Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Verformbarkeit verschiedener Zelltypen mithilfe eines einfachen, auf Mikrofluidik basierenden Assays zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem ein mikrofluidisches Gerät aus Polydimethylsiloxan oder PDMS hergestellt wird, um die Zeitskala des Zelltransits durch eine Abfolge mikrometergroßer Einschnürungen zu untersuchen. Anschließend wird ein druckgetriebener Fluss verwendet, um die Zellen durch die mikrofluidischen Kanäle zu bewegen, wodurch die Verformung und die zeitabhängige Relaxation einzelner Zellen analysiert werden können. Danach wird das automatisierte Bildanalyseprogramm ausgeführt, um die Videos zu verarbeiten und ein Histogramm der Transitzeitdaten zu erhalten.

Die Ergebnisse zeigen, dass verschiedene Zelltypen Unterschiede in der Zellverformbarkeit aufweisen, die auf ihrer Durchtrittszeit durch eine Reihe von Einschnürungen basieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Rasterkraftmikroskopie oder der Mikropipettenaspiration besteht darin, dass mikrofluidische Vorrichtungen mit hohen Durchsatzkapazitäten erfolgreich arbeiten können. Während auch andere mikrofluidische Vorrichtungen zur Bestimmung der Zelldeformierbarkeit verwendet werden können.

Wir gestalten unser Gerät so, dass die Zellen nacheinander durch enge Stellen hindurchtreten, eine Geometrie, die in physiologischen Zusammenhängen wie beispielsweise im Lungenkapillarbett häufig vorkommt. Beginnen Sie damit, das mikrofluidische Gerät zu entwerfen, indem Sie die Breite der Kanäle im Engstellen-Array auf etwa 30 bis 50 % des durchschnittlichen Zelldurchmessers und die Kanalhöhe auf mindestens 50 % des Zelldurchmessers festlegen. Fügen Sie an den Einlassöffnungen einen Filter ein, um Verunreinigungen zu entfernen und Zellaggregate aufzulösen.

Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, fertigen Sie den Gerätemaster mithilfe standardmäßiger Verfahren für die lithografische Mikrozerspanung an. Überprüfen Sie die Höhe der strukturierten Merkmale mit einem Profilometer. Schließen Sie anschließend die Luftquelle für den druckgetriebenen Durchfluss unter Verwendung eines Druckluftbehälters sowie einer Reihe von Luftreglern und Armaturen wieder instand.

Richten Sie zuerst einen Druckluftbehälter und einen manuellen Druckregler ein. Schließen Sie dann einen elektronisch gesteuerten Druckregler in Reihe mit dem manuellen Regler an. Geben Sie mithilfe des einfachen in LabVIEW geschriebenen Codes den gewünschten Druck ein.

Der elektropneumatische Wandler verwendet eine interne Rückkopplungsschleife, um den Auslassdruck des Ventils so einzustellen, dass er dem vorgegebenen Druck über der mikrofluidischen Vorrichtung entspricht. Richten Sie eine unter Druck stehende Kammer ein, um den Durchfluss der Zellsuspension anzutreiben, indem Sie eine Zellsuspensionskammer aus einem Standard-Flusszytometrie-Röhrchen und einer gefrästen Kappe zusammenbauen, die eine druckdichte Abdichtung am Röhrchen erzeugt. Die Druckkammerkappe weist zwei Öffnungen auf: einen Einlass, der mit dem Drucklufttank verbunden ist, und einen Auslass, durch den die Zellen aus der Druckkammer in die Vorrichtung strömen.

Als Nächstes richten Sie ein umgekehrtes Mikroskop mit einer Kamera ein, die eine Aufnahmegeschwindigkeit von mindestens 100 Bildern pro Sekunde aufweist. Um Bilder der Zellen aufzunehmen, die durch das Konstriktions-Array fließen, bereiten Sie anschließend eine Stammlösung eines Tensids in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS vor, da das Hinzufügen einer geringen Menge Tensid zur Zellkulturmedienlösung hilft, die Zelladhäsion an den PDMS-Wänden zu minimieren. Um den PDMS-Block mit mikrofluidischen Kanälen herzustellen, geben Sie ein Gramm Härter zu 10 Gramm PDMS-Basis hinzu und mischen gründlich.

Geben Sie die Mischung über das Gerät. Entgasen Sie gründlich in einer Vakuumglocke unter angelegtem Vakuum, bis die eingeschlossenen Blasen verschwunden sind, oder etwa 10 bis 20 Minuten lang. Nach dieser Zeit können an der Grenzfläche zwischen LUFT und PDMS dennoch Blasen vorhanden sein, was normal ist.

Diese verflüchtigen sich in der Regel während des Backvorgangs. Anschließend das Entgasungsgerät nach dem Abkühlen vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius backen. Die mikrofluidischen Geräte aus der Urform entfernen.

Heben Sie zunächst vorsichtig eine Ecke des Geräts an. Ein langsames und sanftes Ablösen, anstatt den PDMS-Block direkt nach oben zu heben, verringert die Belastung sowohl für den PDMS als auch für den Master. Schneiden Sie einzelne mikrofluidische Geräte mit einer Rasierklinge aus dem PDMS-Block aus und entfernen Sie das Gerät vom Master. Stanzen Sie Löcher in das PDMS-Gerät, um Anschlussports für die Verbindung zwischen Schlauchleitungen und Mikrokanälen zu schaffen. Erstellen Sie die Löcher von der Kanalseite durch bis zur äußeren Seite des Geräts mithilfe einer Biopsiepresse.

Spülen Sie das PDMS-Gerät mit Isopropanol, um Staub und lose PDMS-Stücke zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die gestanzten Löcher frei von Rückständen sind, indem Sie einen gleichmäßigen Strom reinen Isopropanols aus einer Druckflasche durch die Löcher leiten. Mit filtrierter Luft trockenblasen.

Reinigen Sie das Glas-Substrat, indem Sie es mit Methanol spülen. Danach mit filtrierter Luft abblasen und für fünf bis zehn Minuten auf eine 200 Grad Celsius heiße Heizplatte legen, um sicherzustellen, dass das Glas vor der Plasma-Behandlung vollständig sauber und trocken ist. Wie im Textprotokoll beschrieben, das mikrofluidische Gerät unter einem Mikroskop untersuchen.

Stellen Sie sicher, dass die Kanäle nicht eingeknickt oder beschädigt sind und dass sowohl die Einlass- als auch die Auslassöffnungen direkt mit den Kanälen des Geräts verbunden sind, indem Sie ein Objektiv mit niedriger Vergrößerung verwenden. Geben Sie die Zellsuspension in ein Durchflusszytometrieröhrchen und verbinden Sie es mit der Druckkappe, bevor Sie den Schlauch mit dem mikrofluidischen Gerät verbinden. Stellen Sie den Druck auf etwa 14 bis 21 Kilopascal ein und spülen Sie, bis die Zellsuspension aus der Schlauchspitze austritt. Danach stellen Sie das Gerät auf eine ebene Fläche, um den Schlauch in den Geräteeinlass einzuführen.

Da die Glasdeckenscheibe, die an der Unterseite des PDMS-Geräts befestigt ist, zerbrechlich ist, führen Sie die Spitze des Schlauchs, der die Zellsuspension enthält, in den Eingang des Geräts ein. Führen Sie anschließend ein Stück Schlauch in den Auslassanschluss ein und leiten Sie ihn in ein leeres Röhrchen zur Sammlung von Abfall, beispielsweise ein leeres Falcon-Röhrchen, das an der Seite des Mikroskoptischs mit Klebeband befestigt ist.

Erhöhen Sie den Druck vorsichtig auf etwa 28 Kilopascal oder bis die Zellen durch die Kanäle fließen. Positionieren Sie das Gerät so, dass mehrere Kanäle im Sichtfeld liegen und senkrecht zum unteren Bildschirmrand verlaufen. Öffnen Sie zur Beginn der Datenanalyse die Master-Skript-m-Datei und führen Sie das Programm aus.

Wählen Sie das erste zu analysierende Video aus dem erscheinenden Windows-Explorer-Fenster aus. Geben Sie die Bildfrequenz für das ausgewählte Video an und drücken Sie die Eingabetaste. Es erscheint eine Abbildung, die den Benutzer auffordert, ein rechteckiges Ausschneidefenster auszuwählen.

Wählen Sie für das erste Video ein Fenster, das alle Kanäle von links nach rechts umfasst und die Kanäle knapp oberhalb der ersten Birne des Kanalarrays schneidet. Wählen Sie oben und unten die Konstriktionsbereiche aus dem zugeschnittenen Bild aus. Der Algorithmus zeigt die Segmentierung der Zellen für die ersten 50 Bilder jedes Videos an.

Überwachen Sie das obere linke Bild genau, um festzustellen, ob der Algorithmus die Zellen korrekt lokalisiert. Ein ized-Bild wird über das Quellvideo gelegt. Um die Position der identifizierten Zellen zu demonstrieren, wählen Sie das nächste zu verarbeitende Video im Windows-Explorer-Fenster aus.

Der Algorithmus wird sich wiederholen. Für jedes ausgewählte Video wählen Sie „Abbrechen“. Sobald alle gewünschten Videos über das Windows-Explorer-Fenster hinzugefügt wurden, um die Funktion anzuweisen, dass die Videoliste vollständig ist, zeigen die repräsentativen Ergebnisse für die Transitzzeit von HL-60- und neutrophilen HL-60-Zellen den zeitlichen Maßstab für den Durchtritt einer einzelnen Zelle durch eine Reihe von Einschnürungen.

Die Zeit wird für eine Population einzelner Zellen an jeder sieben Mikrometer messenden Einschnürung in einer Reihe von sieben Einschnürungen gemessen. Bei einem Druck von 28 Kilopascal verstopfen HL-60-Zellen vorübergehend die erste Einschnürung für eine mediane Dauer von 9,3 Millisekunden, bevor sie sich durch die nachfolgenden Einschnürungen verpacken. Im Gegensatz dazu verstopfen neutrophile HL-60-Zellen die erste Einschnürung nur für 4,3 Millisekunden, bevor sie sich verpacken.

Nachdem die Zellen die erste Engstelle passiert haben, durchlaufen sie die verbleibenden Engstellen zwei bis sieben schneller, mit einer medianen Durchtrittszeit von 4,0 Millisekunden für HL-60-Zellen und 3,3 Millisekunden für neutrophile Zellen. Durch den Vergleich der Durchtrittszeiten zwischen Zellpopulationen können Unterschiede in der Zelldeformierbarkeit aufgezeigt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Deformierbarkeit verschiedener Zelltypen mithilfe des einfachen mikrofluidischen Assays gemessen wird.

Hier wird eine druckgetriebene Strömung verwendet, um Zellen durch mikrofluidische Kanäle zu leiten, wodurch die Deformation und Relaxation einzelner Zellen analysiert werden kann.