Strukturierung von Mikroorganismen und Mikropartikeln durch sequentielle kapillaritätsunterstützte Montage

Diese Methode ermöglicht es, benutzerdefinierte Muster von Mikroorganismen innerhalb eines mikrofluidischen Kanals zu erzeugen. Nach dem Muster können die Mikroorganismen überwacht werden, um ihre langfristige Physiologie und Interaktion mit hohem Durchsatz zu bewerten. Die Verwendung von Kapillarkräften ermöglicht eine unspezifische Route für die Strukturierung, die über verschiedene Materialklassen hinweg anwendbar ist.

Zum Beispiel kolloidale Partikel und Bakterien. Darüber hinaus ermöglicht es die Herstellung großer Arrays mit exquisiter Kontrolle der räumlichen Anordnung des interessierenden Materials. Bisher haben wir die Methode an kolloidalen Partikeln und mikrobiellen Zellen getestet und angewendet.

Infolgedessen kann es Anwendungen in der Materialtechnik und in Bereichen finden, die eine quantitative Einzelzellanalyse erfordern, wie z. B. das Wirkstoffscreening. Bereiten Sie zunächst ein PDMS-Gemisch vor, indem Sie das Elastomer mit seinem Vernetzungsmittel mischen. Rühren Sie dann die Mischung kräftig um, um die beiden Komponenten gleichmäßig zu mischen, bis sich Luftblasen bilden und die PDMS-Mischung undurchsichtig aussieht.

Entgasen Sie nun das Gemisch in einem Vakuum-Exsikkator, bis alle Luftblasen entfernt sind und das Gemisch wieder transparent aussieht. Um einen 400 Mikrometer dicken Schablonenboden des mikrofluidischen Chips zu erhalten, gießen Sie drei Gramm der Mischung auf den Siliziummaster und legen Sie den Siliziummaster auf einen Spin-Coater, um den Mantel bei 21 mal G für fünf Sekunden und 54 mal G für 10 Sekunden zu spinnen. Entgasen Sie erneut, um die eingeschlossenen Luftblasen wie zuvor beschrieben zu entfernen.

Gießen Sie 20 Gramm der PDMS-Mischung in die 3D-gedruckte Form, um den Mikrokanal herzustellen, der als Dach des mikrofluidischen Chips dient, und entgasen Sie ihn wie zuvor beschrieben für 30 Minuten. Backen Sie den Silikonwafer und die 3D-gedruckte Form bei 70 Grad Celsius für mindestens zwei Stunden, schneiden Sie dann das PDMS entlang des Umrisses der 3D-gedruckten Form und ziehen Sie es ab. Schneiden Sie das PDMS mit einer Klinge um die Mikrokanäle und stanzen Sie die Löcher, die als Ein- und Auslass des mikrofluidischen Kanals dienen.

Schneiden Sie nun das PDMS und ziehen Sie es vom Siliziummaster ab und schneiden Sie die PDMS-Schicht in kleinere Stücke mit den gleichen Abmessungen der mikrofluidischen Kanäle, die auf die Schablonen geklebt werden. Reiben Sie die Schablonen und Mikrokanäle mit einer 1%-Reinigungsmittellösung fünf Minuten lang vorsichtig ein und spülen Sie sie dann mit entionisiertem Wasser ab. Als nächstes spülen Sie die Schablonen und Mikrokanäle mit Isopropanol ab, bevor Sie sie mit entionisiertem Wasser abspülen.

Trocknen Sie nun die Schablonen und Mikrokanäle bei Raumtemperatur eine Minute lang mit Druckluft an einem Balken. Legen Sie die Schablonen und die Mikrokanäle in einen Plasmareiniger mit den Klebeflächen nach oben. Nach dem Einschalten des Plasmareinigers behandeln Sie die Schablonen und Mikrokanäle 40 Sekunden lang, nehmen Sie sie dann aus dem Plasmareiniger und verbinden Sie die Mikrokanäle sofort auf den Schablonen.

Lagern Sie die mikrofluidischen Chips fünf Tage lang in einem Ofen bei 70 Grad Celsius, um die hydrophobe Erholung von PDMS sicherzustellen. Stellen Sie am Tag des Experiments den Box-Inkubator einige Stunden vor dem Experiment auf 37 Grad Celsius ein und stellen Sie dann die Spritzenpumpe und die beheizte Glasplatte auf der Mikroskopbühne auf und stellen Sie die gleiche Temperatur wie die des Box-Inkubators ein. Legen Sie den Mikrofluidikchip 90 Minuten vor dem Experiment in ein mit 100% Ethanol gefülltes Gefäß und spülen Sie den Kanal mindestens 10 Minuten lang mit 100% Ethanol, dann legen Sie den Mikrofluidikchip in einen Vakuum-Exsikkator und entgasen Sie für mindestens 30 Minuten.

Tauschen Sie nun das Ethanol mit destilliertem Wasser aus und vakuumieren Sie den Chip für mindestens 30 Minuten. Legen Sie den Mikrofluidik-Chip bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten in den Ofen, um alle Spuren von Flüssigkeit zu entfernen, die im Kanal verbleiben. Pippen Sie einen Milliliter MOPS-Medium in eine Zentrifugendurchstechflasche und fügen Sie 10 Mikroliter 0,132 mollares Kaliumphosphat hinzu.

Aliquot 100 Mikroliter der Nachtkultur in die Zentrifugendurchstechflasche und zentrifugieren Sie die Kultur bei 2.300 mal G für zwei Minuten. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand, um das Pellet in einem Milliliter frischem MOPS-Medium mit 0,015% Tween 20 und 0,01% Kaliumphosphat zu resuspendieren und die Bakteriensuspension in eine Ein-Milliliter-Spritze zu laden. Um die Spritze und den Schlauchanschluss zu sichern, führen Sie direkt eine Nadel in den Schlauch ein.

Montieren Sie nun die Spritze auf der Spritzenpumpe und injizieren Sie die Suspension durch den Einlass am vorgelagerten Teil des Kanals in den Mikrofluidikchip, bis die Suspension den Schablonenbereich mit Fallen bedeckt. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Durchflussrate von 0,07 bis 0,2 Mikrolitern pro Minute ein, um die bakterielle Suspension abzuziehen und den Strukturierungsprozess über eine Mikroskopsoftware zu überwachen. Sobald die Vorlage mit Zellen strukturiert wurde, erhöhen Sie die Entnahmeflussrate, um den mikrofluidischen Kanal schnell zu entleeren und ihn mit frischem LB zu spülen, das zuvor für mindestens 30 Minuten entgast und bei 30 Grad Celsius vorgewärmt wurde.

Stellen Sie nun die Spritzenpumpe auf eine Durchflussrate von zwei Mikrolitern pro Minute ein, um den Kanal sanft zu spülen. Sobald der Kanal gefüllt ist, erhöhen Sie die Durchflussrate erneut. Erfassen Sie Bilder von wachsenden Bakterien in der gewünschten Vergrößerung und im gewünschten Zeitintervall.

Pipettieren Sie 900 Mikroliter einer 0,015% Tween 20 wässrigen Lösung in eine Zentrifugendurchstechflasche und pipettieren Sie dann 100 Mikroliter der ursprünglichen kolloidalen Suspension hinein. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 13.500 mal G für eine Minute und ersetzen Sie den Überstand vorsichtig durch die wässrige Tween 20-Lösung. Laden Sie die kolloidale Suspension in eine Ein-Milliliter-Spritze und verbinden Sie die Spritze über mikrofluidische Schläuche mit dem Chip.

Injizieren Sie die Suspension in den Mikrofluidikchip durch den Einlass, der sich im zentralen Abschnitt im vorgeschalteten Teil des Kanals befindet, und drücken Sie die Suspension allmählich an, bis die Schablone abgedeckt ist. Entnehmen Sie die kolloidale Suspension mit einer Durchflussrate von 0,07 bis 0,2 Mikrolitern pro Minute und bilden Sie den Strukturierungsprozess über eine Mikroskopsoftware ab. Erhöhen Sie die Flussrate, sobald der Meniskus schnell das Ende der Vorlage erreicht hat.

Die Geometrie des geraden Kanals wurde ausgenutzt, um stationäre Phasenzellen eines fluoreszierenden Escherichia coli-Stammes zu strukturieren, der 83% der 5.000 analysierten Fallen ablagerte. Gemusterte Bakterien nahmen das Wachstum zu verschiedenen Zeiten innerhalb von 1,5 Stunden wieder auf, nachdem der Kanal mit frischem LB gefüllt war. Sobald das Wachstum wieder aufgenommen wurde, begannen einzelne Bakterienzellen, einzelne Kolonien zu bilden, die sich ausdehnten, bis eine Oberflächenschicht gebildet wurde und die Einzelzellauflösung verloren ging. Eine Analyse, die über 55.000 Fallen durchgeführt hat, zeigte, dass grün-rote Dimere, die aus Partikeln mit zwei und einem Mikrometer Durchmesser bestehen, in 93% bzw. 89% der analysierten Fallen gebildet wurden.

Und in 52% der Fallen bildeten sich grün-rot-grüne Trimmer. Der Abstand zwischen gemusterten Partikeln kann präzise gesteuert werden, indem zwei Abscheidungen in entgegengesetzte Richtungen durchgeführt werden, wodurch solche Partikel an den entgegengesetzten Enden jeder Falle eingefangen werden. Es ist wichtig, eine gleichmäßige Temperatur in der gesamten Schablone zu gewährleisten, um Kondensation während des Strukturierungsprozesses zu vermeiden.

Zu diesem Zweck legen wir eine beheizte Glasplatte unter die Schablone und stellen sie auf die gleiche Temperatur wie der Box-Inkubator. Diese Methode kann in einer Vielzahl von biologischen Studien mit quantitativer Einzelzellanalyse eingesetzt werden. Ein einzigartiger Vorteil ist, dass sein hoher Durchsatz die Strukturierung von Tausenden von Zellen ermöglicht, die große Statistiken innerhalb derselben experimentellen Arena liefern.