Name: Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Zellverformbarkeit verschiedener Zelltypen mit einem mikrofluidikbasierten Assay untersuchen. Diese Methode nutzt druckgetriebenen Fluss durch PDMS-Mikrokanäle und automatisierte Bildanalyse zur Hochdurchsatzmessung.

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Die Autoren bedanken sich bei Lloyd Ung für konstruktiven Input in frühen Versionen dieser Technik anerkennen, Dr. Jeremy Agresti für Druckdeckel Design-Tipps und Dr. Dongping Qi für seine Hilfe bei der Herstellung der Druckkappe. Wir sind dankbar, dass die Labors von M. und P. Teitell Gunaratne für die Bereitstellung einer Vielzahl von Zellproben zum Testen. Wir danken der National Science Foundation (Career Award DBI-1254185), der UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center und der UCLA klinische und translationale Wissenschaft Institut für die Unterstützung dieser Arbeit.

1. Mikrofluidik-Geräte-Design- HINWEIS: Das Gerätedesign hat vier grundlegende Funktionsbereiche: Eingangsöffnung, Zellenfilter, Verengung Array und Austrittsöffnung (Abbildung 1). Der Gesamtaufbau kann auf eine Vielzahl von Zelltypen angewendet werden, mit geringfügigen Anpassungen Dimensionen. Hier vorgesehen sind ein paar grundlegende Gestaltungsempfehlungen zusammen mit Geräteparameter, die wirksam für eine Auswahl von primären und immortalisierten Zellen sind. <ol><li> Wählen Sie die Breite der Verengung Anordnungskanäle (1B) auf etwa 30-50% des durchschnittlichen Zelldurchmesser ist; Diese Verengung zu Zelle Größenverhältnis führt zu erheblichen Zellverformung aber minimale Verstopfung. Bei einem Zelltyp, die zuvor nicht getestet wurde, ist es ratsam, eine Reihe von Verengung Breiten von ~ 30-50% Design der Zelldurchmesser, um die optimale Breite zu finden. Wie bei vielen Arten von mikrofluidischen Geräten können über 120 Gerätestammformen auf einer Sünde strukturiert werdenGLE 4 Zoll Silicium-Wafer, wodurch ein Array von unterschiedlichen Geräteausführungen in einem einzigen Herstellungsprozess hergestellt werden. </li><li> Wählen Sie die Kanalhöhe zumindest 50% der Zelldurchmesser ist; Dies gewährleistet die Zelle in 2 Dimensionen beschränkt. Um die Kanal Zusammenbruch während der Bindung zu verhindern, stellen Sie sicher, dass die Kanalseitenverhältnis ist nicht weniger als 1:10 (Höhe: Breite) in der gesamten Gerät. Für die Kanäle, die dieses Seitenverhältnis überschreiten darf, fügen Stützpfosten, um einen Zusammenbruch zu verhindern. Raumtragpfosten in einem Abstand, der mindestens das Zweifache der Zelldurchmesser, um Zellstrom nicht behindert wird. </li><li> Einen Filter in den Eintrittsöffnungen, um Schmutz zu entfernen und zu zerlegen Zellhaufen (Abbildung 1B). Anpassen der Größe und der Abstand der Filterstellen, so dass der Abstand zwischen den Stellen ungefähr gleich einem Zellendurchmesser ist. HINWEIS: Die untere Grenze der Strukturgröße ist durch die Auflösung, mit der die Lithographiemaske gedruckt eingestellt. Stellen Sie sicher, dass alle Funktionen innerhalb der reslösung Grenze durch die Maske Lieferanten festgelegt. </li></ol> 2. Lieferungen und Vorbereitung HINWEIS: Vor Beginn der Versuch, müssen die folgenden Punkte vorbereitet werden. Eine schematische Darstellung der gesamten Konfiguration ist in Abbildung 1 dargestellt. <ol><li> Herstellung der Gerätestamm Verwendung von Standardtechniken für lithographische Mikro 14,15. Überprüfen Sie, ob die Höhe der strukturierten Merkmale mit einem Profilometer. HINWEIS: Bei Master können leicht in einem Reinraum-Anlage hergestellt werden, haben einige Labors kostengünstig Lithografieverfahren zur Verwendung in einem Halb sauberen Umgebung entwickelten 16,17. </li><li> Bereiten Sie die Luftquelle für druckgetriebene Strömung mit einem Druckluftbehälter und die Abfolge der Luftregler und Armaturen (1A). <ol><li> Einrichtung einer Luftversorgungstank und Handregler. ANMERKUNG: Eine Zusammensetzung von 5% CO 2 in Luft unterhält eine ähnliche Umgebung wie ein typischer Zellkultur incubator, aber auch andere Gasgemische können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Einrichtung eines elektronisch gesteuerten Druckregler in-line mit dem Handregler. Verwenden einen elektropneumatischen Wandler zu regeln und eine stabile Druckabfall über den Kanal, mit Druckschwankungen von weniger als 2 kPa. Verwenden Sie den einfachen Code in LabVIEW geschrieben (Ergänzende Informationen) zur Eingabe der gewünschten Druck. HINWEIS: Der elektropneumatische Wandler verwendet eine interne Rückkopplungsschleife, um den Ventilausgangsdruck auf den vorgegebenen Druck in der mikrofluidischen Vorrichtung anpassen. </li><li> Einrichten einer Druckkammer, um eine Strömung der Zellsuspension zu fahren. Zusammenstellung eines Zellsuspensionskammer von einer Standard-Durchflusszytometer Rohr und einem maschinell bearbeiteten Kappe, die eine druckdichte Abdichtung an dem Rohr erzeugt. HINWEIS: Die Druckkammer Kappe enthält zwei Öffnungen: einen Einlass, der mit dem Druckluftbehälter verbunden ist, und einen Auslass, durch die Zellen fließt aus der Druckkammer in der Vorrichtung (Figure 2). </li></ol></li><li> Einrichten eines umgekehrten Mikroskop mit einer Kamera, die eine Erfassungsrate von mindestens 100 Bilder pro Sekunde, um Bilder von den Zellen durch die Verengung Array fließenden einzufangen ausgestattet. Schnittstelle wird die Kamera mit einem Video-Capture-Karte und einem Computer. </li><li> Wird eine Stammlösung des oberflächenaktiven Mittels 10% w / w Pluronic F-127 in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), wie die Zugabe einer geringen Menge an F127 zu dem Zellmedium Lösung wird zur Zelladhäsion an PDMS Wände minimieren. Um die F127-Lösung, Vortex und Wärme schonend bei 37 ° C vorbereiten, die F127 aufzulösen. Vor verwenden, übergeben Sie die Lösung durch einen 0,2 um Spritzenfilter und bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die Tensid-Lösung im Voraus als Vortex und Filter wird Blasen, die für mehr als 24 Stunden anhalten wird zu generieren. </li></ol> 3. Mikrofluidik-Geräte-Fertigung <ol><li> Herzustellen PDMS-Block mit mikrofluidischen Kanälen. <ol><li> Mix PDMS gründlich einTA-Verhältnis von 1:10 (w / w) Härter zur Basis. </li><li> Gießen Sie die Mischung über die Gerätestamm (Schritt 2.1). Degas in einer Glasglocke mit angelegtem Vakuum, bis die eingeschlossenen Blasen verschwinden, oder für ca. 10-20 min. HINWEIS: Nach dieser Zeit kann es immer noch Blasen an der Luft-PDMS-Schnittstelle, die normal zu sein; diese werden in der Regel während des Backens zu zerstreuen. Es ist sehr wichtig, sicherzustellen, daß es keine verbleibenden Blasen benachbart zu den Kanälen. </li><li> Backen das entgaste Gerät bei 65 ° C für 4 h. Um die Kanäle vor dem Kollaps zu verhindern, backen Sie das Gerät über Nacht zur weiteren Vernetzung der PDMS für ein Gerät mit einem höheren Elastizitätsmodul, die resistenter gegen Kanal-Zusammenbruch ist. Jedoch beachten, dass Back erweitert versprödet auch die PDMS und kann zu Rissbildung beim Stanzen Löcher (Schritt 3.3) führen. </li></ol></li><li> Mikrofluidik-Geräte zu entfernen aus der Urform. Schneiden einzelnen mikrofluidischen Bauteilen aus der PDMS-Block mit einer Rasierklinge und entfernen Sie das Gerät aus der Mastäh. Starten Sie durch leichtes Anheben aus einer Ecke des Geräts; langsam und sanftes Peeling, im Gegensatz zu Aufhebung der PDMS-Block gerade nach oben, reduziert die Belastung auf beiden PDMS und den Master. </li><li> Stanzlöcher in der PDMS-Gerät an Anschluss-Ports für den Zugriff zwischen Schlauch und Mikrokanäle erstellen. Erstellen Löcher mit einem Stanzbiopsie, und stanzen von der Kanalseite durch an der Außenseite der Vorrichtung. HINWEIS: Eine Biopsie Punch mit einer 0,75 mm Bohrung schafft Löcher, die Schnittstelle perfekt mit Polyetheretherketon (PEEK)-Schlauch (Außendurchmesser = 1/32 &quot;oder 0,79 mm) oder Polyethylenschlauch (PE-20, Außendurchmesser = 0,043&quot; oder 1,09 mm ). Verwenden Sie einen Ringlicht zu helfen, zu visualisieren Löcher in Geräten mit flachen Kanälen 18. Seien Sie sicher, dass die Biopsie Punch ist scharf; nach wiederholter Anwendung die Schnittkante abstumpft und die Biopsie Punch sollten entsorgt und ersetzt werden. </li><li> Spülen Sie die PDMS-Gerät mit Isopropanol (HPLC-Qualität), um Staub und Brocken eingereicht von PDMS zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass diegestanzten Löcher sind frei von Fremdkörpern, indem ein stetiger Strom von reinem Isopropanol aus einer Spritzflasche durch die Löcher. Föhnen mit gefilterter Luft. Nach der Reinigung Ort PDMS-Blöcke mit Kanälen nach oben in eine saubere Petrischale auf Sauberkeit Gerät zu erhalten. Falls erforderlich, speichern Geräte in dieser Form bis Bindung. </li><li> Reinigen Sie das Glassubstrat durch Spülen mit Methanol (HPLC-Qualität), föhnen mit gefilterter Luft, und auf eine 200 ° C Warmhalteplatte für 5-10 min, um sicherzustellen, das Glas ist absolut sauber und trocken vor der Plasmabehandlung. HINWEIS: Das Glassubstrat der Boden jeder Kanal bildet. Typischerweise ein Glasobjektträger genügt, da ein 10X oder 20X Ziel ist ideal zur Abbildung mehrere Kanäle parallel. Für eine höhere Auflösung Bildgebung, verbinden Sie das Gerät an einem Deckglas (# 1.5 Dicke). </li><li> Verbinden die PDMS-Gerät auf das Glassubstrat. <ol><li> Sauerstoffplasma-Behandlung der Kanalseite der PDMS-Block und 1 Seite eines Glasobjektträgers. HINWEIS: Wit einem Handabgabeeinheit, mit einem Behandlungszeit von 1 min, aber die Optimierung der Behandlungszeit für jedes Sauerstoff-Plasma-Vorrichtung. </li><li> Platzieren der Kanalseite der PDMS auf der behandelten Seite der Glas unmittelbar nach der Behandlung. </li><li> Halten Sie durch leichten Druck zusammen für ~ 10 Sekunden, um die Bindung zu fördern. Bake der gesamten Vorrichtung bei einer erhöhten Temperatur (60-80 ° C) für mindestens 15 min auf Haftfestigkeit zu verbessern. </li></ol></li></ol> 4. Verformen Zellen durch verengte Kanäle <ol><li> Überprüfen Sie die Mikrofluidik-Vorrichtung unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Kanäle nicht zusammengebrochen oder gebrochen ist und dass beide Einlass und Auslass Löcher sind direkt in die Gerätekanäle durch die Verwendung eines Low-Power-Objektiv (10-fach). Bestimmen Sie defekte Geräte, indem man die Oberfläche der PDMS mit einer Rasierklinge und für Experimente nutzen sie nicht. </li><li> Vorbereitung der Zellkulturproben, die untersucht werden. Kulturzellen unter Standardbedingungen. <ol><li> Foder beispielsweise Kultur HL-60-Zellen in RPMI-1640-Medium mit 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung und 10% fötalem Rinderserum und 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C ergänzt. </li><li> Für adhärenten Zellen, ernten sie durch Trypsinierung und resuspendieren in frischem Wachstumsmedium. Verwenden Sie ein Standard-Protokoll Trypsinierung; zum Beispiel, fügen ~ 0,5 ml Trypsin in einen Kolben mit 25 cm 2 Kulturbereich und resuspendieren in ~ 30 ml frischem Medium. Unterscheiden HL-60-Zellen in neutrophile Typ-Zellen von all-trans-Retinsäure (ATRA) in einer Endkonzentration von 5 uM pro 1 x 10 5 Zellen / ml, wie zuvor beschrieben 19,20. </li><li> Zentrifugation der Zellen bei 300 × g für 3 min, sorgfältig den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen an die entsprechende endgültige Dichte in frischem Kulturmedium mit 0,1% v / v F-127. </li></ol></li><li> Zählen Sie die Zellen mit einem Coulter Counter, Hämazytometer oder Durchflusszytometer. Einstellen der Zellsuspension in einer Dichte von 1 × 10 6 bis 5 × 10 <sbis&gt; 6 Zellen / ml. Sobald die Suspensionsdichte festgelegt ist, zu ergänzen, mit rund 0,1% v / v F-127. HINWEIS: Die Zelldichte und der Tensidkonzentration muss je nach den besonderen Zellsysteme modifiziert werden; Tabelle 1 stellt eine Aufzeichnung der zuvor verwendeten Konzentrationen an Zellen und F-127 für unterschiedliche Zelltypen. </li><li> Zeigen Zellsuspension in einem Durchflusszytometer Rohr und an der Druckkappe. Vor dem Anschluss der Schläuche an die Mikrofluidik-Vorrichtung, bis die Zellsuspension ergibt sich aus der Spitze der Schläuche den Druck auf ungefähr 14-21 kPa und bündig. Dies wird helfen, um Luftblasen in dem Schlauch und der Vorrichtung zu minimieren. </li><li> Führen Sie die Spitze des Schlauches, die die Zellsuspension in das Gerät Einlass. Wenn das Gerät mit einem Deckglas geklebt, stellen Sie das Gerät auf einer ebenen, festen Oberfläche wie dem Mikroskoptisch, bevor Sie den Schlauch; das Deckglas ist zerbrechlich und kann sonst brechen. </li><li> Legen Sie ein Stück Schlauch into der Ausgangsöffnung und Route in ein Leerrohr für Abfallsammel zB eine leere Falcon-Röhrchen auf der Seite des Mikroskoptisch geklebt. Konsistenz der Gesamtströmungswiderstand der Vorrichtung zwischen den Experimenten, dass der Einlass und der Auslass Schlauch ist mit dem gleichen Durchmesser und etwa die gleiche Länge für jedes Experiment. </li><li> Sanft Rampe den Druck auf etwa 28 kPa oder bis die Zellen durch die Kanäle fließen. Positionieren der Vorrichtung, so daß mehrere Kanäle in dem Sichtfeld und sind senkrecht zur Unterseite des Bildschirms. Wenn die Kamera durch Datengröße beschränkt ist, erwerben mehrere Videos, eine ausreichende Anzahl unabhängiger Datenpunkte zu erzeugen. Passen Sie die Bildrate für die gewünschten Datenausgabe wie nötig. Um Änderungen in der Zellform zu erfassen, verwenden Hochgeschwindigkeits-Imaging bei 300 Bildern pro Sekunde (fps); zu Laufzeiten von Zellen zu messen, verwenden Bildraten von etwa 100 fps. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Öffnen Sie die Datei Master_script.m (Herunterladbare Zusatz Datei) und starten Sie das Programm. </li><li> Wählen Sie das erste Video aus dem Windows-Explorer-Fenster, das angezeigt wird analysiert werden. Geben Sie die Framerate für das ausgewählte Video und drücken Sie die Eingabetaste. HINWEIS: Eine Figur wird angezeigt, dass der Benutzer aufgefordert, eine rechteckige Fenster Zuschneiden für das erste Video zu wählen. </li><li> Auswählen eines Fensters, das alle Kanäle von links nach rechts schneidet, umfasst und die Kanäle nur über den ersten Kolben der Anordnung von Kanälen an der Oberseite und Unterseite (3). </li><li> Wählen Sie die Regionen aus der Verengung zugeschnittene Bild. Achten Sie besonders auf eine feste Pixelabstand zwischen den oberen und unteren Fensterrand für jedes Video eingestellt zu halten. HINWEIS: Die obere Fensterkante gibt die oberste Verengung und unteren Fensterrand gibt die unterste Einschnürung (Abbildung 4); Zwischen Einschnürungen sind von dieser Benutzereingaben angenähert. Als nächstes zeigt die s der Algorithmusegmentation von Zellen für die ersten 50 Rahmen jedes Video (Bild 5). </li><li> Überwachen die linke obere Bild (5A) eng zu bestimmen, ob der Algorithmus genauen Lokalisieren Zellen; eine binarisierten Bild auf der Videoquelle überlagert, um die Position der identifizierten Zellen zu demonstrieren. HINWEIS: Die verschiedenen Fenster, (5B-5D) sind für die Code-Diagnose und zeigen die Videobilder nach bestimmten Bildverarbeitungsoperationen. </li><li> Wählen Sie das nächste Video aus dem Windows-Explorer-Fenster bearbeitet werden. HINWEIS: Der Algorithmus Wiederholen Sie die Schritte 5,2-5,5 für jedes Video ausgewählt. </li><li> Wählen Sie Abbrechen, wenn alle gewünschten Videos haben über die Windows-Explorer-Fenster hinzugefügt, um die Funktion, die die Video-Liste vollständig ist weisen. HINWEIS: Der Algorithmus wird die restlichen Operationen ohne Benutzereingriff durchführen. Dies wird etwa 1-2 Stunden dauern, abhängig von der Anzahl der Videos bearbeitet und Computer performance. Nach der Fertigstellung wird der Algorithmus ein Histogramm der Laufzeit-Daten zu erzeugen und speichern Sie die Daten im Verzeichnis als MATLAB .mat Datei und einer Microsoft Excel XLS-Datei. </li></ol>

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Hier bieten wir eine umfassende experimentelle Verfahren zur Analyse der Verformung von Zellen im Transit durch schnürt mikrofluidischen Kanälen mit druckgetriebenen Strömung. Ein MATLAB-Skript ermöglicht die automatisierte Datenverarbeitung (ergänzendes Material); eine aktualisierte Version des Codes eingehalten wird ( <a href="www.ibp.ucla.edu/research/rowat" target="_blank">www.ibp.ucla.edu/research/rowat</a> ). Im weiteren Sinne können die hier vorgestellten Techniken in vielen Zellbasis mikrofluidischen Tests angep...

Veränderungen in der Zellform kritisch in zahlreichen biologischen Kontext. Beispielsweise Erythrozyten und Leukozyten zu verformen durch die Kapillaren, die kleiner ist als ihre eigenen Durchmesser 1 sind. Bei der Metastasierung, müssen Krebszellen durch die engen Zwischenräume sowie gewundenen Gefäßsystem und lymphatischen Netze zu verformen, um an sekundären Standorten 2 Samen. Um das physikalische Verhalten einzelner Zellen zu untersuchen, präsentieren mikrofluidischen Systemen eine ideale Plattform, die individuell auf eine Reihe von Zellverhalten einschließlich ihrer Fähigkeit, durch enge Spalte 3 zu migrieren und zu passiv durch Mikrometermaßstab Verengungen 3 9 verformen studieren. Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrofluidik-Vorrichtungen optisch transparent sind, so dass Zellverformungen mittels Lichtmikroskopie sichtbar gemacht und unter Verwendung von Bildverarbeitungshilfsmittel analysiert werden. Darüber hinaus können Anordnungen von Verengungen genau definiert werden, wodurch Analyse von mehreren Zellen gleichzeitig mit einerDurch dass viele bestehende Techniken 10,11 übersteigt. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Versuchsprotokoll zur Sondierung Zelle Verformbarkeit mit der &quot;Handy-Deformer&quot; PDMS mikrofluidischen Vorrichtung. Die Vorrichtung ist so ausgelegt, dass die Zellen durch sequentielle Passage Einschnürungen; Diese Geometrie ist in physiologischen Zusammenhängen, wie beispielsweise Lungen Kapillarbett 12 gemeinsam. Um die Zell Verformbarkeit messen, bietet Laufzeit eine bequeme Metrik, die leicht als die Zeit für eine individuelle Zelle dazu, durch eine einzige Engstelle 4,6 erforderlich ist, gemessen. Um einen konstanten Druckabfall über die verengten Kanäle während der Zell Transit zu gewährleisten, verwenden wir druckgetriebenen Strömung. Unser Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Einrichtung Konstruktion und Herstellung, Betrieb der Vorrichtung durch Druck angetriebenen Strömungs, Aufbereitung und Darstellung von Zellen, als auch die Bildverarbeitung, um die Zeit für Zellen, die durch eine Reihe von Verengungen verformen messen. Wir sindbeide Geräteausführungen und Vision der Datenverarbeitung als Zusatzcode-Dateien. Als ein repräsentatives Beispiel von Daten, zeigen wir Zelldurchgangszeit durch eine Reihe von Verengungen in Abhängigkeit von der Anzahl der Einschnürungen agiert. Analyse der Zeitskala für Zellen Transit wenn schmale Verengungen einer mikrofluidischen Vorrichtung kann Unterschiede in der Verformbarkeit von einer Vielzahl von Zelltypen 4,5,13 offenbaren. Die hier gezeigte Gerät eindeutig blickt Zelle Transit durch eine Reihe von Mikrometermaßstab Einschnürungen; Dieses Design emuliert den gewundenen Weg, die Zellen zu erleben im Umlauf und ermöglicht auch zusätzliche Sondierung physikalischen Eigenschaften der Zellen, wie zB Entspannungszeit.

<table><tbody><tr><td>Pluronisches F-127 Block-Copolymer-Tensid&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>8409400</td><td>Hergestellt von BASF, auch über Sigma</td></tr><tr><td>PDMS erhältlich Basis- und Vernetzer</td><td>Essex Brownell</td><td>DC-184-1.1</td><td>Produkt, das allgemein als Sylgard 184 Elastomer</td></tr><tr><td>Oxygen Plasma Discharge Unit</td> bezeichnet <td>wird Enercon</td><td>Dyne-A-Mite 3D Treater</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0,75 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td>Fingertight Ferrule, 1/32"</td> <td>Upchurch Scientific</td><td>UP-F-113</td><td></td></tr><tr><td>Fingertight III Verschraubung, 10-32</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UP-F-300X</td><td></td></tr><tr><td>Polyetheretherketon (PEEK) Schlauch, Außendurchmesser = 1/32" oder 0,79 mm</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25M</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylen (PE-20) Schlauch, 0,043" oder 1,09 mm</td><td>Becton Dickinson 427406</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Druckregler</td><td>Airgas oder Praxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyurethan-Schlauch, 5/32" OD</td><td>McMaster Carr</td><td>5648K284</td><td></td></tr><tr><td>Steckverschraubungen</td><td>McMaster Carr</td><td>5111K91</td><td></td></tr><tr><td>Elektropneumatischer Spannungs-Druck-Wandler Omega</td><td></td><td>IP413-020</td><td></td></tr><tr><td>16 Bit, 250 kS/S, 80 Analogeingänge Multifunktions-Datenerfassung</td><td>National Instruments</td><td>NI PCI 6225-779295-01</td><td></td></tr><tr><td>Analogsteckverbinder Block-Schraubklemme</td><td>National Instruments</td><td>SCB-68-776844-01</td><td></td></tr><tr><td>LabView-Systemdesign-Software</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB-Software</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td>Für den MATLAB R2012a-Code</td><td>ist die Image Processing Toolbox</td></tr><tr><td>Shielded</td><td>Cable von National Instruments</td><td>SHC68-68</td><td></td></tr> erforderlich</tbody></table>.

ein mikrofluidiktechnik to cell verformbarkeit sonde

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Hier werden wir ausführlich die Konstruktion, Herstellung und Verwendung von Mikrofluid-Vorrichtung, um die Verformbarkeit der eine große Anzahl von einzelnen Zellen in einer effizienten Weise zu bewerten. Typischerweise können Daten für ~ 10 2 Zellen in einem 1 h Experiment gewonnen werden. Ein automatisiertes Bildanalyseprogramm ermöglicht die effiziente Post Experiment Analyse von Bilddaten, so dass die Verarbeitung innerhalb weniger Stunden zu sein. Unsere Vorrichtung Geometrie ist einzigartig, da Zellen müssen durch eine Reihe von Mikrometermaßstab Einschnürungen zu verformen, wodurch die anfängliche Verformung und zeitabhängige Relaxation von einzelnen Zellen, die untersucht werden. Die Anwendbarkeit dieses Verfahrens auf die menschliche promyelozytische Leukämie (HL-60-Zellen) nachgewiesen wird. Fahren Zellen durch Mikrometermaßstab Verengungen mit druckgetriebenen Strömung verformen, beobachten wir, dass die menschliche Promyelozyten (HL-60-Zellen) kurzzeitig verschließen die erste Engstelle für eine mittlere Zeit von 9,3 ms vor schneller Passage durch die nachfolgenden constrictIonen mit einer mittleren Laufzeit von 4,0 ms pro Verengung. Dagegen all-trans-Retinsäure-behandelten (Neutrophile-Typ) HL-60-Zellen zu verschließen, die erste Einschnürung für nur 4,3 ms vor Passage durch die nachfolgenden Einschnürungen mit einer mittleren Durchgangszeit von 3,3 msec. Diese Methode kann Einblick in die viskoelastischen Eigenschaften von Zellen zu schaffen, und schließlich zeigen die molekularen Ursachen für dieses Verhalten.

Um die Verformbarkeit der verschiedenen Zelltypen, Menschen myeloischen Leukämie-Zellen (HL-60), differenziert neutrophilen Zellen, Maus-Lymphozyten-Zellen und menschlichen Eierstockkrebszelllinien (OVCAR8, HEYA8) untersuchen werden mit der &quot;Handy-Deformer&quot; Mikrofluidik-Technik ausgewertet. Repräsentative Ergebnisse für die Laufzeit des HL-60 und Neutrophilen-Typ HL-60-Zellen zeigen den Zeitplan für eine einzelne Zelle dazu, durch eine Reihe von Engstellen, wie in Abbildung 6 dargestellt. Lauf...

Wir zeigen eine Mikrofluidik-basierten Assay, um die Zeitskala für Zellen für den Transit durch eine Sequenz von Mikrometermaßstab Verengungen zu messen.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Verformbarkeit verschiedener Zelltypen mithilfe eines einfachen, auf Mikrofluidik basierenden Assays zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem ein mikrofluidisches Gerät aus Polydimethylsiloxan oder PDMS hergestellt wird, um die Zeitskala des Zelltransits durch eine Abfolge mikrometergroßer Einschnürungen zu untersuchen. Anschließend wird ein druckgetriebener Fluss verwendet, um die Zellen durch die mikrofluidischen Kanäle zu bewegen, wodurch die Verformung und die zeitabhängige Relaxation einzelner Zellen analysiert werden können. Danach wird das automatisierte Bildanalyseprogramm ausgeführt, um die Videos zu verarbeiten und ein Histogramm der Transitzeitdaten zu erhalten.Die Ergebnisse zeigen, dass verschiedene Zelltypen Unterschiede in der Zellverformbarkeit aufweisen, die auf ihrer Durchtrittszeit durch eine Reihe von Einschnürungen basieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Rasterkraftmikroskopie oder der Mikropipettenaspiration besteht darin, dass mikrofluidische Vorrichtungen mit hohen Durchsatzkapazitäten erfolgreich arbeiten können. Während auch andere mikrofluidische Vorrichtungen zur Bestimmung der Zelldeformierbarkeit verwendet werden können.Wir gestalten unser Gerät so, dass die Zellen nacheinander durch enge Stellen hindurchtreten, eine Geometrie, die in physiologischen Zusammenhängen wie beispielsweise im Lungenkapillarbett häufig vorkommt. Beginnen Sie damit, das mikrofluidische Gerät zu entwerfen, indem Sie die Breite der Kanäle im Engstellen-Array auf etwa 30 bis 50 % des durchschnittlichen Zelldurchmessers und die Kanalhöhe auf mindestens 50 % des Zelldurchmessers festlegen. Fügen Sie an den Einlassöffnungen einen Filter ein, um Verunreinigungen zu entfernen und Zellaggregate aufzulösen.Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, fertigen Sie den Gerätemaster mithilfe standardmäßiger Verfahren für die lithografische Mikrozerspanung an. Überprüfen Sie die Höhe der strukturierten Merkmale mit einem Profilometer. Schließen Sie anschließend die Luftquelle für den druckgetriebenen Durchfluss unter Verwendung eines Druckluftbehälters sowie einer Reihe von Luftreglern und Armaturen wieder instand.Richten Sie zuerst einen Druckluftbehälter und einen manuellen Druckregler ein. Schließen Sie dann einen elektronisch gesteuerten Druckregler in Reihe mit dem manuellen Regler an. Geben Sie mithilfe des einfachen in LabVIEW geschriebenen Codes den gewünschten Druck ein.Der elektropneumatische Wandler verwendet eine interne Rückkopplungsschleife, um den Auslassdruck des Ventils so einzustellen, dass er dem vorgegebenen Druck über der mikrofluidischen Vorrichtung entspricht. Richten Sie eine unter Druck stehende Kammer ein, um den Durchfluss der Zellsuspension anzutreiben, indem Sie eine Zellsuspensionskammer aus einem Standard-Flusszytometrie-Röhrchen und einer gefrästen Kappe zusammenbauen, die eine druckdichte Abdichtung am Röhrchen erzeugt. Die Druckkammerkappe weist zwei Öffnungen auf: einen Einlass, der mit dem Drucklufttank verbunden ist, und einen Auslass, durch den die Zellen aus der Druckkammer in die Vorrichtung strömen.Als Nächstes richten Sie ein umgekehrtes Mikroskop mit einer Kamera ein, die eine Aufnahmegeschwindigkeit von mindestens 100 Bildern pro Sekunde aufweist. Um Bilder der Zellen aufzunehmen, die durch das Konstriktions-Array fließen, bereiten Sie anschließend eine Stammlösung eines Tensids in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS vor, da das Hinzufügen einer geringen Menge Tensid zur Zellkulturmedienlösung hilft, die Zelladhäsion an den PDMS-Wänden zu minimieren. Um den PDMS-Block mit mikrofluidischen Kanälen herzustellen, geben Sie ein Gramm Härter zu 10 Gramm PDMS-Basis hinzu und mischen gründlich.Geben Sie die Mischung über das Gerät. Entgasen Sie gründlich in einer Vakuumglocke unter angelegtem Vakuum, bis die eingeschlossenen Blasen verschwunden sind, oder etwa 10 bis 20 Minuten lang. Nach dieser Zeit können an der Grenzfläche zwischen LUFT und PDMS dennoch Blasen vorhanden sein, was normal ist.Diese verflüchtigen sich in der Regel während des Backvorgangs. Anschließend das Entgasungsgerät nach dem Abkühlen vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius backen. Die mikrofluidischen Geräte aus der Urform entfernen.Heben Sie zunächst vorsichtig eine Ecke des Geräts an. Ein langsames und sanftes Ablösen, anstatt den PDMS-Block direkt nach oben zu heben, verringert die Belastung sowohl für den PDMS als auch für den Master. Schneiden Sie einzelne mikrofluidische Geräte mit einer Rasierklinge aus dem PDMS-Block aus und entfernen Sie das Gerät vom Master. Stanzen Sie Löcher in das PDMS-Gerät, um Anschlussports für die Verbindung zwischen Schlauchleitungen und Mikrokanälen zu schaffen. Erstellen Sie die Löcher von der Kanalseite durch bis zur äußeren Seite des Geräts mithilfe einer Biopsiepresse.Spülen Sie das PDMS-Gerät mit Isopropanol, um Staub und lose PDMS-Stücke zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die gestanzten Löcher frei von Rückständen sind, indem Sie einen gleichmäßigen Strom reinen Isopropanols aus einer Druckflasche durch die Löcher leiten. Mit filtrierter Luft trockenblasen.Reinigen Sie das Glas-Substrat, indem Sie es mit Methanol spülen. Danach mit filtrierter Luft abblasen und für fünf bis zehn Minuten auf eine 200 Grad Celsius heiße Heizplatte legen, um sicherzustellen, dass das Glas vor der Plasma-Behandlung vollständig sauber und trocken ist. Wie im Textprotokoll beschrieben, das mikrofluidische Gerät unter einem Mikroskop untersuchen.Stellen Sie sicher, dass die Kanäle nicht eingeknickt oder beschädigt sind und dass sowohl die Einlass- als auch die Auslassöffnungen direkt mit den Kanälen des Geräts verbunden sind, indem Sie ein Objektiv mit niedriger Vergrößerung verwenden. Geben Sie die Zellsuspension in ein Durchflusszytometrieröhrchen und verbinden Sie es mit der Druckkappe, bevor Sie den Schlauch mit dem mikrofluidischen Gerät verbinden. Stellen Sie den Druck auf etwa 14 bis 21 Kilopascal ein und spülen Sie, bis die Zellsuspension aus der Schlauchspitze austritt. Danach stellen Sie das Gerät auf eine ebene Fläche, um den Schlauch in den Geräteeinlass einzuführen.Da die Glasdeckenscheibe, die an der Unterseite des PDMS-Geräts befestigt ist, zerbrechlich ist, führen Sie die Spitze des Schlauchs, der die Zellsuspension enthält, in den Eingang des Geräts ein. Führen Sie anschließend ein Stück Schlauch in den Auslassanschluss ein und leiten Sie ihn in ein leeres Röhrchen zur Sammlung von Abfall, beispielsweise ein leeres Falcon-Röhrchen, das an der Seite des Mikroskoptischs mit Klebeband befestigt ist.Erhöhen Sie den Druck vorsichtig auf etwa 28 Kilopascal oder bis die Zellen durch die Kanäle fließen. Positionieren Sie das Gerät so, dass mehrere Kanäle im Sichtfeld liegen und senkrecht zum unteren Bildschirmrand verlaufen. Öffnen Sie zur Beginn der Datenanalyse die Master-Skript-m-Datei und führen Sie das Programm aus.Wählen Sie das erste zu analysierende Video aus dem erscheinenden Windows-Explorer-Fenster aus. Geben Sie die Bildfrequenz für das ausgewählte Video an und drücken Sie die Eingabetaste. Es erscheint eine Abbildung, die den Benutzer auffordert, ein rechteckiges Ausschneidefenster auszuwählen.Wählen Sie für das erste Video ein Fenster, das alle Kanäle von links nach rechts umfasst und die Kanäle knapp oberhalb der ersten Birne des Kanalarrays schneidet. Wählen Sie oben und unten die Konstriktionsbereiche aus dem zugeschnittenen Bild aus. Der Algorithmus zeigt die Segmentierung der Zellen für die ersten 50 Bilder jedes Videos an.Überwachen Sie das obere linke Bild genau, um festzustellen, ob der Algorithmus die Zellen korrekt lokalisiert. Ein ized-Bild wird über das Quellvideo gelegt. Um die Position der identifizierten Zellen zu demonstrieren, wählen Sie das nächste zu verarbeitende Video im Windows-Explorer-Fenster aus.Der Algorithmus wird sich wiederholen. Für jedes ausgewählte Video wählen Sie „Abbrechen“. Sobald alle gewünschten Videos über das Windows-Explorer-Fenster hinzugefügt wurden, um die Funktion anzuweisen, dass die Videoliste vollständig ist, zeigen die repräsentativen Ergebnisse für die Transitzzeit von HL-60- und neutrophilen HL-60-Zellen den zeitlichen Maßstab für den Durchtritt einer einzelnen Zelle durch eine Reihe von Einschnürungen.Die Zeit wird für eine Population einzelner Zellen an jeder sieben Mikrometer messenden Einschnürung in einer Reihe von sieben Einschnürungen gemessen. Bei einem Druck von 28 Kilopascal verstopfen HL-60-Zellen vorübergehend die erste Einschnürung für eine mediane Dauer von 9,3 Millisekunden, bevor sie sich durch die nachfolgenden Einschnürungen verpacken. Im Gegensatz dazu verstopfen neutrophile HL-60-Zellen die erste Einschnürung nur für 4,3 Millisekunden, bevor sie sich verpacken.Nachdem die Zellen die erste Engstelle passiert haben, durchlaufen sie die verbleibenden Engstellen zwei bis sieben schneller, mit einer medianen Durchtrittszeit von 4,0 Millisekunden für HL-60-Zellen und 3,3 Millisekunden für neutrophile Zellen. Durch den Vergleich der Durchtrittszeiten zwischen Zellpopulationen können Unterschiede in der Zelldeformierbarkeit aufgezeigt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Deformierbarkeit verschiedener Zelltypen mithilfe des einfachen mikrofluidischen Assays gemessen wird.Hier wird eine druckgetriebene Strömung verwendet, um Zellen durch mikrofluidische Kanäle zu leiten, wodurch die Deformation und Relaxation einzelner Zellen analysiert werden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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