Beurteilung einer funktionellen neuromuskulären Verbindung durch gleichzeitige optische Stimulation und Videoaufzeichnung

Beginnen Sie mit einem Bioreaktor mit einer Muskelkammer, die in Kollagen eingebettetes Muskelgewebe enthält, das über den Säulen der Kammer gestützt wird.

Der Neurosphärenkanal enthält eine Neurosphäre in einer Kollagenmatrix. Die Motoneuronen der Neurosphäre exprimieren lichtempfindliche Kanäle.

Fügen Sie ein Differenzierungsmedium hinzu, das neuronale Wachstumsfaktoren enthält, die die Neuronen dazu anregen, ihre Projektionen zu erweitern.

Tauschen Sie das Medium regelmäßig aus, um eine kontinuierliche Ausdehnung der Neuronen in Richtung Muskelgewebe zu gewährleisten und neuromuskuläre Verbindungen zu bilden.

Beobachten Sie den Bioreaktor unter einem Mikroskop, das mit einer Kamera und einer blauen Lichtquelle ausgestattet ist.

Wenden Sie blaue Lichtimpulse an, um die lichtempfindlichen Kanäle in den Neuronen zu öffnen, so dass Ionen aus dem Medium fließen können und die Neuronen zur Erzeugung elektrischer Signale angeregt werden.

Diese Signale wandern über die neuronalen Projektionen zu den neuromuskulären Verbindungen und leiten das elektrische Signal an das Muskelgewebe weiter.

Nehmen Sie gleichzeitig ein Video auf. Eine allmähliche Kontraktion der Muskelfaser bestätigt die Entwicklung einer funktionellen neuromuskulären Verbindung.

Bereiten Sie eine 4-zu-1-Mischung aus 3 Milligramm pro Milliliter Kollagen I und solubilisierter Basalmembranmatrix vor. Dann resuspendieren Sie die Myoblasten in dieser frisch zubereiteten Kollagenmischung.

Geben Sie anschließend 15 Mikroliter dieser Zell-Kollagen-Suspension in jede Muskelkammer des Bioreaktors und achten Sie darauf, die Suspension mit der Pipettenspitze auf beide Säulen zu verteilen. Lassen Sie die Zellgelmischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius polymerisieren. Füllen Sie dann jede Bioreaktorvertiefung mit 450 Mikrolitern myotonischem Wachstumsmedium.

Übertragen Sie am 11. Tag der Differenzierung der Motoneuronen die Zellen und Medien in ein 50-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie die Neurosphären 5 Minuten lang am Boden absetzen. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 15 Millilitern Motoneuronen-Suspensionskulturmedium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter neurotropher Faktor aus dem Gehirn und 10 Nanogramm pro Milliliter aus Gliazellen abgeleitetem neurotrophen Faktor.

Am 14. Tag der Differenzierungsprotokolle säen Sie die Motoneuronen in die Plattform. Bereiten Sie eine 4-zu-1-Gelmischung aus 2 Milligramm pro Milliliter Kollagen I und solubilisierter Basalmembranmatrix vor. Verwenden Sie ein 400-Nanometer-Zellsieb, um große Neurosphären auszuwählen und sie in der vorbereiteten Gelmischung zu resuspendieren.

Aspirieren Sie vorsichtig Medien aus dem Reservoir und der Neurosphäre gut. Geben Sie dann 15 Mikroliter der Gelmischung in den Neurosphärenkanal. Laden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette mit 10 Mikrolitern Gel und wählen Sie eine Neurosphäre aus. Legen Sie die Neurosphäre in den Neurosphärenkanal und stellen Sie sicher, dass sie sich in der Kammer befindet. Heben Sie dann die Pipette langsam an, während Sie das restliche Gel freisetzen, sobald die Neurosphäre abgelagert ist.

Lassen Sie das Gel 30 Minuten bei 37 Grad Celsius polymerisieren. Fügen Sie dann 450 Mikroliter NbActiv4 hinzu, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter neurotropher Faktor aus dem Gehirn und 10 Nanogramm pro Milliliter aus Gliazellen abgeleiteter neurotropher Faktor zu den Reservoirs.

Verwenden Sie für die Bildgebung ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einer wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleiterkamera-Software. Stellen Sie das Binning auf 2 x 2, die Belichtung auf 20 Millisekunden, den Rolling-Shutter ein, die Ausleserate auf 540 Megahertz, den Dynamikbereich auf 12 Bit und Gain 1 und den Sensormodus auf Überlappung ein. Verwenden Sie ein 2-fach-Objektiv am Mikroskop, um das Mikrogewebe abzubilden, und befestigen Sie eine Lebendzellkammer am Mikroskoptisch.

Wählen Sie die Region of Interest aus, die das innervierte Skelettgewebe enthält, um die Dateigröße und die Verarbeitungszeit zu minimieren. Platzieren Sie dann einen 594-Nanometer-Langpass-Emissionsfilter zwischen der Probe und dem Bildgebungsobjektiv, um die blauen Lichtimpulse der Kamera herauszufiltern. Platzieren Sie anschließend eine rechteckige Vier-Well-Platte mit vier Bioreaktoren in der Zellkammer der lebenden Zellen. Klicken Sie dann auf Live View, zentrieren und fokussieren Sie das Bild mit dem gewünschten ROI.

Laden Sie den benutzerdefinierten Makrocode aus dem GitHub-Ordner herunter, um die Bühnenposition, das Arduino-Board und die Videoaufnahme zu steuern. Legen Sie dann den Ausgabefilm auf day_tissuegroup_tissuename_experiment fest. ND2. Führen Sie den Makrocode mit den gewünschten x- und y-Koordinaten auf der Bühne aus, und erfassen Sie einen schnellen Zeitrafferablauf mit 1.700 Bildern bei 50 Bildern pro Sekunde.

Tauschen Sie nach der Bildgebung das Medium aus und geben Sie die Proben in den Inkubator zurück. Lassen Sie mindestens 24 Stunden zwischen den Bildaufnahmesitzungen liegen, um eine Ermüdung des Gewebes zu vermeiden.