Funktionelle Manipulation der mütterlichen Gene Produkte verwenden In Vitro Oozytenreifung in Zebrabärbling

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die In-vitro-Reifung von Zebrafisch-Eizellen durchzuführen und, falls gewünscht, mütterliche Genprodukte vor der Befruchtung funktionell zu manipulieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie zu beantworten, die sich auf die Bedeutung des mütterlichen Beitrags zum Embryo beziehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, Eizellen in vitro zu kultivieren, gefolgt von der Befruchtung und der Produktion lebensfähiger Embryonen.

Und ermöglicht auf Wunsch die funktionelle Manipulation von mütterlichen Genprodukten, die im frühen Embryo unmittelbar nach der Befruchtung wirken. Zu Beginn verwenden Sie acht bis 10 Tage vor der In-vitro-Kulturmanipulation ein Netz, um mehrere Sätze eines einzelnen männlichen und eines weiblichen Fisches des gewünschten Stammes in ein Paarungsbecken zu übertragen. Lassen Sie sie über Nacht im Gegenbecken.

Nachdem Sie die Fische am folgenden Nachmittag paaren lassen, verwenden Sie ein Netz, um die Weibchen, die während der Paarung Eier abgeben, zu trennen und in ein separates Becken zu setzen. Füttern Sie diese Weibchen zweimal täglich mit einer Futtermischung, die etwa die gleiche Menge an Artemie, Garnelen und Fischfutterflocken enthält. Geben Sie unter sterilen Bedingungen 20 Milliliter L-15 Medium von Leibovitz mit L-Glutamin, PH 7,0, in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Verwenden Sie dann 10 Normales Natriumhydroxid, um es auf PH 9,0 zu bringen. Geben Sie 9 Milliliter L-15 Medium in zwei separate konische 50-Milliliter-Röhrchen. Beschriften Sie dann ein Röhrchen mit DHP und das andere mit DHP.

Geben Sie in das DHP-Röhrchen 10 Mikroliter DHP, 490 Mikroliter DH2O und 500 Mikroliter 10% BSA. Fügen Sie in das DHP-Röhrchen 100 Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter Gentamicin, 400 Mikroliter DH2O und 500 Mikroliter 10% BSA hinzu. Um die Eizellen zu dissektionieren, beginnen Sie mit der Herstellung einer 0,2%igen Tricain-Stammlösung in DH2O, die auf PH 7,0 gepuffert ist, mit einem molaren Tris PH 9,0

Halten Sie diese Lösung bei 4 Grad Celsius. Null bis vier Stunden vor dem Ende des täglichen Lichtzyklus in der Anlage in einem 250-Milliliter-Becherglas 20 Milliliter 0,2%ige Tricain-Stammlösung, PH 7,0, zu 80 Millilitern Fischwasser geben und mischen. Es ist wichtig, den Eingriff innerhalb von vier Stunden nach dem Ende des Tageslichtzyklus zu beginnen, an den die Fische gewöhnt sind.

Andernfalls reifen die Eizellen nicht richtig aus. Sammeln Sie den euthanasierten Fisch mit einem Löffel aus der Tricainlösung und spülen Sie ihn kurz in Fischwasser ab. Legen Sie den Fisch dann auf ein Papiertuch, um überschüssiges Wasser aufzusaugen.

Verwende eine saubere Rasierklinge, um den eingeschläferten Fisch auf Höhe der Brustflosse zu enthaupten. Machen Sie dann mit einer Präparierschere einen Längsschnitt auf der ventralen Seite des Fisches, der sich vom vorderen Ende bis zum Analbereich erstreckt. Legen Sie den Fisch auf eine Petrischale unter einem Präpariermikroskop mit einfallendem Licht.

Isolieren Sie dann mit einer Präparierzange Teile der Eierstöcke und überführen Sie das Gewebe in eine 35 x 10 Millimeter große Kulturschale, die vier Milliliter L-15 Meidum, DHP, von Leibovitz enthält. Trennen Sie nun mit einer Präparierzange die Eizellen vorsichtig von der Follikelmasse. Sortieren Sie die vier Eizellen im Frühstadium, die nahezu die maximale Größe haben und durch ein dunkles, undurchsichtiges Zytoplasma und ein leicht sichtbares Keimvesikel (GV) gekennzeichnet sind, das sich asymmetrisch in der Eizelle befindet.

Entsorgen Sie Eizellen in früheren Stadien und durchscheinende reife Eizellen im Stadium 5. Verwenden Sie eine Weidepipette aus Glas, um die vier Eizellen im Frühstadium in eine zweite 35 x 10 Millimeter große Kunststoffkulturschale zu übertragen, die vier Milliliter L-15 Medium von Leibovitz plus DHP enthält. Übertragen Sie minimale Mengen an Minus-DHP-Medium in die Schale, die die Plus-DHP-Lösung enthält.

Wenn Sie mRNA injizieren, verwenden Sie unmittelbar vor der Injektion Umkehrosmosewasser in RNA-Qualität und 0,2 molare Kaliumchloride, um die MRNA auf eine endgültige Lösung von 0,1 molaren Kaliumchlorid zu verdünnen. Wenn Sie unmittelbar vor der Injektion Morpholinos oder MOs injizieren, verdünnen Sie die MOs auf die gewünschte Konzentration unter Verwendung von Umkehrosmosewasser in RNA-Qualität und 0,2 molaren Kaliumchlorid, um eine Endkonzentration von 0,1 molaren Kaliumchlorid zu erreichen. Um die Injektion durchzuführen, halten Sie die Eizellen manuell mit einer feinen Pinzette fest und injizieren Sie mit einer Nadel aus einer gezogenen Glaskapillarpipette etwa einen Nanoliter in die Eizellen des Wildtyp-Stadiums vier.

Inkubieren Sie die unreifen und injizierten Eizellen weiter in DHP-Medium bei 26,5 Grad Celsius. Etwa alle 30 Minuten wird überprüft, um sicherzustellen, dass die Eizellen intakt bleiben und eine ordnungsgemäße Reifung durchlaufen, indem sie schrittweise durchscheinend werden. Verwenden Sie eine Weidepipette, um alle lysierenden Eizellen zu entfernen.

Und entsorgen Sie sie in einem Laborabfallbecher, um die Qualität des Mediums zu erhalten. Bei etwa der Hälfte des Volumens an frischem DHP-Medium ist das Nährmedium je nach Menge der Eizelllyse auszutauschen, um eine klare Lösung zu erhalten. Wenn die Mehrheit der Eizellen durchscheinend geworden ist und eine GV hat, die nicht mehr sichtbar ist, verwenden Sie eine extrafeine Pinzette, um einen Riss in die Follikelmembran zu machen, in einer Region mit vergrößertem Abstand zwischen der Eizelle und der Membran.

Ziehe einen Teil der Membran ab und rolle die Eizelle aus der Membran, während du den geschälten Teil gedrückt hältst. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Entfernung der Follikelmembran. Wird diese Schicht nicht vollständig entfernt, wird die Befruchtung und die Chorionenausdehnung behindert.

Übertragen Sie die defollikulierten Eizellen in einem minimalen Volumen Medium in eine Petrischale mit einigen Tropfen DHP-Kulturmedium und fahren Sie mit der Befruchtung fort. Gegen Ende des Eizellreifungsschritts und vor der Defollikulation bereiten Sie eine Samenlösung mit den Hoden von fünf Männern in 500 Mikrolitern Hank-Lösung vor. Geben Sie 10 bis 50 Mikroliter Samenlösung zu den defollikulierten Eizellen im DHP-Kulturmedium.

Warten Sie dann 10 Sekunden. Geben Sie mit einer Pipette einige Tropfen E3-Medium in die Eizellen. Warten Sie eine Minute und verwenden Sie dann E3 Medium, um die Platte zu fluten.

Nachdem Sie die befruchteten Embryonen entwickelt haben, verwenden Sie ein Präpariermikroskop mit Durchlichtoptik, um den Fortschritt durch die Spaltungsstadien zu beobachten und eine erfolgreiche Befruchtung zu gewährleisten, wie zuvor für die Befruchtung und das Staging beschrieben. Wie die Expression von GFP zeigt, sind Eizellen aus In-vitro-Kulturen in der Lage, während der gesamten Eizellentwicklung in nur zwei Stunden Protein aus exogener mRNA zu produzieren. Allerdings können sich nur Eizellen, die im vierten Stadium der Oogenese Kulturbedingungen einleiten, zu reifen Eizellen im fünften Stadium entwickeln.

In diesem Experiment rettet injizierte Wildtyp-Aurora-B-mRNA die phänotypischen Effekte einer Mutation in ihrem entsprechenden Gen, der zellulären Insel. Auch die Embryonen aus einer Kontrollgruppe dürfen sich entwickeln, um den entsprechenden mutierten Phänotyp zu zeigen. Die Injektion eines translationsblockierenden Morpholino kann den bekannten mutierten Phänotyp erfolgreich phänokopieren, wie die Injektion von lrmp-MO in Eizellen zeigt, die den mutierten Phänotyp des entsprechenden mutationsvergeblichen Zyklus nachahmt.

mRNA-kodierende Eizellen können auch entweder in Wildtyp- oder mutierte Eizellen injiziert werden, um die entsprechenden Produkte im frühen Embryo sichtbar zu machen. Wie hier zu sehen ist, lokalisiert das Sass6-mCherry-Protein beispielsweise an Foki, die durch den Zentrosommarker Gammatubulin markiert sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 5 bis 6 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Verfahren nicht zu überstürzen und eine ordnungsgemäße Reifung der Eizellen vor der Defollikulation und Befruchtung zu ermöglichen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Fixierung von Embryonen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zum Beispiel die Rettung Ihres Gens von Interesse oder die Lokalisierung von RNA oder Protein.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der frühen Embryogenese, um den Beitrag mütterlicher Genprodukte im Zebrafisch zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mütterliche Genprodukte durch In-vitro-Reifung von Zebrafisch-Eizellen funktionell manipuliert.