De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

O objetivo geral deste procedimento é detectar mutações somáticas de baixa frequência em uma variedade de tipos de amostra. Essa metodologia pode ajudar a responder a perguntas-chave no teste de mutação somática, facilitando a detecção de mutações de frequência muito baixa. Aqui procuraremos mutações no gene myd88 em amostras de medula óssea.

A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece informações altamente precisas e sensíveis sobre a presença de mutações somáticas, mesmo com pouquíssimas células neoplásicas. Este ensaio de sequenciamento baseado em PCR de bloqueio de tipo selvagem foi desenvolvido para amplificar parte do éxon cinco no gene myd88, garantindo a cobertura do hotspot L265. Os primers para frente e para trás foram projetados com uma sequência M13 de cinco primos para permitir um ajoelhar de primers de sequenciamento complementares.

Projete o oligonucleotídeo de bloqueio para ter aproximadamente 10 a 15 bases de comprimento e complementar ao modelo do tipo selvagem onde o enriquecimento mutante é desejado. Um oligo mais curto melhorará a discriminação de incompatibilidade. Para atingir uma alta especificidade de alvo, é importante não usar muito dos nucleotídeos de bloqueio, pois isso resultará em oligonucleotídeos muito pegajosos.

Para projetar o oligonucleotídeo de bloqueio, comece navegando até o site da Oligo Tools. Selecione a ferramenta de previsão Oligo TM. Uma nova janela será aberta.

Cole a sequência do modelo de tipo selvagem a ser bloqueado na caixa de sequência oligo. Adicione um sinal de mais na frente das bases do bloqueador para marcá-las. Clique no botão calcular para determinar a TM aproximada do híbrido bloqueador de DNA.

As temperaturas de fusão calculadas aparecerão nas caixas abaixo. Projete o oligo de bloqueio para ter uma temperatura de fusão de 10 a 15 graus Celsius acima da temperatura de extensão durante a termociclagem. Aqui, a temperatura de extensão é de 72 graus Celsius.

Para ajustar a temperatura de fusão, adicione, remova ou substitua as bases de bloqueio. Evite longos trechos de três a quatro bases C ou G de bloqueio. Em seguida, para evitar a formação de estrutura secundária ou autodimerização, volte para a tela inicial do site Oligo Tools e selecione a ferramenta Oligo Optimizer.

Uma nova janela será aberta. Cole a sequência do modelo de tipo selvagem a ser bloqueado na caixa. Adicione um sinal de mais para indicar bases de bloqueio.

Selecione as duas caixas para estrutura secundária e somente para si e pressione o botão analisar para ver as pontuações de hibridização e estrutura secundária. Essas pontuações representam estimativas muito aproximadas das temperaturas de fusão dos autodímeros e estruturas secundárias, respectivamente. Pontuações mais baixas são ideais e podem ser alcançadas limitando o emparelhamento de bloqueadores de bloqueadores.

Remova ou reposicione os nucleotídeos bloqueadores para obter pontuações mais baixas. O oligonucleotídeo de bloqueio otimizado para myd88 mostrado aqui atinge um equilíbrio entre a temperatura de fusão do híbrido bloqueador de DNA e as pontuações de hibridização e estrutura secundária baixas o suficiente. Ele foi projetado para cobrir os aminoácidos Q262 a I266 e apresenta um DT invertido de três primos para inibir a extensão pela DNA polimerase e a degradação por três exonucleases primárias.

Uma vez que os primers tenham sido projetados, configure o PCR de bloqueio do tipo selvagem e execute a termociclagem conforme descrito no documento anexo. Remova as esferas magnéticas do armazenamento a quatro graus Celsius e leve-as à temperatura ambiente. Transfira 10 microlitros do produto PCR para uma nova placa PCR.

Vortex as esferas magnéticas vigorosamente para ressuspender totalmente as partículas magnéticas e, em seguida, adicione 18 microlitros de esferas magnéticas a cada poço na nova placa. Pipete para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Em seguida, incube a placa em temperatura ambiente por cinco minutos.

Após a incubação, coloque a placa de PCR na placa magnética com saia lateral por dois minutos para separar os grânulos da solução. Use uma pipeta multicanal para aspirar o sobrenadante. Tome cuidado para evitar o grânulo do grânulo.

Em seguida, dispense 150 microlitros de etanol a 70% em cada poço e incube a placa em temperatura ambiente por pelo menos 30 segundos. Em seguida, aspirar o etanol com uma pipeta multicanal e rejeitar as pontas. Repita este procedimento de lavagem mais uma vez.

Usando uma pipeta multicanal de 20 microlitros, aspire o etanol restante de cada poço e descarte as pontas. Depois de permitir cerca de 10 minutos para que os poços da placa sequem, remova-a do ímã e adicione 40 microlitros de água livre de nuclease a cada poço. Pipete para cima e para baixo 15 vezes para misturar.

Em seguida, incube em temperatura ambiente por dois minutos. Após a incubação, coloque a placa de PCR de volta na placa magnética por um minuto para separar as esferas da solução. Transfira 35 microlitros de produto purificado para uma nova placa de PCR e execute o sequenciamento bidirecional conforme descrito no documento anexo.

Uma vez que o sequenciamento bidirecional tenha sido realizado para purificar os produtos de sequenciamento, prepare uma nova solução em 25 de acetato de sódio de três molares em PH 5,2 e etanol 100%. Prepare também uma nova solução de etanol a 70%. Para cada poço das placas de sequenciamento direto e reverso, adicione 30 microlitros de acetato de sódio em etanol 100% e pipete para cima e para baixo cinco vezes para misturar.

Em seguida, feche novamente a placa e incube no escuro em temperatura ambiente por 20 minutos. Decorridos 20 minutos, centrifugue a placa a 2.250 vezes G durante 15 minutos. Após a centrifugação, remova o selador de placas e inverta a placa uma vez sobre um recipiente de resíduos.

Se a placa for invertida várias vezes, os pellets podem se soltar do fundo do poço. Coloque a placa invertida sobre uma toalha de papel limpa e centrifugue a 150 vezes G por um minuto. Em seguida, adicione 150 microlitros de etanol a 70% em cada poço e feche novamente a placa.

Gire a 2.250 vezes G por cinco minutos. Em seguida, repita o processo de remoção do selador de placas e inversão da placa. Se os poços não estiverem completamente secos, deixe-os secar ao ar livre em temperatura ambiente.

Certifique-se de que as amostras estejam protegidas da luz. Quando os poços estiverem completamente secos, adicione 10 microlitros de formamida a cada poço e pipete para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Feche novamente a placa.

Desnature usando um termociclador a 95 graus Celsius por três minutos, seguido de quatro graus Celsius por cinco minutos. Após a desnaturação, substitua o selador de placas por um septo e seqüenciar em uma plataforma de sequenciamento de acordo com as instruções do fabricante. Usando o software de análise de sequência, visualize os traços e alinhe as sequências com as sequências de referência apropriadas.

Alinhe myd88 à sequência de referência do NCBI NM002468. O DNA genômico de pacientes com e sem mutações foi submetido a PCR de bloqueio convencional e selvagem e os produtos de PCR resultantes foram então sequenciados. Como pode ser visto aqui, o alelo mutante foi enriquecido quando a PCR de bloqueio do tipo selvagem foi realizada, e falsos positivos não foram vistos no DNA do tipo selvagem.

Uma queda característica na intensidade do sinal, como mostrado aqui, é frequentemente observada se uma concentração muito alta de bloqueador for usada ou se a purificação pós-PCR falhar em remover o bloqueador antes do sequenciamento bidirecional. Isso ocorre quando a purificação enzimática é realizada no lugar da purificação do grânulo magnético. Qualquer ensaio baseado em PCR que enriqueça os alelos mutantes detectará artefatos de baixa frequência.

Esses traços mostram um aumento nos artefatos de sequenciamento de CG, em relação aos artefatos de TA no tecido FFPE quando a citosina ou a citosina metilada são desaminadas por meio de infixação formal em uracila ou tiamina, respectivamente. A uracila DNA glicosilase ou UDG pode extirpar uracila antes da PCR de bloqueio do tipo selvagem, ajudando a reduzir os artefatos de sequenciamento. No entanto, a tiamina resultante da desaminada cinco metilcitosina, que ocorre frequentemente nas ilhas CPG, não pode ser excisada pela UDG.

Diminuir a concentração de bloqueador usado na PCR de bloqueio do tipo selvagem pode ajudar a reduzir a ocorrência de artefatos de sequenciamento que não são remediados pelo tratamento com UDG. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como testar mutações somáticas com alto grau de precisão e sensibilidade, usando a técnica de bloqueio de tipo selvagem. O princípio desta tecnologia pode ser aplicado à detecção de mutações em pequenas subpopulações de células.

Portanto, tem utilidade na detecção de doença residual mínima, monitoramento de pacientes e previsão de recidiva precoce em pacientes com várias neoplasias.