Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Verformungsfähigkeit verschiedener Zelltypen mit Hilfe eines einfachen, auf Mikrofluidik basierenden Assays zu untersuchen. Dies wird durch die Herstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung aus Polydimethylsuboxan oder PDMS erreicht, um die Zeitskala des Zelltransits durch eine Sequenz im Mikrometermaßstab zu untersuchen. Verengungen Der druckgetriebene Fluss wird dann verwendet, um die Zellen durch ihre mikrofluidischen Kanäle zu treiben, was die Verformung und zeitabhängige Entspannung einzelner Zellen ermöglicht, die getestet werden sollen. Als nächstes wird das automatisierte Bildanalyseprogramm ausgeführt, um die Videos zu verarbeiten und ein Histogramm der Transitzeitdaten zu erhalten.

Die Ergebnisse zeigen, dass verschiedene Zelltypen Unterschiede in der Zellverformungsfähigkeit aufweisen, basierend auf ihrer Transitzeit durch eine Reihe von Verengungen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Rasterkraftmikroskopie oder der Mikropipettenaspiration besteht darin, dass mikrofluidische Geräte erfolgreich mit hohen Durchsatzkapazitäten arbeiten können. Andere mikrofluidische Geräte können auch verwendet werden, um die Deformbarkeit von Zellen zu testen.

Wir entwerfen unser Gerät so, dass die Zellen sequentielle Verengungen passieren, eine Geometrie, die in physiologischen Kontexten wie dem Lungenkapillarbett üblich ist. Zu Beginn entwerfen Sie das mikrofluidische Gerät, indem Sie die Breite der Verengungsarray-Kanäle auf etwa 30 bis 50 % des durchschnittlichen Zelldurchmessers und die Kanalhöhe auf mindestens 50 % des Zelldurchmessers auswählen. Fügen Sie einen Filter an den Eintrittsöffnungen hinzu, um Schmutz zu entfernen und Zellcluster zu disaggregieren.

Bevor Sie mit dem Versuch beginnen, stellen Sie den Gerätemaster unter Verwendung von Standardtechniken für die lithographische Mikrobearbeitung her. Überprüfen Sie die Höhe der Muster-Features mit einem Profilometer. Reparieren Sie als Nächstes die Luftquelle für den druckgetriebenen Durchfluss mit einem Drucklufttank und einer Reihe von Luftreglern und Armaturen.

Richten Sie zunächst einen Luftzufuhrtank und einen manuellen Regler ein. Richten Sie dann einen elektronisch gesteuerten Druckregler ein, der mit dem manuellen Regler übereinstimmt. Verwenden Sie den einfachen Code, der in LabVIEW geschrieben wurde, um den gewünschten Druck einzugeben.

Der elektropneumatische Wandler verwendet eine interne Rückkopplungsschleife, um den Ventilausgangsdruck an den angegebenen Druck im gesamten mikrofluidischen Gerät anzupassen. Richten Sie eine Druckkammer ein, um den Fluss der Zellsuspension zu steuern, indem Sie eine Zellsuspensionskammer aus einem Standard-Durchflusszytometerröhrchen und einer maschinell bearbeiteten Kappe zusammenbauen, die eine druckdichte Abdichtung auf dem Röhrchen erzeugt. Der Deckel der Druckkammer enthält zwei Öffnungen, einen Einlass, der mit dem Druckluftbehälter verbunden ist, und einen Auslass, durch den Zellen aus der Druckkammer in das Gerät strömen.

Stellen Sie als Nächstes ein inverses Mikroskop auf, das mit einer Kamera ausgestattet ist, die eine Erfassungsrate von mindestens 100 Bildern pro Sekunde hat. Um Bilder der Zellen aufzunehmen, die durch das Verengungsarray fließen, bereiten Sie dann eine Stammtensidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS vor, da die Zugabe einer kleinen Menge Tensid zur Zellmedienlösung dazu beiträgt, die Zelladhäsion an den PDMS-Wänden zu minimieren. Um den PDMS-Block mit mikrofluidischen Kanälen herzustellen, fügen Sie ein Gramm Härter zu 10 Gramm PDMS-Basis hinzu und mischen Sie es gründlich.

Gießen Sie die Mischung über das Gerät. Master Degas in einer Glocke mit angelegtem Vakuum herstellen, bis die eingeschlossenen Blasen verschwunden sind, oder für etwa 10 bis 20 Minuten. Nach dieser Zeit kann es immer noch zu Blasen an der AIR PDMS-Schnittstelle kommen, was normal ist.

Diese lösen sich in der Regel während des Backens auf. Anschließend backen Sie das Degas-Gerät nach dem Abkühlen des Geräts vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius. Entfernen Sie die mikrofluidischen Geräte aus der Urform.

Beginnen Sie damit, eine Ecke des Geräts vorsichtig abzuheben. Langsames und schonendes Schälen im Gegensatz zum Anheben Der PD DMS-Block gerade nach oben reduziert die Belastung sowohl des PDMS als auch des Masters. Schneiden Sie einzelne mikrofluidische Geräte mit einer Rasierklinge aus dem PDMS-Block heraus und entfernen Sie das Gerät aus dem Master. Stanzen Sie Löcher in das PDMS-Gerät, um Verbindungsöffnungen für den Zugang zwischen Schläuchen und Mikrokanälen zu schaffen. Erzeugen Sie mit einem Biopsie-Stanzer Löcher von der Kanalseite bis zur Außenseite des Geräts.

Spülen Sie das PDMS-Gerät mit Isopropanol, um Staub zu entfernen und PDMS-Stücke zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die gestanzten Löcher frei von Schmutz sind, indem Sie einen stetigen Strom von reinem Isopropanol aus einer Quetschflasche durch die Löcher leiten. Mit gefilterter Luft trocken föhnen.

Reinigen Sie das Glassubstrat durch Spülen mit Methanol. Föhnen Sie es dann mit gefilterter Luft und stellen Sie es fünf bis 10 Minuten lang auf eine 200 Grad heiße Platte, um sicherzustellen, dass das Glas vor der Plasmabehandlung vollständig sauber und trocken ist. Wie im Textprotokoll beschrieben, untersuchen Sie das mikrofluidische Gerät unter einem Mikroskop.

Stellen Sie sicher, dass die Kanäle nicht zusammengeklappt oder unterbrochen sind und dass sowohl die Einlass- als auch die Auslasslöcher direkt mit den Gerätekanälen verbunden sind, indem Sie ein Objektiv mit geringem Stromverbrauch verwenden. Legen Sie die Zellsuspension in ein Durchflusszytometerröhrchen und schließen Sie es an die Druckkappe an, bevor Sie den Schlauch an das mikrofluidische Gerät anschließen, stellen Sie den Druck auf etwa 14 bis 21 Kilopascal ein und spülen Sie, bis die Zellsuspension aus der Spitze des Schlauchs austritt. Stellen Sie das Gerät anschließend auf eine ebene Fläche, um den Schlauch in den Geräteeinlass einzuführen.

Da der Glasabdeckschieber, der mit der Unterseite des PDMS-Geräts verklebt ist, zerbrechlich ist. Führen Sie die Spitze des Schlauchs mit der Zellsuspension in den Geräteeinlass ein. Führen Sie dann ein Stück Schlauch in die Ausgangsöffnung ein und leiten Sie es in ein leeres Röhrchen zur Abfallsammlung, z. B. ein leeres Falcon-Rohr, das an der Seite des Mikroskoptisches befestigt ist.

Erhöhen Sie den Druck vorsichtig auf etwa 28 Kilopascal oder bis die Zellen durch die Kanäle fließen. Positionieren Sie das Gerät so, dass sich mehrere Kanäle im Sichtfeld befinden und senkrecht zum unteren Bildschirmrand stehen. Um mit der Datenanalyse zu beginnen, öffnen Sie die m-Datei des Masterskripts und führen Sie das Programm aus.

Wählen Sie im angezeigten Windows Explorer-Fenster das erste Video aus, das analysiert werden soll. Geben Sie die Bildrate für das ausgewählte Video an und drücken Sie die Eingabetaste. Es erscheint eine Abbildung, die den Benutzer auffordert, ein rechteckiges Zuschneidefenster auszuwählen.

Wählen Sie für das erste Video ein Fenster aus, das alle Kanäle von links nach rechts umfasst und die Kanäle direkt über der ersten Glühbirne des Kanalarrays schneidet. Wählen Sie oben und unten die Verengungsbereiche aus dem zugeschnittenen Bild aus. Der Algorithmus zeigt die Segmentierung der Zellen für die ersten 50 Frames jedes Videos an.

Überwachen Sie das Bild oben links genau, um festzustellen, ob der Algorithmus Zellen genau lokalisiert. Ein isiertes Bild wird über das Quellvideo gelegt. Um die Position der identifizierten Zellen zu veranschaulichen, wählen Sie im Windows Explorer-Fenster das nächste Video aus, das verarbeitet werden soll.

Der Algorithmus wird wiederholt. Wählen Sie für jedes ausgewählte Video Abbrechen. Sobald alle gewünschten Videos über das Windows Explorer-Fenster hinzugefügt wurden, um die Funktion anzuweisen, dass die Videoliste vollständig ist, zeigen repräsentative Ergebnisse für die Transitzeit von HL 60 und Neutrophilen Typ HL 60 Zellen die Zeitskala an, die eine einzelne Zelle benötigt, um eine Reihe von Verengungen zu durchlaufen.

Die Zeit wird für eine Population einzelner Zellen bei jeder Sieben-Mikrometer-Verengung in einer Reihe von sieben Verengungen gemessen. Bei einem Treibdruck von 28 Kilopascal verschließen HL 60-Zellen die erste Verengung vorübergehend für eine mittlere Zeit von 9,3 Millisekunden, bevor sie durch die nachfolgenden Verengungen verpackt werden. Im Gegensatz dazu verschließen neutrophile Zellen vom Typ HL 60 die erste Verengung nur für 4,3 Millisekunden, bevor sie verpackt werden.

Einmal durch die erste Verengung, durchlaufen die Zellen schneller die verbleibenden Verengungen von zwei auf sieben, mit einer medianen Transitzeit von 4,0 Millisekunden für die HL 60-Zellen und 3,3 Millisekunden für die neutrophilen Zellen. Durch den Vergleich der Transitzeit zwischen Zellpopulationen können Unterschiede in der Informierbarkeit der Zellen aufgedeckt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Verformungsfähigkeit verschiedener Zelltypen mit dem einfachen mikrofluidischen Assay messen können.

Hier wird die druckgetriebene Strömung verwendet, um Zellen durch mikrofluidische Kanäle zu treiben, was die Verformung und Entspannung einzelner zu untersuchender Zellen ermöglicht.