Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Funktion der neuromuskulären Endplatte mittels eines ex vivo-experimentellen Ansatzes zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem die Muskelnerv-Präparation auf zwei Arten stimuliert wird: direkt an der Muskelmembran und über den Nerv. Da die Membranstimulation die neuronale Signalübertragung umgeht, können Unterschiede zwischen den beiden kontraktilen Reaktionen als indirekte Messung der Funktionalität der neuromuskulären Endplatte betrachtet werden.

Hier stellen wir dieses Verfahren an der Soleus-Skelettnerv-Präparation vor. Der Muskel wird zusammen mit seinem Nerv disseziert und in ein perfundiertes Gewebekörbchen gegeben. Er wird an einem Kraft- und Längenregler befestigt, und ein Paar Platinelektroden wird parallel zum Muskel angeordnet.

Eine gläserne Saugelektrode wird dann nahe an das durchtrennte Nervenende herangeführt. Anschließend wird ein umfassendes Testprotokoll angewendet, um sowohl die neuromuskulare Junction als auch die Muskel-Funktionalität gründlich zu bewerten. Die funktionelle Verbindung zwischen Muskel und Nerv ist entscheidend für beide Teile und die überlebende Fraktion.

Im ersten Bereich des Niveaus jedes der beiden Gewebe kommunizieren diese neuromuskulären Endplatten, die normalerweise eine druckähnliche Morphologie aufweisen. Dennoch ist bei mehreren pathologischen Zuständen die funktionelle Wechselwirkung zwischen Muskel und Nerv stark beeinträchtigt, und die neuromuskulären Endplatten verlieren ihre komplexe morphologische Organisation. Das übergeordnete Ziel unseres Verfahrens besteht darin, die Funktionalität der neuromuskulären Endplatten mithilfe eines ex vivo-experimentellen Ansatzes zu untersuchen.

Dies wird erreicht, indem das Muskel-Nerv-Präparat auf zwei Arten stimuliert wird: einmal durch direkte Stimulation der Muskelmembran und einmal durch Stimulation des Nervs, um die Muskeleigenschaften zu analysieren. Schalten Sie das zirkulierende Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 30 Grad Celsius ein.

Füllen Sie das Bad mit der Krebs-Ringer-Lösung. Lassen Sie 0,4 bar Gasgemisch durch das Oxitub und in das Bad strömen. Schalten Sie den Aktuator-Transducer und die beiden Puls-Stimulatoren ein.

Stellen Sie die Stromwerte auf 300 Millionen Paare für die Membranstimulation und auf fünf Millionen Paare für die Nervenstimulation ein. Nachdem die Maus durch Halswirbelverrenkung getötet wurde, entfernen Sie die Haut von den Beinen. Schneiden Sie nun die Achillessehne durch und ziehen Sie, während Sie die Sehne fest eingespannt halten, den Musculus gastrocnemius und den Musculus soleus gemeinsam nach oben.

Wenn das proximale Sehnenende des Musculus soleus freigelegt ist, den gesamten Wadenmuskel oberhalb davon durchtrennen und die Probe schnell in das vorbereitete Gewebeprophylaxiebad unter dem Stereomikroskop legen. Mit einer Pinzette das proximale Sehnenende des Musculus soleus fest einklemmen und vorsichtig ziehen, um die Innervation durch den Nervus ischiadicus freizulegen. Sobald die Innervation sichtbar ist, das umgebende Gewebe entfernen, um etwa fünf Millimeter des Nervs freizulegen.

Verwenden Sie dann ein feines Paar Schere, um den Nerv vorsichtig zu durchtrennen. Vervollständigen Sie die Entfernung von Muskel und Nerv, indem Sie die Achillessehne durchtrennen, um den Musculus soleus vom Musculus gastrocnemius zu lösen. Nun ist die Muskel-Nerv-Präparation bereit, an der Versuchsanordnung befestigt zu werden.

Erstellen Sie eine Schlaufe am Ende des Nylonfadens und ziehen Sie diese fest um die Achillessehne. Klemmen Sie die proximale Sehne in der feststehenden Klammer ein und binden Sie den Nylonfaden an dem Hebelarm des Kraftmessdurchführers fest. Lassen Sie den Muskel in der Lösung equilibrieren.

Um die anfängliche optimale Länge zu bestimmen, stimulieren Sie den Muskel mit einer Serie einzelner Impulse, während Sie den Kriechlastwert vorsichtig verändern. Die optimale Länge wird erreicht, wenn die Zuckungskraft maximal ist. Plazieren Sie die Saugnadelelektroden in der Nähe des Muskels und ziehen Sie den Nerv hinein.

Dann, während der Pulsstromwert sanft verändert wird, den Muskel mit einer Serie einzelner Pulse reizen. Die vom Muskel erzeugte Zuckungskraft, wenn er über den Nerv stimuliert wird, sollte den bei direkter Stimulation der Membran gemessenen Werten entsprechen. Sobald der optimale Stromwert bestimmt ist, den Nerv aus der Elektrode herausdrücken und einige Strompulse abgeben.

Wenn die Menge des zuvor ausgewählten Stroms übermäßig ist, führen die durch die Saugnade abgegebenen Stromimpulse zur Muskelkontraktion, indem der Strom durch das Bad geleitet wird. Mithilfe einer selbst entwickelten Software haben wir ein automatisiertes Testprotokoll zur Untersuchung der Funktionalität der neuromuskulären Endplatte des Musculus soleus konzipiert. Das Protokoll dauert etwa 65 Minuten und besteht aus vier verschiedenen Teilen.

Im ersten Teil wird der Muskel mit vier einzelnen Impulsen stimuliert, zwei direkt und zwei über den Nerv. Anschließend werden aus den Zuckungsantworten die Zeit bis zum Maximum, die Halbrelaxationszeit, der maximale Wert der Kraftableitung und die Zuckungskraft gemessen.

Im zweiten Teil wird der Muskel mit einer Serie von Reizimpulsen zwischen 20 Hertz und 80 Hertz stimuliert, was der tetanischen Frequenz entspricht. Zur Berechnung der Kraft-Frequenz-Kurven erfolgen sowohl Nerven- als auch Direktstimulationen. In den dritten und vierten Teilen des Protokolls wird der Muskel zwei Ermüdungsparadigmen unterzogen, um die neuro-muskuläre Übertragungsstörung und die intra-tetanische Ermüdung zu messen.

Während dieser Ermüdungsparadigmen wird der Muskel kontinuierlich stimuliert, wobei eine Reizfolge an der Membran und anschließend 14 Reizfolgen über den Nerv appliziert werden. Die gesamte Sequenz wird 20-mal wiederholt. Das erste Paradigma wird mit einer Feuerrate von 35 Hertz durchgeführt.

Die zweite bei einer tetanischen Frequenz von 80 Hertz. Es wird angenommen, dass die neuro-muskuläre Übertragungsstörung eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Ermüdung spielt, da sie mit der äußeren Blockade der Aktionspotentialausbreitung, einer verminderten Transmitterfreisetzung sowie einer verringerten Erregbarkeit der Endplatte und der Ermüdungsfähigkeit der neuromuskulären Verbindung zusammenhängt. Ein weiterer Aspekt der Ermüdungsfähigkeit der neuromuskulären Verbindung wird deutlich durch die intratetanische Ermüdung, die eine Abschätzung der Fähigkeit des Muskels darstellt, während einer einzelnen tetanischen Kontraktion die Kraft aufrechtzuerhalten, und die Hochfrequenzermüdung widerspiegelt.

Am Ende des Protokolls werden die Netto-Muskelänge und das Muskelgewicht mit einem analogen Messschieber und einer Präzisionswaage gemessen, um die Muskelquerschnittsfläche zu berechnen. Studien am transgenen SOD1-Mausmodell der amyotrophen Lateralsklerose haben das Potenzial dieser Methodik hervorgehoben. Tatsächlich zeigen die transgenen Musculus soleus Muskeln eine verminderte kontraktile Antwort sowohl in der Kraftableitung als auch in der tetanischen Kraft bei direkter Stimulation sowie eine noch stärkere Reduktion bei Stimulation über den Nerv.

Was beispielsweise die tetanische Kraft betrifft, so haben diese Experimente gezeigt, dass die Muskelkontraktilität für 25 % der Schädigung verantwortlich ist, während weitere 45 % auf Defekte in der Neurotransmission zurückzuführen sind. Ein weiterer interessanter Aspekt ist das Fehlen jeglicher Unterschiede in Kontrollmuskeln, wenn diese direkt oder indirekt stimuliert werden. Dieser Befund beweist, dass die Methodik keine technischen Artefakte verursacht, da die neuromuskuläre Verbindung bei Kontrolltieren voll funktionsfähig sein sollte.

Was die intratetanische Ermüdung betrifft, so haben die Ergebnisse signifikant niedrigere Werte in den transgenen M. soleus im Vergleich zu den Kontrollmuskeln gezeigt. Interessanterweise wird der transgene M. soleus durch wiederholte Stimulation signifikant geschädigt, was bedeutet, dass die Funktionalität der neuromuskulären Endplatte maximal über eine Stimulationsdauer von acht Minuten hinweg beurteilt werden kann. Nach acht Minuten kehrt der transgene Muskel bei Stimulation nahezu zu einem Kraftwert von null zurück.

Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie verstanden haben, wie man die Funktionalität der neuromuskulären Endplatte und des Musculus soleus der Maus misst. Da diese Technik auf einer indirekten Messung der Funktionalität der neuromuskulären Endplatte basiert, erlaubt sie nicht festzustellen, ob beobachtete Defekte auf morphologischen oder biochemischen Veränderungen beruhen. Andererseits stellt dieser Ansatz eine wesentliche Methode dar, um zu beurteilen, ob diese Schädigungen die Funktionalität des neurotrophen Signals beeinträchtigen.

Schließlich kann der Protokollvorschlag leicht angepasst werden, um die Funktionalität der neuromuskulären Junction des Zwerchfells zu messen, einem weiteren Muskel, der häufig bei pathologischen Erkrankungen betroffen ist.