Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult Drosophila Brains

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein einfaches, einstufiges Präparierverfahren für adulte Drosophila-Gehirne zu beschreiben, das schnell Gehirne mit gut erhaltener Morphologie erzeugen kann, die für die Analyse des gesamten Reittiers geeignet sind. Diese Methode kann helfen, Fragen aus den Neurowissenschaften und der Genetik zu beantworten. Dazu gehören die feine Kartierung von Schaltkreisen im Gehirn, die Untersuchung der Auswirkungen genetischer Manipulationen von Neuronen und die funktionelle Charakterisierung von Genen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein leicht zu erlernendes Verfahren handelt. Es kann das Präparieren eines adulten Fliegengehirns mit gut erhaltener Morphologie in weniger als 10 Sekunden erleichtern. Die Videodemonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Kontrolle des erforderlichen Impulses beim Loslassen der Pinzette, um das Exoskelett um den Fliegenkopf herum abzureißen, Geschick und Übung erfordert.

Diese winzigen, lästigen Fruchtfliegen haben uns viel über die biologischen Prinzipien gelehrt. Sie können uns auch helfen, die Ursachen und Heilmittel für menschliche Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson zu finden. Mit einem Präpariermikroskop mit 1,2-facher Vergrößerung immobilisieren Sie eine betäubte Fliege und tauchen Sie sie mit dem Bauch nach oben in eine kalte Dissektionslösung.

Halten Sie die Pinzette in einem Winkel von 160 bis 170 Grad zur Präparierplatte und üben Sie dann eine kleine Kraft auf den Bauch der Fliege aus. Dies sollte die Fliege ruhigstellen, den Kopf um 15 bis 25 Grad nach hinten drücken und den Rüssel nach oben ausfahren. Nach diesem Manöver sollte ein weicher durchscheinender Bereich der Nagelhaut unter dem Rüssel sichtbar werden.

Erhöhen Sie die Vergrößerung und stellen Sie die Fokusebene auf diesen Bereich ein. Nehmen Sie mit der dominanten Hand eine Präparierzange und üben Sie Druck aus, um die Spitzen zu schließen. Positionieren Sie die Pinzette senkrecht zu der Pinzette, die die Fliege festhält.

Stechen Sie die geschlossenen Spitzen der Pinzette durch den weichen, durchscheinenden Bereich der Nagelhaut und achten Sie darauf, nicht so tief einzudringen, dass sie das Gehirn berühren. Lösen Sie dann schnell, aber stetig die Pinzette, so dass sich die Spitzen öffnen und das Exoskelett des Fliegenkopfes weggerissen wird. Nutzen Sie den Schwung beim Loslassen der Pinzettenspitzen, um das Exoskelett und den größten Teil des Kopfgehäuses, des Auges und der Luftröhre in einer Bewegung sanft aus dem Hirngewebe zu entfernen.

Ein intaktes Gehirn sollte nun sichtbar sein. Entfernen Sie mit der Pinzette vorsichtig das verbleibende akzessorische Gewebe, wie z. B. das weiße fibröse Trachealgewebe, und achten Sie darauf, das Gehirn selbst nicht zu zerren oder zu beschädigen. Legen Sie die präparierten Gehirnproben mit den zugehörigen Torsos für 40 bis 60 Minuten in etwa einen Milliliter 4%-Paraformaldehyd auf Eis.

Entfernen Sie das Paraformaldehyd und spülen Sie die Proben dann mit einem Milliliter eines X PBS aus, indem Sie die Lösung dreimal auf und ab pipettieren und dabei darauf achten, das Gehirn nicht zu aspirieren. Entfernen Sie anschließend das PBS und waschen Sie es dann fünfmal mit einem Milliliter eines X PBT für jeweils fünf Minuten mit Nutation. Fügen Sie den primären Antikörper von Interesse in der entsprechenden Verdünnung hinzu.

Und dann die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius mit Nutation inkubieren. Entfernen Sie den Primärantikörper und waschen Sie die Proben fünfmal mit einem Milliliter eines X PBT für jeweils fünf bis 10 Minuten mit Nutation. Geben Sie den gewaschenen Proben einen Sekundärantikörper mit der entsprechenden Verdünnungs- und Inkubationszeit zu.

Anschließend werden die Proben sechsmal in einem Milliliter eines X PBT für jeweils 10 Minuten mit Nutation gewaschen. Dieser Schritt ist entscheidend, um unspezifisch gebundene Sekundärantikörper zu entfernen. Inkubieren Sie die Proben in einer Verdünnung von einem bis 10.000 Milligramm pro Milliliter DAPI in einem Milliliter einer X PBT-Lösung für 30 bis 60 Minuten mit Nutation.

Zum Schluss spülen Sie die Proben, indem Sie einen Milliliter eines X PBS hinzufügen und die Lösung dann dreimal auf und ab pipettieren. Platzieren Sie ein Deckglas auf einer Montageschiene. Übertragen Sie das Gehirn mit einer Pipette mit einer abgeschnittenen Spitze in einer X PBS-Lösung auf das Deckglas.

Trennen Sie dann mit einer Zange das Gehirn von den Körpern. Verwenden Sie eine feine Pipettenspitze, um die Flüssigkeit um das Gehirngewebe herum zu entfernen. Und dann fügen Sie 20 bis 40 Mikroliter Anti-Fade-Eindeckmittel hinzu.

Verteilen Sie das Gehirn sanft, während Sie das viskose Medium nach außen verdrängen. Beginnen Sie an einer Seite und senken Sie vorsichtig ein zweites Deckglas auf die Proben, wobei Sie darauf achten, den Kontakt des Gehirns mit Blasen zu minimieren. Lassen Sie die Schlicker absetzen und entfernen Sie dann überschüssige Flüssigkeit mit einem Labortuch vom Rand der Schlupftücher.

Verwenden Sie ein kleines Stück Klebeband, um das Deckglaspaar vorübergehend an der Montageschiene zu befestigen. Um die Proben abzubilden, verwenden Sie ein zusammengesetztes Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop. Diese Bilder zeigen Vorder- und Hinteransichten derselben adulten Drosophila.

Zellkerne wurden durch DAPI-Färbung sichtbar gemacht und Neuronen mit einem panneuronalen Marker und Anti-ELAV-Antikörpern markiert. Dopaminerge oder DA-Neuronen wurden durch Anti-TH-Antikörperfärbung nachgewiesen. Ähnliche Intensitätsniveaus wurden zwischen beiden Seiten des Gehirns für alle Bildkanäle beobachtet.

Vergrößerte Ansichten des vorderen und hinteren Teils des Gehirns ermöglichen eine detaillierte Untersuchung der neuronalen DA-Cluster. Der paarige anteriore mediale Cluster ist auf den vorderen Bildern zu sehen, und die paarigen posterioren medialen und gepaarten posterioren lateralen Cluster auf der hinteren Seite des Gehirns. Die Quantifizierung dieser Neuronen zeigte, dass drei Tage alte männliche Fliegen des w1118-Stammes typischerweise 27 DA-Neuronen im PPM-Cluster im gesamten Gehirn, 16 im PPL-Cluster pro Hemisphäre und fünf im PAL-Cluster pro Hemisphäre haben.

In jedem der PAM-Cluster wurden durchschnittlich 97 DA-Neuronen clusters. 3D Rekonstruktion der PAL- und PAM-Cluster zeigte auch, dass die DA-Neuronen im PAM-Cluster relativ kleine Größen und eine schwächere TH-Färbung aufweisen als die in den anderen Clustern, wie z. B. dem PAL. Immer mehr Studien konzentrieren sich auf adulte Fliegengehirne, um molekulare Signalwege und neuronale Schaltkreise zu analysieren, die höheren Gehirnfunktionen zugrunde liegen, und um menschliche Gehirnerkrankungen zu modellieren.

In solchen hirnbasierten Studien wird es notwendig sein, Gehirnproben mit gut erhaltener Morphologie effizient zu präparieren. Dies könnte besonders wichtig bei groß angelegten gehirnbasierten Screenings sein. Die Idee zu dieser Methode kam mir zum ersten Mal, als ich Schwierigkeiten hatte, Fliegen in der Pinzette zu halten.

Anstelle von Pinzetten mit scharfen Spitzen, die die meisten Drosophila-Forscher verwenden, probierte Shebna eine Zange mit stumpfen Enden aus und stellte fest, dass es einfacher war, das Gehirn zu präparieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 10 Sekunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Einmal habe ich an nur einem Tag etwa 100 Gehirne von sechs verschiedenen Genotypen für ein Experiment seziert.

Auch wenn dieses Präparierverfahren einfach aussehen mag, ist es wichtig, es zuerst mit entbehrlichen Fliegen zu üben. Der Untersucher kann auch Schwierigkeiten haben, die Pinzette zu positionieren, ohne das Fliegengehirn zu zerstören. Die präparierten Gehirne können für andere Studien verwendet werden, z. B. für RNA, In-situ-Hybridisierung und Extraktion von Protein- und RNA-Proben aus Hirngewebe.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, Fliegengehirne mit gut erhaltener Morphologie zu sezieren. Wir gehen davon aus, dass Verbesserungen entwickelt werden können, um dieses Verfahren einfacher und schneller zu gestalten. Dies kann in Zukunft möglicherweise für groß angelegte Studien automatisiert werden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Paraformaldehyd und der scharfen Präparierzange gefährlich sein kann. Treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. das Tragen von Handschuhen, wenn Sie mit Fixierlösungen umgehen, und verschließen Sie nach Abschluss der Dissektion sofort die Pinzette, bevor Sie sie beiseite legen.