Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Funktionalität der neuromuskulären Verbindung mit Hilfe eines ex vivo experimentellen Ansatzes zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem die Muskelnervenvorbereitung auf zwei Arten stimuliert wird, direkt auf der Muskelmembran und durch den Nerv. Da bei der Membranstimulation die Neurotransmissionssignale umgangen werden, können Unterschiede zwischen den beiden kontraktilen Reaktionen als indirekte Messung der Funktionalität des neuromuskulären Übergangs angesehen werden.

Hier stellen wir dieses Verfahren bei der Präparation des Ischiasnervs soleus vor. Der Muskel wird zusammen mit seinem Nerv präpariert und in ein perfundiertes Gewebebad gelegt. Er ist an einem Kraft- und Längenregler befestigt und ein Platin-Elektrodenpaar wird parallel zum Muskel platziert.

Anschließend wird eine Saugelektrode aus Glas nahe an das abgeschnittene Ende des Nervs bewegt. Anschließend wird ein umfassendes Testprotokoll angewendet, um sowohl die neuromuskuläre Verbindung als auch die Muskelfunktion gründlich zu bewerten. Die funktionelle Verbindung zwischen Muskel und Nerv ist sowohl für den Teil als auch für zwei überlebende Fraktionen eine Schlussfolgerung.

In der ersten Region der Ebene jedes der beiden Gewebe kommunizieren, dass diese neuromuskuläre Verbindung, die normalerweise eine druckähnliche Morphologie aufweist. Nichtsdestotrotz ist bei verschiedenen pathologischen Zuständen die Funktionalität des Zusammenspiels zwischen Muskel und Nerv stark beeinträchtigt und die neuromuskuläre Verbindung verliert ihre komplexe morphologische Organisation. Das übergeordnete Ziel unseres Verfahrens ist es, die Funktionalität der neuromuskulären Verbindung mit Hilfe eines ex vivo experimentellen Ansatzes zu untersuchen.

Dies wird durch die Stimulierung der Muskelnervenvorbereitung auf zwei Arten erreicht. Zum einen durch direkte Stimulation der Muskelmembran und zum anderen durch Stimulation des Nervs und Analyse der Muskeleigenschaften. Schalten Sie das Umlaufwasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 30 Grad Celsius ein.

Füllen Sie das Bad mit der Krebs-Ringer-Lösung. Lassen Sie O-Punkt vier bar Gasgemisch durch das Oxirohr in das Bad strömen. Schalten Sie den Aktuator-Wandler und die beiden Impulsstimulatoren ein.

Stellen Sie die aktuellen Werte für die Membranstimulation auf 300 Millionen Paare und für die Nervenstimulation auf fünf Millionen Paare ein. Nachdem Sie die Maus durch eine Gebärmutterhalsluxation geopfert haben, entfernen Sie die Haut von den Beinen. Schneiden Sie nun die Achillessehne ab und ziehen Sie unter festem Klammern der Sehne den Musculus gastrocnemius und den Soleus zusammen nach oben.

Sobald die proximale Sehne des Soleus freigelegt ist, schneiden Sie die gesamte Wade darüber ab und legen Sie die Probe schnell in das vorbereitende Gewebebad, das sich unter dem Stereomikroskop befindet. Klemmen Sie mit einer Pinzette die proximale Sehne des Soleus fest und ziehen Sie vorsichtig daran, um die Ischiasinnervation freizulegen. Sobald die Innervation freigelegt ist, entfernen Sie das umgebende Gewebe, um etwa fünf Millimeter des Nervs freizulegen.

Schneide dann mit einer feinen Schere vorsichtig den Nerv ab. Vervollständigen Sie die Exzision von Muskel und Nerven, indem Sie die Achillessehne durchtrennen, um den Soleus vom Gastrocnemius zu trennen. Jetzt ist die Muskel- und Nervenpräparation bereit, um auf das Testgerät montiert zu werden.

Am Ende des Nylonfadens einen Kettknoten anlegen und um die Achillessehne festziehen. Klemmen Sie die proximale Sehne in die feste Klemme und binden Sie den Nylondraht um den Hebelarm des Kraftaufnehmers. Lassen Sie den Muskel in der Lösung ausbalancieren.

Um die anfängliche optimale Länge zu bestimmen, stimulieren Sie den Muskel mit einer Reihe von Einzelimpulsen, während Sie den Kriechlastwert sanft ändern. Die optimale Länge wird erreicht, wenn die Zuckenkraft maximal ist. Platzieren Sie die Saugelektroden in der Nähe des Muskels und ziehen Sie den Nerv ein.

Stimulieren Sie dann, während Sie den Impulsstromwert sanft verändern, den Muskel mit einer Reihe von Einzelimpulsen. Die Zuckungskraft, die der Muskel bei Stimulation durch den Nerv erzeugt, sollte den Werten entsprechen, die bei der Stimulation auf der Membran gemessen werden. Ist der optimale Stromwert ermittelt, schieben Sie den Nerv aus der Elektrode und geben Sie einige Stromimpulse ab.

Wenn die Menge des zuvor gewählten Stroms zu hoch ist, lösen die durch die Saugelektrode abgegebenen Stromimpulse die Muskelkontraktion aus, indem sie Strom durch das Bad leiten. Mit Hilfe einer selbstgemachten Software haben wir ein automatisiertes Testprotokoll zur Untersuchung der Funktionalität der neuromuskulären Verbindung des Soleus entwickelt. Das Protokoll dauert ca. 65 Minuten und setzt sich aus vier verschiedenen Teilen zusammen.

Im ersten Teil wird der Muskel mit vier Einzelimpulsen stimuliert. Zwei direkt und zwei durch den Nerv. Die Zeit bis zum Peak, die halbe Relaxationszeit, der Maximalwert der Kraftableitung und die Zuckungskraft werden dann aus den Twitch-Reaktionen gemessen.

Im zweiten Teil wird der Muskel mit einer Reihe von Pulsfolgen stimuliert, die von 20 Hertz bis 80 Hertz reichen, was der tetanischen Frequenz entspricht. Um die Kraft zu berechnen, werden Frequenzkurven sowohl für Nerven- als auch für direkte Stimulationen verwendet. Im dritten und vierten Teil des Protokolls wird der Muskel zwei Ermüdungsparadigmen unterzogen, um das Versagen der Neurotransmission und die intratetanische Ermüdung zu messen.

Während dieser Ermüdungsparadigmen wird der Muskel kontinuierlich stimuliert, wobei ein Impulszug auf die Membran abgegeben wird, gefolgt von 14 Impulszügen, die über den Nerv abgegeben werden. Die gesamte Sequenz wird 20 Mal wiederholt. Das erste Paradigma wird mit einer Zündfrequenz von 35 Hertz abgegeben.

Die zweite bei der tetanischen Frequenz von 80 Hertz. Es wird angenommen, dass das Versagen der Neurotransmission eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Ermüdung spielt, da es mit dem externen Block der Ausbreitung des Aktionspotentials, der verminderten Transmitterfreisetzung und der verminderten Erregbarkeit der Ermüdungsfähigkeit der Platte zusammenhängt. Ein weiterer Aspekt der Ermüdungsfähigkeit der neuromuskulären Verbindung wird deutlich durch die intratetanische Ermüdung ausgedrückt, die eine Schätzung der Fähigkeit des Muskels ist, die Kraft während einer einzelnen tetanischen Kontraktion aufrechtzuerhalten, und die hochfrequente Ermüdung widerspiegelt.

Am Ende des Protokolls werden die Nettomuskellänge und das Gewicht mit einem analogen Messschieber und einer Präzisionswaage gemessen, um die Muskelquerschnittsfläche zu berechnen. Studien am SOD1-transgenen Mausmodell der amyotrophen Lateralsklerose haben das Potenzial dieser Methode hervorgehoben. Tatsächlich führen die transgenen Soleus-Muskeln zu einer reduzierten kontraktilen Reaktion sowohl der Kraftableitung als auch der tetanischen Kraft, wenn sie direkt stimuliert werden, und einer noch stärkeren Reduktion, wenn sie durch den Nerv stimuliert werden.

In Bezug auf die tetanische Kraft zum Beispiel haben diese Experimente gezeigt, dass die Muskelkontraktilität für 25 % der Schäden verantwortlich ist, während weitere 45 % mit Defekten in der Neurotransmission zusammenhängen. Ein weiterer interessanter Punkt ist das Fehlen eines Unterschieds in den Kontrollmuskeln, wenn sie direkt oder indirekt stimuliert werden. Dieser Befund beweist, dass die Methodik keine technischen Artefakte induziert, da davon ausgegangen wird, dass die neuromuskuläre Verbindung bei Kontrolltieren voll funktionsfähig ist.

In Bezug auf die intratetanische Ermüdung zeigten die Ergebnisse signifikant niedrigere Werte bei transgenen Soleus-Muskeln als bei ihren Kontroll-Pendants. Interessanterweise wird der transgene Soleus-Muskel durch wiederholte Stimulation erheblich geschädigt, was bedeutet, dass die Funktionalität der neuromuskulären Verbindung für eine maximale Stimulationszeit von acht Minuten bewertet werden kann. Nach acht Minuten kehrt der transgene Muskel bei Stimulation zu einem Kraftwert von fast Null zurück.

Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie verstanden haben, wie man die Funktionalität der neuromuskulären Verbindung und des Soleus-Muskels der Maus misst. Da diese Technik auf einer indirekten Messung der Funktionalität des neuromuskulären Übergangs basiert, ist es nicht möglich, wenn die gemeldeten Defekte mit morphologischen oder biochemischen Veränderungen zusammenhängen. Andererseits stellt dieser Ansatz eine wesentliche Methode dar, um zu beurteilen, ob diese Aggressionen die Funktionalität des Neuroübertragungssignals beeinflussen.

Schließlich kann der Protokollvorschlag leicht übernommen werden, um die Funktionalität des neuromuskulären Übergangs des Zwerchfells zu messen, einem weiteren Muskel, der häufig an pathologischen Erkrankungen beteiligt ist.