Einem mikrofluidischen System mit Oberflächenstrukturierung zur Untersuchung Kavitationsblase (e) -Cell Interaktion und die Resultierende Bioeffects auf der Ebene einzelner Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, kavitationsinduzierte Bioeffekte im mikrofluidischen Einschluss zu untersuchen, indem Oberflächenstrukturierung verwendet wird, um die Bildung von Tandemblasen sowie die Lage und Form der einzelnen Zielzellen präzise zu steuern. Dieses mikrofluidische System ermöglicht das Experimentieren mit diesem Transit, Kavitationsblasen und Zellen, die für die therapeutische und klangliche Veröffentlichung und den Klangbetrieb relevant sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Verbesserung der Präzision bei der Oberflächenstrukturierung.

Es ermöglicht uns, die Bioeffekte einzelner Zellen zu untersuchen und ist eine hohe Strombelastung durch zuverlässige Bubble-Bubble-Interaktion. Die visuelle Demonstration der Verfahren ist von entscheidender Bedeutung, da die Oberflächenstrukturierung und die Zellvorbereitung in den Chipschritten komplex sind und verschiedene Techniken und Spitzen erfordern. Führen Sie alle Mikrofabrikationsverfahren in einem Reinraum durch, während Sie einen Reinraumanzug tragen.

Gestalten Sie die Fläche jedes Goldpunktes innerhalb von 25 bis 30 Quadratmikrometern so, dass sie groß genug ist, um Laserenergie für die Blasenerzeugung zu absorbieren, aber klein genug, um zu vermeiden, dass einzelne Zellen daran haften. Reinigen Sie den Objektträger in einer chemischen Haube gemäß dem Textprotokoll und fahren Sie dann mit der Schleuderbeschichtungshaube fort. Programmieren Sie den Spin-Coder so, dass er über zwei Sekunden auf 1000 U/min beschleunigt und diese Geschwindigkeit fünf Sekunden lang beibehält, dann lassen Sie ihn über drei Sekunden auf 3000 U/min ansteigen und diese Geschwindigkeit 30 Sekunden lang beibehalten.

Befestigen Sie anschließend den Objektträger mit dem Vakuum am Spin-Coder. Decken Sie dann den Objektträger mit P20 ab und starten Sie den Schleudergang. Wenden Sie als Nächstes NFR-Negativlack im gleichen Zyklus an.

Nun die Folie auf einer heißen Platte bei 95 Grad Celsius 60 Sekunden backen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur führen Sie die Photolithographie durch. Montieren Sie die Chrommaske auf den Masken-Aligner und stellen Sie sicher, dass die Musterseite nach unten zum Schlitten zeigt.

Stellen Sie dann das Fotolithografie-Rezept auf den harten Belichtungsmodus mit neun Sekunden UV-Belichtung ein und richten Sie das Glassubstrat an der Maske aus. Nach der UV-Belichtung die Folie bei 95 Grad Celsius eine Minute lang backen und anschließend wie zuvor abkühlen lassen. Um das Muster auf der Folie zu entwickeln, legen Sie es für 60 Sekunden in die Entwicklerlösung, waschen Sie dann die Folie mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie mit Stickstoffgas.

Nachdem Sie das Muster durch mikroskopische Inspektion bestätigt haben, backen Sie den Objektträger fünf Minuten lang bei 120 Grad Celsius und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen. Reinigen Sie nun den Objektträger in der reaktiven Ionenätzmaschine 90 Sekunden lang mit Plasma bei 500 tor und 100 Watt. Kleben Sie die Probe mit einem E-Beam-Verdampfer auf den Plattenhalter.

Programmieren Sie die Maschine so, dass sie eine 5-Nanometer-Schicht aus Titan abscheidet, gefolgt von einer 15-Nanometer-Schicht aus Gold. Sobald diese Position abgeschlossen ist, lüften Sie die Maschine. Weichen Sie den Objektträger anschließend über Nacht in einem Becherglas mit Fotolackentfernungslösungsmittel ein, um das Gold zu entfernen, das auf dem NFR-Resist ruht.

Waschen Sie die Folie am nächsten Tag mit Aceton, anschließend mit IPA und trocknen Sie sie anschließend mit Stickstoff. Spülen Sie den Objektträger mit DI-Wasser ab und trocknen Sie ihn erneut mit Stickstoff ab. Erhitzen Sie die Rutsche nun fünf Minuten lang bei 115 Grad Celsius.

Reinigen Sie dann die Folie mit dem Goldpunktmuster 90 Sekunden lang mit einem Sauerstoffplasma-Ascher bei 100 Watt. Stellen Sie die Fläche jeder Fibronektin-kodierten Insel auf 700 bis 900 Quadratmikrometer ein, um eine angemessene Ausbreitung der Helazellen in einer quadratischen Region zu erleichtern und gleichzeitig die Wahrscheinlichkeit zu minimieren, dass sich mehrere Zellen auf der Insel ansammeln. Die Verarbeitung ist der des Goldmusters sehr ähnlich.

Schleudern Sie den Objektträger wie zuvor mit S18-positivem Fotolack und backen Sie die Codierung bei 115 Grad Celsius ein. Führen Sie dann eine Fotolithographie durch und richten Sie die Markierungen auf der Maske mit denen auf dem Substrat aus. Überprüfen Sie das Muster auf dem mittleren Teil, um den richtigen Winkel zu bestätigen, und passen Sie den Abstand von den goldenen Punkten zum H-Muster an.

Lassen Sie die UV-Belichtung neun Sekunden lang ohne Nachbacken laufen. Der nächste Unterschied besteht darin, dass der Entwicklungsschritt nur 45 Sekunden dauert. Für das reaktive Ionenätzen stellen Sie die Parimeter auf 500 bis 100 Watt und 90 Sekunden ein.

Tragen Sie dann einen Tropfen PLLG Peg Passivierungslösung auf ein Stück Paraffinfilm auf und sandwichen Sie die Lösung auf die Musterseite des Objektträgers. Vermeiden Sie das Einfangen von Blasen. Entfernen Sie nach 45 Minuten das Dia von der Folie.

Spülen Sie den Objektträger mit DI-Wasser ab und trocknen Sie ihn anschließend mit Stickstoff ab. Als nächstes tränken Sie den Objektträger nacheinander in Fotolackentferner 1165. Dann 50 Prozent 1165 in DI-Wasser.

Dann nur DI-Wasser. Rühren Sie die Lösung während jedes Bades 90 Sekunden lang in einem Ultraschallbad um. Trocknen Sie nun den Objektträger auf einer heißen Platte, verschließen Sie ihn dann in einem Exsikkator und lagern Sie ihn bei 4 Grad Celsius.

Montieren Sie die Objektträger zu einem Mikrokanal-Chip, wie im Textprotokoll beschrieben. Achten Sie sorgfältig darauf, den gemusterten Bereich des Glassubstrats mit der kleinen PDMS-Platte abzuschirmen, bevor Sie das reaktive Ionenätzen verwenden, um den PLLG-Stift aus dem peripheren Bereich zu entfernen. Nehmen Sie das gemusterte Glas aus der RIE-Maschine und entfernen Sie die kleine PDMS-Platte.

Nachdem Sie das Mikrokanal-PDMS mit einer reduzierten Dosis Sauerstoffplasma behandelt haben, richten Sie es unter einem Stereoskop auf das gemusterte Glassubstrat aus. Bringen Sie das Micro-Channel-PDMS und das gemusterte Glassubstrat in konformen Kontakt. Fahren Sie nun mit der Verwendung des Chips fort.

Zuerst wird der Chip grundiert, indem PBS 30 Minuten lang mit einem Mikroliter pro Minute durch den Mikrokanal fließt. Ziehen Sie dann den Chip 45 Minuten lang mit Fibronektinlösung bei gleicher Durchflussrate infundiert. Bereiten Sie die Zellen während des Wartens mit fünf Millionen Zellen pro Milliliter vor.

Ein gesunder Status und eine hohe Konfluenzdichte sind entscheidend für dieses Verfahren. Ersetzen Sie später die durch den Chip fließende Lösung durch PBS und erhöhen Sie die Durchflussrate auf zehn Mikroliter pro Minute. Lassen Sie das PBS fünf Minuten lang fließen.

Als nächstes injizieren Sie die vorbereiteten Zellen mit einer Spritze in den Chip. Wenn ein Tropfen aus dem Schlauch geflossen ist, stoppen Sie die Injektion und klemmen Sie den Auslass fest. Legen Sie den Chip dann für 30 Minuten in einen Inkubator.

Später geben Sie den Auslass frei und spülen den Chip fünf Minuten lang mit Zellkulturmedium mit zehn Mikrolitern pro Minute. Senken Sie den Durchfluss nach fünf Minuten auf 0,75 Mikroliter pro Minute und geben Sie den Chip und die Pumpe für zwei Stunden in einen Inkubator. Fahren Sie nach zwei Stunden mit der Tandem-Blasenerzeugung fort, indem Sie den Chip unter einem inversen Mikroskop mit zwei gepulsten NDI-Lasern betrachten, die auf das Goldpunktmuster gerichtet sind, und mit einer Hochgeschwindigkeitskamera, die bereit ist, die Ergebnisse zu erfassen.

Stellen Sie für 50-Mikron-Blasen die Verzögerung zwischen den beiden Lasern auf 2,5 Mikrosekunden und ihre Leistung auf zehn Mikrojoule ein. Synchronisieren Sie dann die Aufzeichnung der Hochgeschwindigkeitskamera mit den Lasern und machen Sie Aufzeichnungen mit zwei Millionen Bildern pro Sekunde und einer Belichtungszeit von 200 Nanosekunden. So wird die Dynamik der Blasenexpansion, der Kollaps-Blase-Wechselwirkung und der Jet-Bildung erfasst.

Bubble-Bubble-Wechselwirkungen und eine Vielzahl von kavitationsinduzierten Bioeffekten wurden auf Einzelzellebene mit der beschriebenen Technik untersucht, wie z.B. die transienten Wechselwirkungen von Tandemblasen mit der Jet-Formation, die Visualisierung des resultierenden Strömungsfeldes und die Berechnung der Jet-Geschwindigkeit. Die gerichtete Jetting-Strömung um die Tandemblase beträgt etwa zehn Meter pro Sekunde, ist etwa zehn Mikrometer breit und damit in der Lage, eine impulsive und lokalisierte Sierspannung und einen Stressgradienten auf nahe gelegenen Zielzellen zu erzeugen. Die durch Tandemblasen induzierte Zellmembrandeformation wurde ebenfalls untersucht.

Die Verformung und Wiederherstellung der Membran wird durch die Verdrängung funktionalisierter Kügelchen hervorgehoben, die an der Vorderkante der Zellmembran befestigt sind. Aus den Koordinaten einer Triade benachbarter Kügelchen wurde die lokale Flächendehnung berechnet. Dieses Schema zeigt die maximale Flächenänderung an verschiedenen Stellen auf der Zelloberfläche.

Die Vorderkante wird primär gedehnt, während die Hinterkante oder die Seitenseiten der Zelle zusammengedrückt werden, was auf Heterogenität und Zellverformung hinweist, die durch die Tandemblasen-induzierte Jetting-Strömung erzeugt werden. Die zeitliche Variation der Flächendehnung an der Zellvorderkante besteht aus einigen schnellen Oszillationen, gefolgt von einer großen und anhaltenden Dehnung für etwa 100 Mikrosekunden und einer anschließenden allmählichen Erholung auf einer Zeitskala von mehreren Millisekunden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine kontrollierbare Blasen-Blase-Wechselwirkung herstellen können, um die Bioeffekte einzelner Zellen mit kontrollierter Form und Position anhand von Oberflächenmustern zu untersuchen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Messungen wie die Ausdünnung des Zytoskeletts und die eheliche Bildgebung durchgeführt werden, um die Umlagerung des Zellzytoskeletts bei der Tandemblasenbehandlung zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik den Forschern auf dem Gebiet des subpretischen Ultraschalls den Weg ebnen, um durch Gefangenschaft induzierte Bioeffekte auf Einzelzellebene zu erforschen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, eine gute Zellkonfluenz und -bedingung für den Erfolg während der Zellmusterung aufrechtzuerhalten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reinraumchemikalien und Lasern äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einer Laserbrille getroffen werden sollten.