Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, niederfrequente somatische Mutationen in einer Vielzahl von Probentypen zu detektieren. Diese Methodik kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei somatischen Mutationstests zu beantworten, indem sie den Nachweis von sehr niederfrequenten Mutationen erleichtert. Hier werden wir nach Mutationen im myd88-Gen in Knochenmarkproben suchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auch bei sehr wenigen neoplastischen Zellen sehr genaue und empfindliche Informationen über das Vorhandensein von somatischen Mutationen liefert. Dieser Wildtyp-Blocking-PCR-basierte Sequenzierungsassay wurde entwickelt, um einen Teil des Exons fünf im myd88-Gen zu amplifizieren und so die Abdeckung des L265-Hotspots sicherzustellen. Die Vorwärts- und Rückwärts-Primer wurden mit einer M13-Sequenz mit fünf Primzahlen ausgelegt, um ein Knien von komplementären Sequenzierungs-Primern zu ermöglichen.

Das blockierende Oligonukleotid ist so zu gestalten, dass es etwa 10 bis 15 Basen lang ist und komplementär zum Wildtyp-Template ist, bei dem eine Mutantenanreicherung gewünscht wird. Ein kürzeres Oligo wird die Diskriminierung von Diskrepanzen verbessern. Um eine hohe Zielspezifität zu erreichen, ist es wichtig, nicht zu viel von den blockierenden Nukleotiden zu verwenden, da dies zu sehr klebrigen Oligonukleotiden führt.

Um das blockierende Oligonukleotid zu entwerfen, navigieren Sie zunächst zur Website von Oligo Tools. Wählen Sie das Vorhersagewerkzeug Oligo TM aus. Es öffnet sich ein neues Fenster.

Fügen Sie die Sequenz der Wildtypvorlage, die blockiert werden soll, in das Feld für die Oligosequenz ein. Fügen Sie ein Pluszeichen vor den Blocker-Bases hinzu, um sie zu markieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Berechnen, um die ungefähre TM des DNA-Blocker-Hybriden zu bestimmen.

Die berechneten Schmelztemperaturen werden in den Feldern unten angezeigt. Das blockierende Oligo ist so zu gestalten, dass es eine Schmelztemperatur hat, die 10 bis 15 Grad Celsius über der Dehnungstemperatur während des Thermocyclings liegt. Hier beträgt die Ausdehnungstemperatur 72 Grad Celsius.

Um die Schmelztemperatur einzustellen, fügen Sie blockierende Basen hinzu, entfernen Sie sie oder ersetzen Sie sie. Vermeiden Sie lange Strecken von drei bis vier blockierenden C- oder G-Basen. Um die Bildung von Sekundärstrukturen oder Selbstdimerisierung zu vermeiden, gehen Sie zurück zum Startbildschirm der Oligo Tools-Website und wählen Sie das Oligo Optimizer-Tool aus.

Es öffnet sich ein neues Fenster. Fügen Sie die Sequenz der Wildtype-Vorlage, die blockiert werden soll, in das Feld ein. Fügen Sie ein Pluszeichen hinzu, um blockierende Basen anzuzeigen.

Aktivieren Sie die beiden Kästchen für Sekundärstruktur und Nur Selbst und klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren, um die Ergebnisse für Hybridisierung und Sekundärstruktur anzuzeigen. Diese Werte stellen sehr grobe Schätzungen der Schmelztemperaturen der Selbstdimere bzw. der Sekundärstrukturen dar. Niedrigere Punktzahlen sind optimal und können durch die Begrenzung der Blocker-Blocker-Paarung erreicht werden.

Entfernen oder positionieren Sie blockierende Nukleotide neu, um niedrigere Werte zu erzielen. Das hier gezeigte optimierte blockierende Oligonukleotid für myd88 schafft ein Gleichgewicht zwischen der Schmelztemperatur des DNA-Blocker-Hybrids und ausreichend niedrigen Hybridisierungs- und Sekundärstrukturwerten. Es wurde entwickelt, um die Aminosäuren Q262 bis I266 abzudecken, und verfügt über eine invertierte DT mit drei Primzahlen, um sowohl die Expansion durch DNA-Polymerase als auch den Abbau durch drei Prime-Exonukleasen zu hemmen.

Sobald die Primer entworfen wurden, richten Sie die Wildtyp-Blockierungs-PCR ein und führen Sie den Thermocycling durch, wie im Begleitdokument beschrieben. Entnehmen Sie die magnetischen Kügelchen aus der Lagerung bei vier Grad Celsius und bringen Sie sie auf Raumtemperatur. Übertragen Sie 10 Mikroliter des PCR-Produkts auf eine neue PCR-Platte.

Wirbeln Sie die magnetischen Kügelchen kräftig vor, um die magnetischen Partikel vollständig zu resuspendieren, und fügen Sie dann 18 Mikroliter magnetische Kügelchen zu jeder Vertiefung auf der neuen Platte hinzu. Pipettieren Sie zum Mischen 10 Mal auf und ab. Dann die Platte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Legen Sie die PCR-Platte nach der Inkubation zwei Minuten lang auf die Magnetplatte mit seitlichem Rand, um die Kügelchen von der Lösung zu trennen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um den Überstand abzusaugen. Achten Sie darauf, dass die Perlenkügelchen vermieden werden.

Geben Sie anschließend 150 Mikroliter 70%iges Ethanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie dann das Ethanol mit einer Mehrkanalpipette und entsorgen Sie die Spitzen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch einmal.

Saugen Sie mit einer 20-Mikroliter-Mehrkanalpipette das restliche Ethanol aus jeder Vertiefung an und entsorgen Sie die Spitzen. Nachdem Sie die Vertiefungen der Platte etwa 10 Minuten trocknen gelassen haben, nehmen Sie sie aus dem Magneten und geben Sie 40 Mikroliter nukleasefreies Wasser in jede Vertiefung. Zum Mischen 15 Mal auf und ab pipettieren.

Dann zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Setzen Sie die PCR-Platte nach der Inkubation für eine Minute wieder auf die Magnetplatte, um die Kügelchen von der Lösung zu trennen. Übertragen Sie 35 Mikroliter des gereinigten Produkts auf eine neue PCR-Platte und führen Sie eine bidirektionale Sequenzierung durch, wie im Begleitdokument beschrieben.

Nachdem eine bidirektionale Sequenzierung durchgeführt wurde, um die Sequenzierprodukte zu reinigen, bereiten Sie eine frische Eins-zu-25-Lösung aus drei molaren Natriumacetat bei einem pH-Wert von 5,2 und 100 % Ethanol her. Bereiten Sie auch eine frische Lösung aus 70%igem Ethanol vor. Geben Sie in jede Vertiefung der Vorwärts- und Rückwärtssequenzierungsplatten 30 Mikroliter Natriumacetat in 100 % Ethanol und pipettieren Sie zum Mischen fünfmal auf und ab.

Verschließen Sie dann die Platte wieder und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach Ablauf von 20 Minuten zentrifugieren Sie die Platte bei 2.250 G für 15 Minuten. Entfernen Sie nach dem Schleudern die Plattenversiegelung und drehen Sie die Platte einmal über einen Abfallbehälter.

Wenn die Platte mehrmals umgedreht wird, können sich die Pellets von den Brunnenböden lösen. Legen Sie die umgedrehte Platte auf ein sauberes Papiertuch und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 150 Mal G. Geben Sie anschließend 150 Mikroliter 70%iges Ethanol in jede Vertiefung und verschließen Sie die Platte wieder.

Drehen Sie sich fünf Minuten lang bei 2.250 Mal G. Wiederholen Sie dann den Vorgang, indem Sie das Plattenversiegelungsmittel entfernen und die Platte umdrehen. Wenn die Vertiefungen nicht vollständig trocken sind, lassen Sie sie bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.

Stellen Sie sicher, dass die Proben vor Licht geschützt sind. Sobald die Vertiefungen vollständig getrocknet sind, geben Sie 10 Mikroliter Formamid in jede Vertiefung und pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um zu mischen. Verschließen Sie die Platte wieder.

Denaturierung mit einem Thermocycler bei 95 Grad Celsius für drei Minuten, gefolgt von vier Grad Celsius für fünf Minuten. Ersetzen Sie nach der Denaturierung den Plattenversiegeler durch eine Septa und sequenzieren Sie auf einer Sequenzierplattform gemäß den Anweisungen des Herstellers. Visualisieren Sie mit Hilfe einer Sequenzanalysesoftware die Kurven und richten Sie die Sequenzen an den entsprechenden Referenzsequenzen aus.

Richten Sie myd88 NM002468 an der NCBI-Referenzsequenz aus. Genomische DNA von Patienten mit und ohne Mutationen wurde sowohl der konventionellen als auch der Wildtyp-Blocking-PCR unterzogen und die resultierenden PCR-Produkte wurden dann sequenziert. Wie hier zu sehen ist, wurde das mutierte Allel angereichert, wenn eine Wildtyp-Blocking-PCR durchgeführt wurde, und in der Wildtyp-DNA wurden keine falsch positiven Ergebnisse beobachtet.

Ein charakteristischer Abfall der Signalintensität, wie hier gezeigt, wird häufig beobachtet, wenn eine zu hohe Konzentration des Blockers verwendet wird oder wenn die Post-PCR-Aufreinigung den Blocker vor der bidirektionalen Sequenzierung nicht entfernen konnte. Dies ist der Fall, wenn die enzymatische Aufreinigung anstelle der magnetischen Bead-Reinigung durchgeführt wird. Jeder PCR-basierte Assay, der auf mutierte Allele anreichert, erkennt niederfrequente Artefakte.

Diese Spuren zeigen eine Zunahme von CG-Sequenzierungsartefakten im Vergleich zu TA-Artefakten in FFPE-Gewebe, wenn Cytosin oder methyliertes Cytosin durch formale Infixation an Uracil bzw. Thiamin desaminiert werden. Uracil-DNA-Glykosylase oder UDG kann Uracil vor der Wildtyp-Blocking-PCR herausschneiden, was dazu beiträgt, Sequenzierungsartefakte zu reduzieren. Thiamin, das aus desaminiertem Fünf-Methyl-Cytosin resultiert und häufig auf CPG-Inseln vorkommt, kann jedoch nicht durch UDG exzidiert werden.

Die Verringerung der Konzentration des bei der Wildtyp-Blocking-PCR verwendeten Blockers kann dazu beitragen, das Auftreten von Sequenzierungsartefakten zu reduzieren, die durch eine UDG-Behandlung nicht behoben werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie somatische Mutationen mit einem hohen Maß an Genauigkeit und Empfindlichkeit mit der Wildtyp-Blockierungstechnik testen können. Das Prinzip dieser Technologie kann auf den Nachweis von Mutationen in kleinen Subpopulationen von Zellen angewendet werden.

Daher ist es nützlich bei der Erkennung minimaler Resterkrankungen, der Überwachung von Patienten und der Vorhersage eines frühen Rückfalls bei Patienten mit verschiedenen Neoplasien.