B. Persistere, durch Zeitraffer-Epifluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen.

Zeitraffer-Epifluoreszenzmikroskopie: Bildgebung von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus : Heterogene Phänotypen

Protokolle für die Nutzung offenes System fließen Biofilmen mit Tropf Strömungsreaktoren und rotierenden Scheibe Reaktoren sind im Detail vorgestellt.

Die Verwendung von Drip Flow und Rotating Disk-Reaktoren für Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Murine Haut-und Weichteilinfektionen Infektionen Modell ist für die Beurteilung der Virulenz Funktion von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und dem Host-Immunreaktionen eingesetzt. Hier präsentierten wir eine subkutane Infektion Modell für Haut-und Weichteilinfektionen.

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Experimentelle Endokarditis Modell von Methicillin-resistenten<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) in Ratten

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