Die Verwendung von Drip Flow und Rotating Disk-Reaktoren für Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, bakterielle Biofilme unter geringer oder mittlerer Scherkraft zu züchten, wobei entweder ein Tropfstrom-Biofilmreaktor oder ein rotierender Scheibenreaktor verwendet wird. Coupons im Biofilm reagieren, indem sie zunächst mit Bakterien beimpft und bei 37 Grad Celsius inkubiert werden, damit die Bakterienzellen an den Wachstumsflächen haften können. Sobald sich die Zellen an die Coupons angeheftet haben, wird ein Fluss von Wachstumsmedien in Gang gesetzt, der eine schiere Kraft erzeugt, die während der Biofilmentwicklung wirkt.

Reife Biofilme können dann für die Analyse und Beobachtung der Biofilme entnommen werden. Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie kann die Ultrastruktur der erzeugten Biofilme bestimmt werden. Ich bin Blaze Balls.

Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden wie Durchflusszellen besteht darin, dass eine hohe Biomasseproduktion und mehrere identische Biofilme leicht erreicht werden können. Rachel Stevenson und Kelly Schwartz, eine Technikerin und Doktorandin aus meinem Labor, werden dieses Verfahren vorführen. Der Tropfstrom-Biofilmreaktor besteht aus vier Kammern mit Eingangsöffnungen für den Medieneintritt und Auslassöffnungen für den Abfallaustritt.

In jeder Kammer befindet sich ein herausnehmbarer Coupon, auf dem der Biofilm wächst. Um den Tropfstrom-Biofilmreaktor zusammenzubauen, legen Sie die Coupons in jede parallele Kammer und sichern Sie die Kammerdeckel. Autoklavieren Sie den zusammengebauten Reaktor sowie die fließenden Nährstoffschläuche, um das System vor der Verwendung zu sterilisieren.

Autoklavieren Sie auch das Biofilm-Wachstumsmedium, um den sterilisierten Tropfstromreaktor zu impfen. Stellen Sie das Gerät auf eine ebene Fläche und klemmen Sie die Abwasserleitungen fest. Füllen Sie anschließend jede Kammer mit 10 Millilitern sterilem Triptychon-Wachstumsmedium auf Sojabrühebasis und fügen Sie 100 Mikroliter Staphylococcus aureus hinzu.

Über Nacht im selben Medium gezüchtete Kultur in jede Kammer separat. Stellen Sie den inokulierten Reaktor für 18 Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, damit die Zellen an der Coupon-Oberfläche haften können. Nach der Inkubation klemmen UNC den Abwasserschlauch fest und platzieren Sie den Reaktor auf einem schrägen Holzblockschneider in einem Winkel von 10 Grad. Aseptisch.

Verbinden Sie den fließenden Nährstoffschlauch mit einer Flasche mit kontinuierlicher Nährstoffbrühe. Führen Sie die Schlauchleitung durch die Pumpe und entleeren Sie die Schläuche, indem Sie die Pumpe mit voller Geschwindigkeit laufen lassen. Sobald der fließende Schlauch grundiert ist, stoppen Sie die Pumpe und befestigen Sie 22-Gauge-1-Zoll-Nadeln am Ende jedes Schlauchs.

Wischen Sie den Einlassstopfen der Kammer mit einem Ethanoltuch aseptisch ab. Führen Sie die Nadeln durch den Einlaufstopfen. Schalten Sie die Pumpe ein und lassen Sie Medium über die Coupons tropfen.

Bei einer Durchflussrate von etwa 125 Mikrolitern pro Minute sollte das Medium von der Einlassstopfenöffnung nach unten zur Abwasseröffnung fließen. Betreiben Sie den Reaktor drei Tage lang im kontinuierlichen Durchfluss. Überprüfen Sie gelegentlich den Reaktor auf eine ordnungsgemäße Entwässerung.

Die Entwässerung wird durch eine Sichtprüfung der Kammern überprüft, um sicherzustellen, dass sich keine Medien in den Kammern ansammeln. Wenn sich das Medium ansammelt und einklemmt, fördert der Abflussschlauch in der Regel eine ordnungsgemäße Drainage, um die Biofilme zu ernten, die Pumpe zu stoppen und die Nadeln aus dem Reaktor zu entfernen. Stellen Sie dann den Reaktor auf eine ebene Fläche.

Nach drei Tagen kontinuierlichen Flusses erscheinen Staphylococcus aureus-Biofilme als gelbe Biomasse, die sich über die Länge der beimpften Coupons verteilt. Eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme des Biofilms zeigt, dass Staphylococcus aureus den Coupon in einer oberflächenassoziierten Biofilmgemeinschaft bedeckt. Um die erhaltene Biomasse zu quantifizieren, verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Coupons so septisch wie möglich zu entfernen, ernten Sie die Bakterien mit einem Zellschaber und übertragen Sie sie dann in ein konisches Röhrchen mit fünf Millilitern sterilem PBS.

Mit Hilfe eines Gewebes zerkleinert ein Homogenisator die Bakterienklumpen, bis eine gleichmäßige Suspension erhalten wird. Koloniebildende Einheiten werden quantifiziert, indem serielle Verdünnungen auf Triptychonplatten plattiert werden, die 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert werden und Kolonien gezählt werden. Der Biofilmreaktor mit rotierender Scheibe besteht aus einem Chemosstat, durch den das Wachstumsmedium gepumpt wird.

Eine sich drehende Scheibe mit einem Stern und 18 Coupons, die in die sich drehende Scheibe passen. Um den Reaktor zuerst zusammenzubauen, legen Sie die sich drehenden Scheiben-Coupons in die Schlitze der sich drehenden Scheibe ein. Legen Sie dann die geladene Scheibe in ein Ein-Liter-Glasbecherglas mit Überlauföffnung und verschließen Sie den Reaktor mit einem Gummistopfen Nummer 15 mit einem Loch für den Medienfluss und einem Loch für die Belüftung.

Autoklavier, den zusammengebauten Reaktor und den Einlassschlauch zur Sterilisation des Systems. Um den Reaktor zu beimpfen, füllen Sie das Becherglas mit 250 Millilitern sterilem Nährmedium und fügen Sie 500 Mikroliter einer Übernachtkultur von Staphylococcus aureus hinzu, die in Triptychon-Sojabrühe gezüchtet wurde. Stellen Sie den Reaktor auf eine Rührplatte, die auf 250 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist, und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 37 Grad Celsius, damit die Zellen an den Coupons haften können.

Verbinden Sie nach der Inkubation über Nacht den Einlassschlauch mit der Öffnung am Mediumreservoir und mit der Schlauchpumpe. Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie den Durchfluss auf 0,25 Milliliter pro Minute ein. Lassen Sie den Reaktor 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius laufen, um die entstehenden Biofilme zu ernten.

Stoppen Sie den Reaktor und zwar aseptisch. Entfernen Sie die Disc, ohne die Coupons zu berühren. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette die Coupons und tauchen Sie sie vorsichtig in steriles PBS, um lose anhaftende Bakterien für den Test antimikrobieller Verbindungen zu entfernen.

Legen Sie die Coupons aseptisch in die einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte ein, die die interessierenden Verbindungen enthalten. Inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie dann die Coupons in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, die einmal PBS enthalten, und dispergieren Sie die Biofilme mit einem Homogenisator.

Schließlich werden serielle Verdünnungen der Zellen auf Nähr-Agar-Medium plattiert, um die Anzahl der lebensfähigen koloniebildenden Einheiten pro Probe zu bestimmen, wie zuvor beschrieben. Dieses Diagramm zeigt die Anzahl der koloniebildenden Einheiten in Biofilmen, die mit dem Spinnscheibenreaktor hergestellt und Wasserstoffperoxid ausgesetzt wurden, die Fähigkeit, bis zu 18 identische Biofilme zu erzeugen. Durch die Verwendung des Spinning-Disc-Reaktors ist diese Technik ideal für die Prüfung antimikrobieller Verbindungen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Tropffluss- und rotierende Scheibenreaktor-Biofilme durchführt. Diese Biofilmreaktoren bieten Alternativen zu Durchflusszellen- und Mikrotiterplatten-Biofilmen und sind ideal, wenn eine große Menge an Biofilmbiomasse benötigt wird oder antimikrobielle Tests an etablierten Biofilmen gewünscht werden.