PCR de bloqueio de tipo selvagem para detectar mutações somáticas de baixa frequência

A reação em cadeia da polimerase bloqueadora do tipo selvagem, ou WTB-PCR, detecta mutações pontuais amplificando seletivamente alelos mutantes de baixa abundância enquanto inibe a amplificação de alelos de tipo selvagem de alta abundância em amostras de DNA.

O WTB-PCR utiliza ácidos nucléicos bloqueados, ou oligonucleotídeo modificado de fita simples contendo LNA, complementar à fita de DNA do tipo selvagem da amostra que se liga especificamente à fita complementar. A ligação de LNA bloqueia a atividade da DNA polimerase e inibe o alongamento do DNA molde do tipo selvagem.

Para realizar WTB-PCR, pegue uma mistura mestre contendo dNTPs, LNAs e primers diretos e reversos específicos do alvo em água destilada livre de nuclease.

Adicione uma solução termoestável contendo DNA polimerase ao tubo e pipete a mistura no poço de uma placa de PCR. Adicione a amostra de DNA genômico contendo DNA selvagem e mutante no poço e comece a PCR.

Durante a PCR, a desnaturação mediada por alta temperatura separa os DNAs de fita dupla. As fitas separadas atuam como modelos para os primers recozerem, enquanto o LNA se liga à sua fita complementar de DNA do tipo selvagem e forma o híbrido de DNA do tipo selvagem bloqueador. Em uma temperatura mais alta, a DNA polimerase adiciona dNTPs e estende os moldes de primer-DNA.

Uma temperatura de fusão mais alta do híbrido LNA-DNA do que o complexo DNA-DNA o mantém intacto. A modificação do LNA eventualmente impede que a DNA polimerase estenda o híbrido LNA-DNA, o que inibe seu alongamento.

Ao longo de vários ciclos de PCR, o bloqueio mediado por LNA aumenta o número de amplicons do tipo mutante em relação à sua variante do tipo selvagem na amostra, ajudando na detecção seletiva.

Os primers direto e reverso foram projetados com uma sequência 5'-M13 para permitir o recozimento de primers de sequenciamento complementares. Projete o oligonucleotídeo de bloqueio para ter aproximadamente 10 a 15 bases de comprimento e complementar ao modelo do tipo selvagem onde o enriquecimento mutante é desejado.

Um oligo mais curto melhorará a discriminação de incompatibilidade. Para atingir uma alta especificidade de alvo, é importante não usar muito dos nucleotídeos de bloqueio, pois isso resultará em um oligonucleotídeo muito "pegajoso".

Para projetar o oligonucleotídeo de bloqueio, comece navegando até o site da Oligo Tools. Selecione a ferramenta "Oligo T_M Prediction". Uma nova janela será aberta. Cole a sequência do modelo de tipo selvagem a ser bloqueado na caixa "Oligo Sequence". Adicione um sinal de mais na frente das bases do bloqueador para marcá-las. Clique no botão "Calcular" para determinar_{o TM} aproximado do híbrido bloqueador de DNA. As temperaturas de fusão calculadas aparecerão nas caixas abaixo.

Projete o oligo de bloqueio para ter uma temperatura de fusão de 10 a 15 graus Celsius acima da temperatura de extensão durante a termociclagem. Aqui, a temperatura de extensão é de 72 graus Celsius. Para ajustar a temperatura de fusão, adicione, remova ou substitua as bases de bloqueio. Evite longos trechos de três a quatro bases C ou G de bloqueio.

Em seguida, para evitar a formação de estrutura secundária ou autodimerização, volte para a tela inicial do site Oligo Tools e selecione a ferramenta "Oligo Optimizer". Uma nova janela será aberta. Cole a sequência do modelo de tipo selvagem a ser bloqueado na caixa. Adicione um sinal de mais para indicar bases de bloqueio. Selecione as duas caixas para "Estrutura Secundária" e "Somente Auto" e pressione o botão "Analisar" para ver as pontuações de hibridização e estrutura secundária.

Essas pontuações representam estimativas muito aproximadas das temperaturas de fusão dos autodímeros e estruturas secundárias, respectivamente. Pontuações mais baixas são ideais e podem ser alcançadas limitando o emparelhamento bloqueador-bloqueador. Remova ou reposicione os nucleotídeos bloqueadores para obter pontuações mais baixas. O oligonucleotídeo de bloqueio otimizado para MyD88, mostrado aqui, atinge um equilíbrio entre a temperatura de fusão do híbrido bloqueador de DNA e pontuações de hibridização e estrutura secundária baixas o suficiente.

Ele foi projetado para cobrir os aminoácidos Q262 a I266 e apresenta um dT 3'-invertido para inibir tanto a extensão pela DNA polimerase quanto a degradação pela 3'-exonuclease. Uma vez que os primers tenham sido projetados, configure a PCR de bloqueio do tipo selvagem e execute a termociclagem, conforme descrito no documento anexo.