Name: Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Lernen Sie die Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung zur hochempfindlichen Detektion seltener somatischer Mutationen im myd88-Gen aus Knochenmarkproben. Diese Methode ermöglicht präzise Ergebnisse selbst bei geringem Anteil neoplastischer Zellen.

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Die Autoren haben keine Danksagungen.

Ethik Statement: Alle Tests von menschlichen Proben wurden durchgeführt, nachdem Institutional Review Board (IRB) die Genehmigung zu erhalten. 1. DNA Extraktion aus FFPE Tissue, peripherem Blut und Knochenmark-Aspirat <ol><li> Für FFPE Gewebe Knochenmark mit DNA-Extraktions-Kits FFPE <ol><li> Beginne mit FFPE Geweben von ungefärbten Folien (von 5 bis 10 Abschnitte mit einem 5 - 10 um Dicke). HINWEIS: Bei Beginn mit Gewebespänen verwenden 3 bis 6 Abschnitte mit einer 5 - 10 um Dicke und überspringt zu Schritt 1.1.6. </li><li> Legen Sie Folien in einer Dia-Korb und bereiten vier Waschwasserbecken (zwei für Xylen und zwei für 100% Alkohol). In jeden Korb ein Mindestvolumen von 600 ml Lösung. </li><li> Deparaffinisieren die Folien durch in der ersten Schale 5 min Xylol waschen zu tun. Die Objektträger in der zweiten Xylol Spülwanne für weitere 5 min. </li><li> Nach Entparaffinierung, waschen Sie die Folien mit 100% Alkohol 5 min. Die Objektträger in der zweitenAlkohol Spülwanne für weitere 5 min. </li><li> Lassen Sie die Folien vor dem Abschaben sie mit einer Rasierklinge in ein Mikrozentrifugenröhrchen vollständig unter einer Abzugshaube trocknen. HINWEIS: Wenn ein H &amp; E Schlitten mit Tumorregion angegeben zur Verfügung steht, die Folien ausrichten und nur die Tumorregion kratzen. </li><li> Gehen Sie mit den Anweisungen des Herstellers Handout im Bausatz enthalten. </li></ol></li><li> Für BM absaugen und peripherem Blut <ol><li> Extrahieren Sie nach den Anweisungen des Herstellers Handout mit diesen Spezifikationen. HINWEIS: Es gibt zahlreiche im Handel erhältliche Kits und Verfahren zur DNA-Extraktion aus FFPE Geweben und Zellen. Praktisch können alle verwendet werden. Verwendet ein Verfahren, das im Labor hergestellt wird. <ol><li> Verwenden 200 &amp; mgr; l peripheres Blut (PB) oder 100 ul BM + 100 &amp; mgr; l PBS. </li><li> Verwenden Sie 4 &amp; mgr; l RNase A-Stammlösung. </li><li> Eluieren mit 100 &amp; mgr; l Elutionspuffer. </li></ol></li></ol></li><li> DNA-Quantifizierung<ol><li> Messung von DNA-Konzentrationen unter Verwendung einen Spektralphotometers ein 260 nm / 280 nm-Verhältnis von etwa 1,8 (bei reiner DNA) zu gewährleisten. Wenn das Verhältnis wesentlich niedriger ist, kann sie die Anwesenheit von Protein, Phenol oder anderen Verunreinigungen zeigen, die mit Downstream-Anwendungen stören können. </li><li> Justieren DNA-Konzentrationen auf etwa 50 bis 100 ng / &amp; mgr; L mit dem entsprechenden Elutionspuffer. </li></ol></li></ol> 2. Wildtyp-PCR-Blocking <ol><li> Primer-Design <ol><li> Design und erhalten Primer für die Gene von Interesse nach zuvor beschriebenen allgemeinen Richtlinien des PCR - Primer - Designs 13. Fügen Sie M13-Vorwärts- und Rückwärts-Universal-Sequenzierungs-Primer in PCR-Primer. HINWEIS: Der Assay MYD88 Exon 5 von MYD88 zu amplifizieren entwickelt (G259 - N291) und 110 in der 5&#39; befindet Nukleotide intronischen Region, die die Spleißstelle und ein Teil von Intron 4 zu bedecken die Vorwärts- und Rückwärtsprimer wurden entwickelt, um mit einem 5&#39; -M13-Sequenz (M13-forward: tgt aaa ACG ACG GCC AGT; M13-Rückwärts: CAG GAA ACA GCT ATG ACC) für das Annealing von komplementären Sequenzierungsprimern (siehe Materialien Table) zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Locked Nucleic Acids Oligonukleotid-Entwurf <ol><li> Entwerfen des blockierende Oligonukleotid etwa 10 bis - 15 Basen lang und komplementär zu der WT-Vorlage, wo mutanten Anreicherung gewünscht wird. HINWEIS: Eine kürzere Oligo wird Mismatchdiskriminierung verbessern. Um eine hohe Zielspezifität zu erreichen, ist es wichtig, nicht zu viel zu verwenden, blockiert Nukleotiden, da diese in einem sehr „klebrig“ Oligonukleotid führen kann. Der Inhalt und die Länge und die blockierende Nucleotid sollte entsprechend der spezifischen Nukleotid optimieren werden, die blockiert werden müssen. Es ist wichtig, eine hohe Bindungsspezifität zu erreichen, ohne Sekundärstruktur zu beeinträchtigen und Selbst Komplementarität zu riskieren. </li><li> Entwerfen der blockierenden Oligo eine T m 10 haben - 15 ° C über der Verlängerung temperature während Thermozyklisierung. Stellen Sie die T m durch Hinzufügen oder Entfernen von blockierenden Basen oder durch Basen für die DNA - Blockierung bei gleichzeitiger Vermeidung lange Strecken Einsetzen von (3 bis 4 Basen) des Blockierens G oder C - Basen. <ol><li> Navigieren Sie zu dem Oligo - Tools - Website (siehe Tabelle der Materialien) und wählen Sie die „Blockierung Oligo Tm Prediction“ -Tool. </li><li> Einfügen der Sequenz der WT-Vorlage, die gewünscht wird, in die „Oligo Sequence“ abgeblockt wird. Add „+“ vor Basen-Blocker Basen anzuzeigen. </li><li> Wählen Sie den „Berechnen“ , um die ungefähre Tm der DNA-Blocker - Hybrid zu bestimmen. </li></ol></li><li> Entwerfen Sie die Blockierung Oligo Sekundärstrukturbildung oder Selbst Dimere zu vermeiden. <ol><li> Navigieren Sie zu dem Oligo - Tools - Website (siehe Tabelle der Materialien) und wählen Sie die „Blockierung Oligo Optimizer“ -Tool. </li><li> Einfügen der Sequenz der WT-Vorlage, die gewünscht wird, in die Box blockiert werden. Add „+“ vor Basen blockiert Basen anzuzeigen. </li><li> Wählen Sie die beiden Boxen für „Sekundärstruktur“ und „Nur selbst“. Drücken Sie die Taste, um die Analyse Oligo für potenziell störende Nebenstrukturen oder Selbst Dimere zu überprüfen. HINWEIS: Die Noten repräsentieren sehr grobe Schätzungen der T m ‚s der Sekundärstrukturen und Selbst Dimere. Niedrigere Werte sind daher optimal und können durch eine Begrenzung Blocker-Blocker Paarung erreicht werden. Die Blockierungs-Oligonucleotid für MYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + G + T + A + T + CC / invdT /)] wurde entwickelt, um die Aminosäuren Q262-I266 zu bedecken und verfügt über ein 3&#39;-invertierten dT sowohl Verlängerung durch DNA-Polymerase und Abbau durch 3&#39;-Exonuclease zu hemmen. Diese spezifische blockierende oligo ist ein 17-mer mit 10 blockierenden Basen, die als „+ N“ bezeichnet sind. Die verbleibenden 7 Basen sind gewöhnliche DNA-Nucleotide. </li></ol></li></ol></li><li> WTB-PCR-Setup und Thermocycling <ol><li> Bereiten Sie einen WTB-PCR Master mix (MMX) 2,5 &amp; mgr; l PCR - Reaktionspuffer 10x w / 20 mM MgCl 2, 250 &amp; mgr; M dNTPs, 0,2 &amp; mgr; M Vorwärts und Rückwärtsprimer, 1.2 uM MYD88blocker und DNAse, RNAse-frei, ultrareines H 2 O , um eine endgültige zu schaffen unter Verwendung von Lösungsvolumen von 21,75 &amp; mgr; l pro Reaktion. HINWEIS: Die Arbeitskonzentrationen sind für die endgültigen Reaktionsvolumen von 25 &amp; mgr; l (nach der Zugabe von DNA-Matrize und Polymerase). Herkömmliche PCR MMX wird durch einfaches Weglassen der Zugabe von Blocker hergestellt. Alle Protokollschritte bleiben identisch für beide WTB und konventionelle PCR. Dies kann bei der Validierung und Bestimmung Anreicherung durch Zugabe von Blocker erreicht werden. <ol><li> Wenn die Menge der MMX Berechnung vorzubereiten für 3 zusätzliche Reaktionen (positive und negative Kontrollen und eine nicht-Kontrolle zu überprüfen, für die Kontamination) und zumindest 1 weitere Reaktion zum Pipettieren Fehler zu berücksichtigen, stellen Sie sicher. </li></ol></li><li> Vortex MMX gründlich. Die MMX kann bei -80 ° C gelagert werden bis ayOhr. </li><li> Zugabe von 0,25 &amp; mgr; l Taq DNA-Polymerase pro Reaktion auf den MMX und Invertzucker zu mischen. Sobald die Polymerase an die MMX hinzugefügt wurde, halten Sie es auf Eis. </li><li> Legen Sie eine neue 96-Well-PCR-Platte auf einer kalten Platte und Pipette 22 ul MMX mit Polymerase zu jeder Well Reaktion. </li><li> Fügen 3 ul genomische DNA (50 bis 100 ng / &amp; mgr; l zu jedem der Vertiefungen mit dem MMX-Polymerase enthalten. </li><li> Verschließen Sie die Platte und Zentrifuge kurz die Lösung erreicht den Boden jeder Vertiefung zu gewährleisten. </li><li> Laden Sie die PCR-Platte auf einem Thermocycler. <ol><li> Stellen Sie die thermozyklischen Bedingungen für die WTB-PCR-Reaktion wie folgt: anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 6 min; 40 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 30 s, Primer-Annealing bei 56 ° C für 30 s und Verlängerung bei 72 ° C für 1 min 20 s; letzte Verlängerung bei 72 ° C für 10 min. HINWEIS: Beste Praxis beinhaltet in einem räumlich getrennten Bereich, den Rest des Protokolls abgeschlossen Amplikonkontamination zu vermeiden in Zukunft Setups. </li></ol></li></ol></li><li> Perform - Gelelektrophorese nach vorher beschriebenen Protokollen 14, um zu bestimmen , ob WTB-PCR erfolgreich war , und einen Mangel an Verstärkung in dem nicht-Templat zu bestätigen. </li><li> Aufreinigung von PCR-Produkt von magnetischen Kügelchen <ol><li> Entfernen magnetische Kügelchen von 4 ° C und bringt auf Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Sie 10 &amp; mgr; l PCR-Produkt zu einer neuen PCR-Platte. </li><li> Vortex kräftig die magnetischen Kügelchen vollständig die magnetischen Partikel resuspendieren. </li><li> In 18 ul magnetische Kügelchen zu jeder Vertiefung auf die neue Platte. Pipette 10 Mal mischen. </li><li> Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Platzieren Sie die PCR-Platte auf der Seite Röcke Magnetplatte für 2 Minuten zur Trennung Perlen aus der Lösung. </li><li> Den Überstand aspirieren mit einer Mehrkanalpipette, um den Wulst Pellet zu vermeiden. </li><li> Dispense 150 &amp; mgr; l 70% Ethanol in jede Vertiefung und Inkubieren bei Raumtemperatur for mindestens 30 s. Saugen Sie das Ethanol mit einer Mehrkanalpipette und Tipps verwerfen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch einmal. </li><li> Unter Verwendung einer 20 &amp; mgr; l Mehrkanalpipette die verbleibende Ethanol aus jeder Vertiefung verworfen und Spitzen abzusaugen. </li><li> Sobald Vertiefungen trocken (~ 10 min) sind, von der Magnetplatte zu entfernen, und 40 &amp; mgr; l Nuklease freies Wasser zu jeder Vertiefung und Pipettenmischung 15-mal oder vortex sanft hinzuzufügen. </li><li> Inkubiere bei Raumtemperatur für 2 min. </li><li> Platzieren Sie die PCR-Platte auf Magnetplatte für 1 min auf getrennte Perlen aus der Lösung. </li><li> Transfer 35 ul gereinigtes Produkt eine neue PCR-Platte. Dies ist gereinigte PCR-Produkt nun bereit ist, mit bidirektionaler Sequenzierung, um fortzufahren oder können, bis sie benötigt bei -20 ° C gelagert werden. HINWEIS: Wenn Sie einen neuen Test zu entwickeln, die Quantifizierung des gereinigten PCR-Produkts erforderlich. Von 1 bis 3 ng / &amp; mgr; l DNA-Amplikon ist optimal für die bidirektionale Sequenzierung. Wenn Konzentration konstant niedrig ist, erhöht PCR-Produkt und magnetische Kügelchen proportional (1: 1.8). Wenn Konzentration konstant hoch ist, mit einem größeren Volumen Wasser eluieren. </li></ol></li></ol> 3. Sequenzierung des WTB-PCR-Produkt <ol><li> Bidirektionale Sequenzierung HINWEIS: Das folgende Protokoll eine modifizierte Form der Anweisungen des Herstellers, die optimiert wurde weniger Reagenzien zu verwenden. <ol><li> Bereiten Vorwärts- und Rückwärts - Sequenzierungsreaktion vermischt sich mit 0,25 &amp; mgr; l Ready Reaction Mix, 1,88 &amp; mgr; l Sequenzierungspuffer, 1,78 &amp; mgr; M M13-F oder M13-R - Sequenzierungsprimer und fügen und DNAse, RNAse-frei, ultrareines H 2 O , um eine endgültige Lösung zu schaffen Volumen von 9 &amp; mgr; l pro Reaktion. Diese Sequenzierung Reaktionsmischung kann bis zu einem Jahr bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Pipette 9 ul der Vorwärts-Sequenzierungsreaktionsmischung in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-PCR-Platte für die Vorwärtssequenzierungsreaktion. Wiederholen Sie auf einer separaten Platte für die Rückwärtssequenzierungsreaktion. </li><li> 1 &amp; mgr; l des gereinigten WTB-PCR-Produkt to jede Vertiefung auf sowohl die Vorwärts- und Rückwärts-Platten. </li><li> Verschließen Sie die Platte und Zentrifuge kurz die Lösung erreicht den Boden jeder Vertiefung zu gewährleisten. </li><li> Laden Sie die PCR-Platte auf einem Thermocycler. <ol><li> Stellen Sie die thermozyklischen Bedingungen für die Sequenzierungsreaktion wie folgt: 96 ° C für 1 min; 30 Zyklen von 96 ° C für 10 s, 50 ° C für 5 s, 60 ° C für 4 min; zur Reinigung bei 4 ° C, bis sie bereit halten. </li></ol></li></ol></li><li> Reinige Sequenzierungsprodukte <ol><li> Eine frische Lösung von 01.25 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 100% igem Ethanol. </li><li> Bereiten Sie eine frische 70% Ethanollösung. </li><li> Zugabe von 30 &amp; mgr; l Natriumacetat / 100% Ethanol-Lösung zu jeder Vertiefung sowohl die Vorwärts- und Rückwärts-Sequenzierungsplatten und Pipetten Mischung 5 mal. </li><li> die Platte wieder zu verschließen und für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Zentrifugieren der Platte bei 2.250 xg für 15 min. </li><li> Entfernen Sie die Abklebefolie und invertieren über einen AbfallContainer. HINWEIS: Invert nur einmal oder das Pellet aus den Vertiefungsböden lösen kann. </li><li> Legen Sie die umgedrehte Platte auf einem sauberen Papiertuch und Zentrifuge bei 150 × g für 1 min. </li><li> In 150 &amp; mgr; l 70% Ethanol zu jeder Vertiefung. </li><li> Reseal die Platte und Spin bei 2.250 × g für 5 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2.6 und 3.2.7. </li><li> Wenn die Vertiefungen nicht vollständig trocken sind, damit sie bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Stellen Sie sicher, dass die Proben vor Licht geschützt werden, während Trocknen. </li><li> In 10 &amp; mgr; l Formamid in jede Vertiefung und Pipette Mix 10-mal. Reseal die Platte. </li><li> Denaturieren auf Thermocycler bei 95 ° C für 3 min um 4 ° C für 5 min. </li><li> Nach Denaturieren Ersetzen auf Sequenzierung Plattform die Plattenversiegelung mit Septen und Sequenz gemäß den Anweisungen des Herstellers 15. </li></ol></li></ol> 4. Analyse der Sequenzierungsergebnisse <ol><li> Visualisieren Sequenzierung Spuren eine Sequenzierung dat miteine Analysesoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers 16 und zu den jeweiligen Referenzsequenzen auszurichten. Richten MYD88 zu NCBI Referenzsequenz „NM_002468“. </li></ol>

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<li>Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncated+amplification%3A+a+method+for+high-fidelity+template-driven+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification.</a> BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).</li>
<li>Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+a+primer+at+a+mutation%3A+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li>
<li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/126/23/716">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716(2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die WTB-PCR - Assay beschrieben hier verwendet einen generischen Satz von Primern mit einem blockierenden Oligo während des Ausfahrens (Figur 1) zu blockieren Amplifikation von WT DNA konstruiert. Das WTB-PCR-Produkt wird dann für Mutationsanalyse sequenziert. Die Nützlichkeit der WTB-PCR / Sanger liegt in seiner Einfachheit, hohe Empfindlichkeit und hohen Durchsatz. Mit den hier beschriebenen Richtlinien, die meisten bestehenden Sanger basierte Assays können einfach über die Zugabe eines blockierenden ...

Sanger-Sequenzierung ist traditionell der Goldstandard in der Erkennung von bekannten und unbekannten somatischen Mutationen. Eine der Einschränkungen der Sanger - Sequenzierung ist die Nachweisgrenze (~ 10 - 20% mutanten Allels in einem Hintergrund von WT) 1. Dieses Maß an Empfindlichkeit ungeeignet ist für geringe somatische Mutationen erfassen, die in Proben von Geweben oder prämalignen Patienten mit wenigen zirkulierenden Tumorzellen vorhanden sein können, oder, wenn Knochenmark (BM) sind lückenhaft. Dies macht auch Resterkrankung nach der Therapie oder zum Nachweis von Schwellenresistenzmutationen während der Therapie schwierig durch konventionelle Sequenzierung allein 2 zu beurteilen. Durch Ersetzen der konventionelle PCR mit verschlossenen Nukleinsäure (LNA) -vermittelten Wildtyp - blockierende PCR (WTB-PCR) in Sanger - Sequenzierung, Empfindlichkeiten von bis zu 0,1% mutanten Allels in einem Hintergrund von WT 2, 3, 4 erreicht werden. ImWTB-PCR, Anreicherung für mutante Allele wird über die Zugabe eines kurzen erreicht (~ 10 bis 14 NT) Blocking (LNA) Oligonukleotid, das bevorzugt an WT DNA wodurch verhindert Amplifikation von WT DNA bindet. Die Mutante angereicherte WTB-PCR-Produkt kann dann sequenziert werden. WT DNA anstelle der Auswahl für spezifische Mutationen WTB-PCR ermöglicht die Anreicherung von bekannten und unbekannten Mutationen in winzigen Zellfraktionen durch die Blockierung. Mehrere Verfahren sind zum Nachweis von Mutationen in kleinen Zellen Fraktionen derzeit verwendet. Dazu gehören allelspezifische PCR Amplifikation-Refractory Mutation System (ARMS), denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DHPLC), Perlen, Emulsionen, Amplifikation und Magnetics (beaming), elektrisches Feld induzierte Freisetzung und Messung (Efirm), hochauflösende Schmelzpunkt und andere. Allerdings sind die meisten dieser Methoden begrenzt durch falsch-positive und die Fähigkeit, nur eine Mutation nachzuweisen , dass der Assay entwickelt wurde 4 </sup&gt;. WTB-PCR, jedoch ermöglicht es dem Benutzer Sequenzierungsspuren sichtbar zu machen, die den Nachweis mehrerer Mutationstypen ermöglicht und in auszuschließen Fehlalarme aufgrund Artefakte oder Desaminierung Ereignisse helfen können. Next-Generation-Sequencing (NGS) eine geeignete Alternative zu herkömmlicher Sequenzierung bieten kann jedoch wesentlich höher Kosten, Komplexität und mehr Testzeit machen ihnen eine unnötige Option für viele Krankheitstypen mit wenige verschiedenen molekularen Marker oder zur Überwachung von Patienten auf Therapie für die Schwellen Resistenzmutationen. Weiterhin hohe falsch positive Raten bei der Erkennung Varianten mit mutanten Allel - Häufigkeiten von weniger als 5% können ein Problem für Amplicon-Basis darstellen NGS 5, 6. Hier zeigen wir die Steigerung der Empfindlichkeit erreicht durch WTB-PCR in Screening auf Mutationen in dem myeloischen Differenzierungsfaktor 88 - Gen , wie durch Albitar et al. 3 MYD88 mutations sind wichtige diagnostische und prognostische Faktoren in Morbus Waldenström (WM), IgM monoklonaler Gammopathie unklarer Signifikanz (IgM-MGUS), Milz- Randzone Lymphom (SMZL) und diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL). MYD88 Mutationen sind in fast allen Fällen von WM und etwa 50% der Patienten mit Immunoglobulin M (IgM) -sezernierenden MGUS gefunden. Im Gegensatz dazu sind MYD88 Mutationen in nur 0-6% der Patienten mit SMZL und fehlt bei multiplem Myelom 7, 8 gefunden. Da überlappende morphologischen, immunphänotypische, zytogenetischen und klinische Charakteristika zwischen WM und SMZL oder IgM-multiplem Myelom häufig Differentialdiagnosen können, das Vorhandensein einer Mutation MYD88 komplizieren kann als nützlich identifiziert Faktor 9 dienen. MYD88 Mutationen auch mit einem größeren Krankheitsbelastung bei Patienten mit DLBCL und schlechter Gesamtüberlebenszeit nach der Therapie 7, in Verbindung gebracht worden </sup&gt; 10. Darüber hinaus, da MYD88 Mutationen sind häufiger in aktivierten B-Zell-like (ABC) DLBCL als Keimzentrum-B-Zell-like (GCB) DLBCL oder primärer mediastinalen B-Zell-Lymphom (PMBL), MYD88 Mutationsstatus als dienen kann gefunden Surrogatmarker für das ABC - Subtyp 11, 12. Das detaillierte Protokoll hier zur Verfügung gestellten dient als Vorlage, aus denen neue Tests entwickelt werden können, oder die meisten bestehenden Sequenzierung Assays können leicht genau angepasst werden, um Niederfrequenz Mutationen in verschiedenen Probentypen zu erkennen. Der Ansatz kann auch zur Überwachung und Erfassung resistente Mutationen verwendet werden, die in Tumoren oder sogar Bakterien entwickeln können, die sie entwickeln kann, während Patienten mit gezielter Therapie oder Antibiotika behandelt werden. Darüber hinaus richtet sie und Abhilfen viele der Probleme mit der Mutation Anreicherung verbunden sind, insbesondere in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe in Formalin fixiert.

<table><tbody><tr><td>1,5 oder 2 mL Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>100 % Alkohol</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>Histologie-Qualität; 91,5 % Ethanol, 5 % Isopropylalkohol, 4,5 % Methylalkohol</td></tr><tr><td>3730XL Sequenzierer</td><td>ABI</td><td></td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Für die PCR-Aufreinigung mit magnetischen Beads</td></tr><tr><td>Aluminium Siegelfolien</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>Für PCR und Cold Storage</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4337455</td><td>Für bidirektionale Sequenzierung. Mit 5x Sequenzierpuffer-Zentrifuge</td></tr><tr><td>5804 Series</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>A-2-DWP Rotor (für PCR-Platte)</td></tr><tr><td>Kühlplatte für 96 Well Platten</td><td>Eppendorf</td><td>Z606634</td><td></td></tr><tr><td>DNAse, RNAse-frei, Reinstwasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>10297-117</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Magnet mit seitlichem Rand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>Für den Einsatz in der PCR-Aufreinigung.</td></tr><tr><td>Ethanol Absolut&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>200 proof, für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Exiqon Website Oligo Tools</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA-Polymerase (5 U/&micro; L)</td><td>Roche</td><td>12032937001</td><td>Mit 10x konzentriertem PCR-Reaktionspuffer, mit 20 mM MgCl2</td>Gel-Elektrophoresegerät</tr><tr><td>,</td><td></td><td></td><td>2% Agarose-Gel</td></tr>, <tr><td>GeneRead DNA FFPE-Extraktionskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td> 180134 <td>Enthält Uracil-DNA-Glykosylase, die zur Reduzierung von Sequenzierungsartefakten erforderlich</td><td></td></tr><tr><td>ist, Hi-Di-Formamid</td><td>, ABI</td><td>4311320</td><td>Für die Sequenzierung.</td></tr><tr><td>LNA-Oligonukleotid</td><td>Exiqon</td><td>500100</td><td>5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA-Basen)</td></tr><tr><td>M13-F Sequencing Primer</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt</td></tr><tr><td>M13-R Sequencing Primer</td><td>ABI</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc</td></tr><tr><td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>E950030020</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge Modell 5430</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FA-45-30-11 Rotor (für 1,5/2 mL Mikrozentrifugenröhrchen)</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Forward Primer</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td></tr><tr><td>PCR Reverse Primer</td><td>IDT</td><td></td><td>5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td></tr><tr><td>PCR Platten</td><td>GeneMate</td><td>T-3107-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierer</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1.000 & Mikro; L</td></tr><tr><td>Plattensepten, 96 Well</td><td>ABI</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>Für BM-Aspirat und peripheres Blut</td></tr><tr><td>SeqScape Sortware v3.0</td><td>ABI</td><td>4474978</td><td>Für Sequenzierungsanalysen</td></tr><tr><td>Objektträgerkorb</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat (3 M, pH 5,2)</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Steril gefilterte Pipettenspitzen</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1.000 & Mikro; L</td></tr><tr><td>Thermomischer C&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Vortex genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Wash</td><td></td><td></td> reservoir<td>~ 1.000 mL</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td>Histologie-Qualität</td></tr></tbody></table>

wildtyp-blockierung pcr mit direkter sequenzierung als hochempfindliche methode kombiniert zum nachweis von low-frequency somatischer mutationen

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Eine genaue Erfassung und Identifizierung von Niederfrequenzmutationen können problematisch sein, wenn Resterkrankung nach der Therapie die Beurteilung, Screening für neue Resistenzmutationen während der Therapie, oder wenn die Patienten haben wenige zirkulierende Tumorzellen. Wildtyp durch Sequenzanalyse gefolgt PCR Blockierung bietet eine hohe Empfindlichkeit, Flexibilität und Einfachheit als Methode, diese niedrigen Frequenz Mutationen zu detektieren. Durch das Hinzufügen eines benutzerdefinierten Nukleinsäure-Oligonukleotid an ein neuen oder zuvor etablierten konventionellen PCR basierten Sequenzierungsassay entworfen verriegelte, Empfindlichkeiten von etwa 1 mutanten Allels in einem Hintergrund von 1000 WT Allele (: 1000 1) erreicht werden. Sequenzierungsartefakten im Zusammenhang mit Ereignissen Desaminierung üblicherweise in Formalin fixierten Paraffin eingebetteten Geweben teilweise durch die Verwendung von Uracil-DNA-Glycosylase während Extraktionsschritte behoben werden kann. Das optimierte Protokoll hier ist spezifisch zum Nachweis MYD88 Mutation, sondern kann als Vorlage dient jeden entwerfenWTB-PCR-Assays. Die Vorteile des WTB-PCR-Test gegenüber anderen häufig verwendeten Tests zum Nachweis von niedrigen Frequenz Mutationen einschließlich Allel-spezifische PCR und quantitative Echtzeit-PCR weniger Vorkommen von Fehlalarmen sind, eine größere Flexibilität und eine einfache Implementierung und die Fähigkeit zu erkennen, sowohl bekannte als und unbekannte Mutationen.

Eine konzeptionelle Übersicht über WTB-PCR während der Extension ist in Abbildung 1 dargestellt. Da eine einzelne Nukleotid Fehlpaarung in dem Blocker-DNA - Hybrid seine Schmelztemperatur stark abnimmt (&amp; Delta; T m = 20 - 30 ° C), die Amplifikation des WT Allel blockiert wird , während mutieren Template - DNA frei ist Verlängerung abzuschließen 17. Auf diese Weise wird mutierte DNA amplifiziert exponentiell während WT DNA linear ve...

Die Wildtyp-Blocking-PCR mit anschließender direkter Sequenzierung bietet eine hochempfindliche Methode zum Nachweis von niederfrequenten somatischen Mutationen in einer Vielzahl von Probentypen.

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, somatische Mutationen mit geringer Häufigkeit in einer Vielzahl von Probenarten nachzuweisen. Diese Methodik kann dabei helfen, zentrale Fragen in der Untersuchung somatischer Mutationen zu beantworten, indem sie den Nachweis von Mutationen mit sehr geringer Häufigkeit ermöglicht. Hier werden wir nach Mutationen im myd88-Gen in Knochenmarkproben suchen.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie äußerst genaue und empfindliche Informationen über das Vorhandensein somatischer Mutationen liefert, selbst bei nur sehr wenigen neoplastischen Zellen. Dieser auf PCR-basierende Nachweistest mit Hemmung des Wildtyps wurde entwickelt, um einen Teil von Exon fünf des MYD88-Gens zu amplifizieren und so eine Abdeckung der L265-Hotspot-Region zu gewährleisten. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer wurden mit einer 5'-M13-Sequenz konstruiert, um das Andocken komplementärer Sequenzierungsprimer zu ermöglichen.Entwerfen Sie das blockierende Oligonukleotid mit einer Länge von etwa 10 bis 15 Basen, das komplementär zur Wildtyp-Vorlage an der Stelle ist, an der eine Anreicherung des Mutanten gewünscht wird. Ein kürzeres Oligo verbessert die

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

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Dieses Video beschreibt die Wildtyp-blockierende Polymerase-Kettenreaktion (WTB-PCR), die somatische Mutationen nachweist. Bei der PCR-basierten Technik wird eine gesperrte Nukleinsäure (LNA) verwendet, ein Oligonukleotid, das an sein komplementäres Wildtyp-Allel bindet und dessen Elongation blockiert. Die Blockierung ermöglicht selektiv die Amplifikation von niedrig mutierten Allelen über ihre Wildtyp-Varianten in der Probe.

Wildtyp-blockierende PCR zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Wir beschreiben die Herstellung von mit Strichcode-DNA-Bibliotheken und die anschließende Hybridisierung Basis Exon Erfassung zur Erkennung von Schlüssel Krebs-assoziierten Mutationen in der klinischen Tumorproben von massiv parallelen Sequenzierung der "nächsten Generation". Gezielte Exon-Sequenzierung bietet die Vorteile der hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung, woraus sich eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.

Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

Dieses Manuskript beschreibt klinische Protokolle für zwei Next-Generation-Sequencing-Panels. Ein Panel befasst sich mit hämatologischen Malignomen, während das andere Panel auf Gene abzielt, die in soliden Tumoren häufig mutiert sind. Die molekulare Klassifikation von Treibermutationen bei humanen Malignomen bietet wertvolle prognostische und prädiktive Informationen.

Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

Das Ziel dieses Video ist zu zeigen, wie automatisierte DNA-Extraktion aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Referenz-Standard-Zelllinien und digitale Tröpfchen PCR (ddPCR) Analyse seltene Mutationen in einer klinischen Umgebung detektieren auszuführen. Nachweis von Mutationen in FFPE-Proben zeigt, die den klinischen Nutzen ddPCR in FFPE-Proben.

Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect

Ein integriertes System für die gezielte Next-Generation-Sequenzierung von onkologischen Proben wird beschrieben. Dieses plattformübergreifende System ist für Tumorbiopsien von geringer Qualität und geringen Mengen optimiert, ermöglicht geringe DNA-Eingaben, umfasst gut charakterisierte Mehrvariantenkontrollen und verfügt über einen neuartigen Variantenaufrufer, der auf quantitativen präanalytischen Qualitätskontrollmaßnahmen basiert.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung klonaler und subklonaler Veränderungen zwischen verschiedenen Proben eines bestimmten Patienten. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf einen bestimmten Tumortyp konzentrieren, ist der Ansatz im Großen und Ganzen auf andere solide Tumoren anwendbar.

Vergleichende Lesionsanalyse durch einen gezielten Sequenzierungsansatz

In diesem Artikel wird die Anwendung einer niederfrequenten Nachweismethode vorgestellt, die auf der Sanger-Sequenzierung beim angioimmunoblastischen Lymphom basiert. Schaffen Sie eine Grundlage für die Anwendung dieser Methode auf andere Krankheiten.

Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Einzelne Zell Sequenzierung ist ein immer beliebter und zugängliches Werkzeug für genomische Veränderungen bei hoher Auflösung Adressierung. Wir bieten ein Protokoll, das einzelne Zelle Sequenzierung verwendet Kopienzahl Veränderungen in einzelnen Zellen zu identifizieren.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Lernen Sie die Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung zur hochempfindlichen Detektion seltener somatischer Mutationen im myd88-Gen aus Knochenmarkproben. Diese Methode ermöglicht präzise Ergebnisse selbst bei geringem Anteil neoplastischer Zellen.

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen (Video) | JoVE Journal

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

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