Die Verwendung von Drip Flow und Rotating Disk-Reaktoren für Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, bakterielle Biofilme unter geringer oder mäßiger Scherkraft unter Verwendung entweder eines Tropffluss-Biofilmreaktors oder eines rotierenden Scheibenreaktors anzuzüchten. Die Probenträger im Biofilmreaktor werden zunächst mit Bakterien beimpft und bei 37 Grad Celsius inkubiert, um den bakteriellen Zellen die Anheftung an die Wachstumsflächen zu ermöglichen. Sobald sich die Zellen an den Probenträgern angeheftet haben, wird ein Durchfluss von Wachstumsmedium gestartet, der eine Scherkraft erzeugt, die während der Biofilm-Entwicklung wirksam ist.

Ausgereifte Biofilme können anschließend zur Analyse gewonnen werden, um die Biofilme zu beobachten. Mithilfe der Rasterelektronenmikroskopie kann die Ultrastruktur der erzeugten Biofilme bestimmt werden. Ich bin Blaze Balls.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Durchflusskammern liegt darin, dass eine hohe Biomasseproduktion und die Erzeugung mehrerer identischer Biofilme leicht erreichbar sind. Die Demonstration dieses Verfahrens übernehmen Rachel Stevenson und Kelly Schwartz, eine Technikerin und eine Doktorandin aus meinem Labor. Der Tropffluss-Biofilmreaktor besteht aus vier Kammern mit Einlassöffnungen für das Medium und Auslassöffnungen für das Abflussmedium.

In jeder Kammer befindet sich ein entnehmbarer Probekörper, auf dem der Biofilm wächst. Um den Tropfströmungs-Biofilmreaktor zusammenzubauen, bringen Sie die Probekörper in jede parallele Kammer ein und befestigen Sie die Kammerdeckel. Autoklavieren Sie den montierten Reaktor sowie die Zulauf-Nährlösungsleitung, um das System vor der Verwendung zu sterilisieren.

Autoklavieren Sie außerdem das Biofilmmedium, um den sterilisierten Drip-Flow-Reaktor zu beimpfen. Stellen Sie die Apparatur auf eine ebene Fläche und klemmen Sie die Ablaufleitungen fest. Füllen Sie anschließend jede Kammer mit 10 Milliliter steriler, triptychsojahaft basierter Nährlösung und geben Sie 100 Mikroliter Staphylococcus aureus hinzu.

Übernacht-Kultur, die in dem gleichen Medium für jede Kammer separat angezogen wurde. Den beimpften Reaktor 18 Stunden lang in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator stellen, damit die Zellen an der Coupon-Oberfläche haften können. Nach der Inkubation den Ablaufschlauch mit einer UNC-Klemme verschließen und den Reaktor auf einen geneigten Holzblock mit einem Winkel von 10 Grad stellen. Aseptisch.

Schließen Sie die Nährlösungs-Schlauchleitung an eine Flasche mit kontinuierlich fließender Nährbrühe an. Führen Sie die Schlauchleitung durch die Pumpe und befüllen Sie den Schlauch, indem Sie die Pumpe auf voller Geschwindigkeit laufen lassen. Sobald die Schlauchleitung befüllt ist, stoppen Sie die Pumpe und befestigen Sie 22-Gauge-ein-Zoll-Nadeln an jedem Schlauchende.

Wischen Sie den Kammerinlet-Stöpsel mit einem Ethanol-Tupfer ab und arbeiten Sie aseptisch. Führen Sie die Nadeln durch den Inlet-Stöpsel ein. Schalten Sie die Pumpe ein und lassen Sie das Medium tropfenweise über die Coupons laufen.

Bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 125 Mikrolitern pro Minute sollte das Medium vom Inlet-Stöpselanschluss zum Ablaufanschluss nach unten fließen. Betreiben Sie den Reaktor drei Tage lang im Dauerfluss. Überprüfen Sie gelegentlich den Reaktor auf ordnungsgemäße Entwässerung.

Die Drainage wird durch visuelle Inspektion der Kammern überprüft, um sicherzustellen, dass sich das Medium nicht in den Kammern sammelt. Falls sich das Medium ansammelt, führt das Abklemmen der Ausflussleitung normalerweise zu einer ordnungsgemäßen Drainage. Um die Biofilme zu gewinnen, stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie die Nadeln aus dem Reaktor. Stellen Sie den Reaktor dann auf eine ebene Fläche.

Nach drei Tagen kontinuierlichen Flusses erscheinen Staphylococcus aureus-Biofilme als gelbe Biomasse, die sich entlang der Länge der inoculierten Coupons erstreckt. Ein Rasterelektronenmikrograf des Biofilms zeigt Staphylococcus aureus, die den Coupon in einer oberflächenassoziierten Biofilmgemeinschaft bedecken. Um die gewonnene Biomasse zu quantifizieren, verwenden Sie sterile Pinzette, um die Coupons aseptisch zu entfernen, ernten Sie die Bakterien mithilfe eines Zellkratzers und überführen Sie diese anschließend in ein kegelförmiges Reagenzglas, das fünf Milliliter sterile PBS enthält.

Homogenisieren Sie mithilfe eines Gewebes die bakteriellen Zellklumpen mit einem Homogenisator, bis eine gleichmäßige Suspension erhalten ist. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten wird durch Ausplattieren serieller Verdünnungen auf Triptych-sogar-Platten, die 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert werden, bestimmt, gefolgt von der Zählung der Kolonien. Der Rotationscheiben-Biofilmbioreaktor besteht aus einem Chemostaten, durch den Wachstumsmedium gepumpt wird.

Eine rotierende Scheibe mit einem Sternmixer und 18 Probenhaltern, die für die rotierende Scheibe konzipiert sind. Um den Reaktor zusammenzubauen, bringen Sie zunächst die Probenhalter in die Schlitze der rotierenden Scheibe ein. Danach setzen Sie die beladene Scheibe in einen einliterigen Glasbecher mit Überlaufanschluss ein und verschließen den Reaktor mit einem Gummistopfen Nummer 15, der ein Loch für den Medienfluss und ein Loch für die Belüftung aufweist.

Autoklavieren Sie den montierten Reaktor und die Zulaufschläuche, um das System zu sterilisieren. Um den Reaktor zu beimpfen, füllen Sie das Becherglas mit 250 Millilitern steriler Kulturmedien und geben 500 Mikroliter einer Übernachtkultur von Staphylococcus aureus hinzu, die in Triptisch-Soja-Brühe gezüchtet wurde. Stellen Sie den Reaktor auf ein Rührgerät, das auf 250 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist, und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 37 Grad Celsius, damit die Zellen an den Probenträgern haften können.

Nach der Übernacht-Inkubation schließen Sie den Zulaufschlauch an den Anschluss des Mediumreservoirs und an die peristaltische Pumpe an. Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie den Durchfluss auf 0,25 Milliliter pro Minute ein. Lassen Sie den Reaktor 24 Stunden bei 37 Grad Celsius laufen, um die entstehenden Biofilme zu gewinnen.

Stoppen Sie den Reaktor aseptisch. Entfernen Sie die Scheibe, ohne die Coupons zu berühren. Entfernen Sie die Coupons mit sterilen Pinzetten und tauchen Sie jeden vorsichtig in steriles PBS, um locker angeheftete Bakterien für die antimikrobielle Wirkstoffprüfung zu entfernen.

Aseptisch die Coupons in einzelne Vertiefungen einer 96-Loch-Platte geben, die die Substanzen von Interesse enthalten. Die Platte vier Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Coupons in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, die PBS 1× enthalten, und die Biofilme mithilfe eines Homogenisators dispergieren.

Abschließend werden serielle Verdünnungen der Zellen auf Nährboden-Agar ausplattiert, um die Anzahl lebensfähiger koloniebildender Einheiten pro Probe zu bestimmen, wie zuvor beschrieben. Dieses Diagramm zeigt die Anzahl koloniebildender Einheiten in Biofilmen, die mithilfe des Rotationscheibenreaktors hergestellt und Wasserstoffperoxid ausgesetzt wurden, wobei die Möglichkeit besteht, bis zu 18 identische Biofilme herzustellen. Durch die Verwendung des Rotationscheibenreaktors eignet sich diese Technik ideal für die Prüfung antimikrobieller Substanzen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Biofilme in Drip-Flow- und Rotating-Disc-Reaktoren betreibt. Diese Biofilmbioreaktoren bieten Alternativen zu Biofilmen in Flusszellen und Mikrotiterplatten und sind ideal, wenn eine hohe Menge an Biofilmbiomasse benötigt wird oder antimikrobielle Tests an etablierten Biofilmen durchgeführt werden sollen.