Name: Herstellung von Riesenvesikeln Encapsulating Microspheres durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Riesenvesikeln mit Mikrosphären durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion. Diese Methode ermöglicht die effiziente Kapselung für synthetische Biologie und künstliche Zellen.

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Wir danken Tomoko Yamaguchi in Abbildung 1 die schematische Bild zeichnen. Diese Studie wurde von der Okazaki ORION-Projekt des Okazaki-Instituts für Integrative Bioscience der Nationalen Behörde Institutes of Natural Sciences (NINS) unterstützt; von der Astrobiologie-Center Project (kein AB281010.) von NINS; durch einen Zuschuss-in-Aid for Scientific Research für innovative Bereiche (Dynamical Bestellung von biomolekularen Systemen für die Erstellung von integrierten Funktionen) von der japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (JSPS) (kein 25.102.008.); durch einen Zuschuss-in-Aid für junge Wissenschaftler (B) (KK, kein 15K17850.) von JSPS; unddurch ein Zuschuss-in-Beihilfen für Forschung Aktivität Start-Up (bis YN, Nr. 15H06653) von JSPS. Zusätzliche Unterstützung wurde durch einen Zuschuss aus dem Noguchi Institute, einen Zuschuss von der Kao-Stiftung für Wissenschaft und Kunst, und einen Zuschuss aus dem Kurita Water and Environment Foundation zur Verfügung gestellt.

1. Herstellung von GVs durch die W / O-Emulsion Zentrifugationstest <ol><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 1,2-Dioleoyl sn - glycero-3-phosphocholin (DOPC, 25 mM) und eine Stammlösung von Texas Red 1,2-dihexadecanoyl- sn - glycero-3-Phosphoethanolamin, Triethylammoniumsalz (Texas Red DHPE, 0,20 mM) in Chloroform und speichern Sie die Stammlösungen bei -20 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine Öllösung. <ol><li> Bilden einen Lipidfilm auf der Innenfläche einer 5 ml-Glasfläschchen, indem eine Mischung der DOPC-Stammlösung (51,0 &amp; mgr; l verdampft und der Texas Red DHPE Stammlösung (19,2 &amp; mgr; l) unter strömendem Stickstoffgas. </li><li> Inkubieren der Film unter vermindertem Druck über Nacht und dann 1,0 ml Paraffinöl hinzu (0,86 bis 0,89 g / cm 3) in das Fläschchen. Wickeln Sie das Fläschchen in Aluminiumfolie und Inkubation bei 80 ° CO / N in Ruhe. Die Endkonzentrationen von DOPC und Texas Red DHPE sind 1,3 und 3,8 x 10-3 mMSind, und die DOPC: Texas Red DHPE Molverhältnis 100: 0,3. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die innere wässrige Dispersion. <ol><li> In einem 1,5 ml Mikroröhrchen mit Deckel, Mischungs 237,5 ul einer Dispersion von 1,0 &amp; mgr; m nicht fluoreszierenden Mikrosphären (2,5 Vol%) und 12,5 &amp; mgr; l einer Dispersion von 1,0 um fluoreszierende Mikrosphären (2,5 Vol%); Dies entspricht einer 95: 5 (v / v) Verhältnis von nichtfluoreszierenden zu fluoreszierenden Mikrokugeln. </li><li> Hinzufügen 64 mg Sucrose, gefolgt von 125 &amp; mgr; l Tris-gepufferter Lösung (TBS, 1 M) und 875 &amp; mgr; l deionisiertem Wasser hergestellt. Die endgültige Volumenanteil an Mikrokugeln beträgt 0,5 Vol% und die Endkonzentrationen von Tris-HCl (pH 7,5) und Saccharose betragen 0,1 und 0,15 M, respectively. </li><li> Vortex die microtube für 30 Sekunden und dann beschallen es für 10 min. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die äußere wässrige Lösung. <ol><li> Nach der Herstellung von 10 ml einer Tris-gepufferten Lösung (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M glucOSE) in dem gleichen Verfahren wie inneren wässrigen Medien stellen 1 ml der Lösung in einem 1,5 ml Mikroröhrchen mit Deckel. Vortex die microtube für 30 Sekunden und dann beschallen es für 10 min. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine W / O - Emulsion , die Mikrokügelchen. <ol><li> Mix 1 ml der Öllösung (flüssiges Paraffin enthält, DOPC und Texas Red DHPE) mit 300 &amp; mgr; l der inneren wässrigen Lösung in einem 1,5 ml Microtube. </li><li> Emulgieren der beiden Komponenten in dem Mikroröhrchen durch einen mechanischen Homogenisator (ein Rührwerk mit Schaufeln, die mit hoher Geschwindigkeit rotieren) betrieben 2 min bei RT bei 10.000 Umdrehungen pro Minute. </li></ol></li><li> Man fällt die GVs. <ol><li> Schicht vorsichtig 300 ul der w / o-Emulsion auf der oberen Oberfläche von 1 ml der äußeren wässrigen Lösung bei 4 ° C in einem 1,5 ml Mikroröhrchen mit Deckel. Kühlen Sie das Microtube für 10 min bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Sammeln Sie die GVs. <ol><li> Unmittelbar nach der microtube Kühlen,zentrifugieren es bei 18000 x g für 30 min. Besorgen Sie sich die gefällte GVs durch den Boden des Mikroröhrchens mit einem Reißzwecke Piercing und ein Tröpfchen in einem sterilisierten 1,5 ml Mikroröhrchen sammeln. </li><li> Verdünnen Sie das ausgefallene GV Tröpfchen 10-100 fache Volumen mit der äußeren wässrigen Lösung, wenn die erhaltenen GVs in Mengen erhalten werden, groß genug, um Beobachtung erschweren. </li></ol></li></ol> 2. Mikroskopie Beobachtung von GVs <ol><li> Bereiten Mikroskopie Probe. <ol><li> Legen Sie eine Klebstoff Inkubationskammer für in - situ - Polymerase - Kettenreaktion und Hybridisierung (Kammergröße 9 mm x 9 mm x 0,3 mm dick) auf einem Mikroskop - Deckglas. </li><li> Mit Hilfe einer Mikropipette, Anzahlung 25 ul der verdünnten gefällte GVs auf der Probe und sofort legen Sie eine weitere Deckglas (ca. 0,15 mm dick) auf der Oberseite der Inkubationskammer. </li></ol></li><li> Nehmen Differentialinterferenz contrast-Mikroskopie-Aufnahmen der GVS. <ol><li> Nehmen Sie Mikroskopiebilder der Vesikel mit einem Mikroskop (10X, 20X, 40X und Ziele), ausgestattet mit einem 12V100WHAL-L-Halogenlampe. </li></ol></li><li> Führen Sie die Fluoreszenzmikroskopie Beobachtungen. <ol><li> Legen U-FBNA und U-FMCHE Fluoreszenzspiegeleinheiten in das Mikroskop. Montieren Sie die Geräte mit 470-495 nm und 565-585 nm Anregungsfilter sind und mit Emissionsfiltern, die von 510 bis 550 nm und 600 bis 690 nm Licht übertragen sind. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

<html> Die spezifischen Gewichte der inneren wässrigen Dispersionsmediums und der äußeren wässrigen Lösung muss sorgfältig ausgewählt werden. Für die W / O-Emulsion in die äußere wäßrige Lösung während der Zentrifugation auszufällen, muß das spezifische Gewicht der inneren wässrigen Dispersionsmediums größer als die der äußeren wässrigen Lösung. Wir haben versucht, unter Verwendung GVs inneren und äußeren Lösungen ohne Zucker herzustellen, aber wir erhalten keine GVs unter diesen Bedingungen, da die innere wässrige Lösung nicht genug Masse haben, hat die Interferenz zwischen den beiden Phasen zu überqueren. Wenn es eine große osmotische Druckdifferenz zwischen den beiden Lösungen, GVs, die in die äußere wässrige Lösung ausfallen kann oder Ruptur schrumpfen. Daher muß der osmotische Druck innerhalb und außerhalb der GVs gleich sein. Um dies zu erreichen, verwendet man Saccharose als ein gelöster Stoff in der inneren wässrigen Dispersion und Glucose als ein gelöster Stoff in der äußeren wßrigen Lösung; beide Zucker wurden bei der gleichen Konzentration. Beide Salz23 ss = &quot;Xref&quot;&gt; 22 und Zucker, 35, 38 wurden für solche Zwecke verwendet wird , sondern Zucker wird normalerweise verwendet , da es weniger toxisch ist und löslicher als Salz. wenn zu viel Zucker ist jedoch hinzugefügt, können die GVs in Kontakt mit der Unterseite des Deckglases und Zusammenbruch. Es gibt verschiedene Strategien dies zu vermeiden. Eine Strategie ist es, die spezifische Dichte Differenz zwischen den inneren und äußeren wässrigen Lösungen zu reduzieren, so dass die GVs unter milden Bedingungen auszufällen; Insbesondere kann der Überstand der ausgefällten GV Dispersion mit einer Lösung ausgetauscht werden, die auf der inneren wässrigen Lösung identisch ist, die Möglichkeit des vesikulären Ruptur durch Haftung auf dem Deckglas infolge des Auftriebs zu reduzieren. Eine andere Strategie ist mit einer dünnen Lipidfilm 29 beide Deckgläser vorbeschichtet. Die richtige Vorbereitung und Inkubation der Emulsionwichtig. Wir verwendeten Paraffinöl, das Öl-Lösung herzustellen. Mineralöl 26, 31, Dodecan 21, 33 und Squalan 33, 39 werden verwendet , oft auch als Lösungsmittel Öle. Da diese Materialien in spezifischen Gewicht variieren, Viskosität und Oberflächenspannung, eine unterschiedliche Anzahl von Vesikeln bilden , selbst wenn die gleiche Zentrifugationsbedingungen 33 verwendet werden. Um die Vesikel mit den Zieleigenschaften zu erhalten, ist es wichtig, die spezifische Dichten und Viskositäten der inneren und äußeren wässrigen Lösungen sowie die zentrifugale acceleration.For Herstellung der Ölphase zu optimieren, muss der Inkubation bei hoher Temperatur auftreten und in einem trockenen Umgebung wie einem Inkubator oder einem Dehydrator. In dieser Studie erhitzt man das flüssige Paraffin auf 80 ° C vollständig das Lipid zusätzlich molecules.In aufzulösen, sollte die Emulsionnur hergestellt werden, wie erforderlich und sollte sofort zentrifugiert werden, da es instabil ist nur, nachdem es hergestellt wird, und die w / o leicht Tröpfchen miteinander verschmelzen. Die Emulsion kann in großen Mengen durch Beschallung, Verwirbelung oder Anzapfung hergestellt werden. Jedoch erlaubt mit einer hohen Viskosität zur schnellen Herstellung von großen Mengen an Emulsion und einfacher Emulgierung in Öl unter Verwendung eines Homogenisators. Es ist auch wichtig, daß die Emulsion auf der äußeren wässrigen Lösung sanft und schnell und dann bei 4 ° C gekühlt geschichtet werden. Um die Zeit zwischen Emulgierung und Zentrifugieren der öl äußeren wäßrigen Lösungssystem verkürzen kann vorgekühlt werden, bevor die Emulsion auf ihm überlagert wird, und das ganze System kann dann zentrifugiert werden immediately.If die weiße Trübung erscheint schneller oder langsamer als üblich, das mechanische Homogenisator gründlich Reinigungsmittel zu entfernen gespült werden. Darüber hinaus vor der Emulgierung die Öllösung, innere wässrige Lösung und Emulgator muß r seineturned auf Raumtemperatur. Proper Zentrifugalbeschleunigung ist ebenfalls wichtig. Durch Zentrifugieren bei 18.000 x g, konnten wir GVs mit einem einzigen Innenmaterial in einer hohen Konzentration eingekapselt vorzubereiten. Wenn die Einkapselung mehrerer Materialien erforderlich ist, ist es besser, die Zentrifugalbeschleunigung zu reduzieren. Zum Beispiel wurde mit Zentrifugation ein Aktin - Zusammensetzungs - System sieben Verbindungen einkapseln bei weniger als 350 x g 35 erzielt. In Fällen , in denen Zentrifugation unerwünscht ist, kann GVs durch Einstellen der Zuckerkonzentration oder durch Ausfällen der Emulsion unter dem Einfluß seiner eigenen Masse 38, 40, 41 erhalten werden. Das Verfahren berichtet hier hat zwei wesentliche Einschränkungen. Einer ist, dass Ölmoleküle (Paraffin, in diesem Fall) in der GV-Membran löslich gemacht werden, wie dies durch die Weit hingewiesenz Gruppe 21. Beim Einführen eines Membranproteins in die GV-Membran gewünscht wird, müssen die Auswirkungen der koexistierenden Ölmoleküle auf dem Protein betrachtet werden. Die andere Einschränkung ist die Variation der Volumenanteil. In dieser Studie schätzt man, dass die Volumenanteile der Mikrokugeln in den GVs 4-30 Vol-% lag; die Volumenanteile wurden zu dem Volumenanteil der inneren wässrigen Lösung zur Zubereitung verwendet GV nicht identisch. Obwohl wir in der Lage waren Mikrokugeln in den GVs bei einer ausreichend hohen Volumenanteil für die Mikroskopie Beobachtung zu kapseln, ist dieses Verfahren zur Herstellung von GVs mit einer gleichmäßigen Volumenanteil Verteilung nicht geeignet. Es wurde berichtet, dass die Verteilung der Mikrokügelchen Volumenanteile verändert während der Zentrifugation 34. Die w / o-Emulsion Zentrifugationsverfahren wird für die Bildung von GVs enthält eingekapselten Materialien verwendet. Allerdings haben nur wenige Berichte, die p beschriebenReparatur von GVs Einkapseln mikroskaligen Materialien 34, 42. Vor kurzem molekulare Roboter eine verkapselte DNA - Gerät oder ein Molekular Gerät wurden 43 enthält , konstruiert, 44. GVs mit Fächern sind die erste Wahl für diese Art von Anwendungen; deshalb Techniken, wie unsere, die zum Einkapseln von magnetischen Mikrokügelchen und Mikrokugeln mit unterschiedlichen Oberflächenfunktionalisierung verwendet werden könnte , kann nützlich sein , 44 zu erwarten.

<html> Die konstruktive, oder synthetisch, ist biologischer Ansatz eine faszinierende Weg für die Grenze zwischen Leben erforschen und Materie nonliving. Da die Zelle ist die kleinste Einheit für das Leben benötigt, wie wir es derzeit verstehen, haben verschiedene Forscher versucht, künstliche Zellen von einfachen konstruieren, gut verstanden Chemikalien so dass Phänomene, die innerhalb eines solchen künstlichen Zellen auftreten können, untersucht werden, mit dem Ziel der Aufklärung die Entstehung des Lebens und die grundlegenden Funktionen von lebenden Zellen zu studieren 1, 2, 3. Insbesondere Vesikel 4, das sind sphärische Mikrokammern von amphiphilen Molekülen und 5 biologische Moleküle wie Proteine einkapseln kann, 6 und DNA 7, 8, 9,lass = &quot;xref&quot;&gt; 10, oft als Modelle von biologischen Membranen verwendet worden. Vesikeln kann so klein eingestuft werden (definiert als mit einem Durchmesser von &lt;100 nm), groß (Durchmesser &lt;1 &amp; mgr; m) oder Riesen (Durchmesser&gt; 1 &amp; mgr; m). Riesenvesikeln (GVS) wurden intensiv untersucht, da sie ähnlich zu den Zellen in Größe, Form und Struktur zu leben. Aufgrund der Größe der GVS, morphologischen Veränderungen in GV Membranen können leicht in Echtzeit unter einem optischen Mikroskop beobachtet werden. Mehrere Verfahren zur Herstellung GVs wurden 11 berichtet worden, einschließlich der Hydratation Verfahren 12, 13, die Gefrier-Auftau - Verfahrens 14 wird die Elektroformation Verfahren 15, 16 und der Fluidikvorrichtung Verfahren 17, 18. Jedoch Proteine ​​und andere MACROM Einkapselnolecules in GVs bei hohen Konzentrationen mit Hilfe dieser Verfahren schwierig ist. Insbesondere ist es extrem schwierig biologischen Materialien in ausreichender Menge (20-30 Vol-%) zu kapseln die gedrängten Umgebung innerhalb der Zellen 20 19, zu imitieren. Zur Bildung von GVs sofort, Weitz und Mitarbeiter eine Wasser-in-Öl etabliert (w / o) Emulsion Zentrifugationsmethode 21, 22. Diese Methode hat fünf wichtige Merkmale. Erstens, weil GVs nach diesem Verfahren hergestellte Nieder Lamellarität haben 23, 24, deren Membranen sind so dünn , daß sie leicht deformiert werden kann. GV Membranverformung durch FtsZ (a bakteriellen Zellteilung Protein), Tubulin induziert und anderen Makromolekülen wurde untersucht 25, 26, 27, 28, und wir beobachteten polyhe<html> Eders artige Verformung von GV - Membranen durch Verkapselung von Mikrokugeln 29 induziert, 30. Zweitens können Membranproteine in die Vesikelmembran durch dieses Verfahren eingeführt werden, wenn auch mit Schwierigkeiten 31. Zum Beispiel verwendet die Yomo Gruppe dieser Methode die in vitro - Synthese und porenbildenden Aktivität des Membran - Protein α-Hämolysin - 32 zu studieren. Drittens ist es möglich , asymmetrische GVs zu erzeugen , in der die Lipidkomponenten der inneren und äußeren Blättchen verschiedenen 22 sind. Zum Beispiel Whittenton et al. erzeugten asymmetrischen GVs mit kationischen Lipiden in dem inneren Blatt negativ geladene Polynukleotide zu kapseln und mit neutralen Lipiden auf der äußeren Packungsbeilage 33 Toxizität und unspezifische zelluläre Aufnahme zu verringern. Viertens kann die Konzentration und der Volumenanteil der Substanzen innerhalb der GVs relativ hohens = &quot;xref&quot;&gt; 28, 34. Fünftens können mehrere Arten von Materialien eingekapselt 35 werden. Zum Beispiel Nishimura et al. ein in vitro Transkriptions-Translations - System in GVs gekapselt und verwendet , um das System grün fluoreszierendes Protein (GFP) innerhalb des GVs 36 auszudrücken. Diese fünf Eigenschaften machen w / o Emulsion Zentrifugation ein unverzichtbares Verfahren zur Erzeugung von zell nachahmt GVs. In früheren Arbeiten, durch Zentrifugieren erzeugt GVs wurden mittels einer Spritze gesammelt , ausgestattet mit einer langen 16 G Nadel aus rostfreiem Stahl einige der fertigen wässrigen Lösung , die 22. In den Händen von unerfahrenen Techniker, könnte diese Sammlung Verfahren leicht zu einer Kontamination des GV mit etwas Öl. In dieser Studie verwendeten wir die w / o Emulsion Zentrifugationsprotokoll von der Gruppe Yomo entwickelt 23, 37,in dem ausgefällten GVs werden gesammelt durch ein Loch am Boden des Zentrifugenröhrchens geöffnet, in dem sie hergestellt werden. Wir bereiteten GVs Einkapseln 1,0 um Mikrokugeln, die in der Größe zu intrazellulären Organellen sind ähnlich. Die Verwendung von Mikrokügelchen erlaubt uns ihre Konzentration zu schätzen, indem ihr Volumenanteil berechnet wird. Etablierung eines Verfahrens zur Herstellung von GVs, in denen Materialien dicht gepackt sind, ist ein wichtiger Schritt für die künstliche Zellen zu schaffen. Um die Nützlichkeit unseres Protokoll für verschiedene Arten von Innenmaterialien bestätigen wir auch gezeigt, dass GFP und ein kleines wasserlösliches fluoreszierendes Molekül (Uranin) könnte in den GVs verkapselt werden.

<table><tbody><tr><td>REAGENZIEN:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850375C</td><td>Vesikuläres Membranmolekül</td></tr><tr><td>Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, Triethylammoniumsalz (Texas Red DHPE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T1395MP</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7,5)</td><td>Nippon Gen Co.</td><td>318-90225</td><td>Pufferlösung</td></tr><tr><td>D(+)-Glukose</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>049-31165</td><td>Für äußere Wasserlösung</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>196-00015</td><td>Für innere Wasserlösung</td></tr><tr><td>Polybead-Carboxylat-Mikrosphären 1,0 &; Mikro; m</td><td>Polysciences</td><td>08226-15</td><td>Nichtfluoreszierend, 2R = 1,0 &Mikro; m</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Carboxylat Mikrosphären 1.0 & Mikro; m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td>Leuchtstofflampe, 2R = 1,0 &Mikro; m</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Carboxylat Mikrosphären 0,10 &μ; m</td><td>Polysciences</td><td>16662-10</td><td>Fluoreszierend, 2R = 0,10 &Mikro; m</td></tr><tr><td>Fluorescein-Natriumsalz (Uranin)</td><td>Sigma Aldrich Japan</td><td>F6377-100G</td><td></td></tr><tr><td>GFP-Standard (rekombinant)</td><td>Vector Laboratories</td><td>MB-0752</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>EQUIPMENT: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5427R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5409000233</td><td>Zentrifugenrotor: FA-45-48-11</td></tr><tr><td>Physcotron</td><td>Microtec Co.</td><td>NS-310EIII</td><td>Handlicher Mikrohomogenisator</td></tr><tr><td>Generatorwelle</td><td>Microtec Co.</td><td>NS-4</td><td>Homogenisator-Aufsatz</td></tr><tr><td>Frame-Seal Inkubationskammern für in situ PCR und Hybridisierung</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>SLF0201</td><td>Volumen der Hybridisierungskammer: 25 & Mikro; L Kammergröße: 9 & mal; 9 & mal; 0,3 mm</td></tr><tr><td>Frame-Seal-Inkubationskammern für in situ PCR und Hybridisierung</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>SLF0601</td><td>Volumen der Hybridisierungskammer: 65 & Mikro; L&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Kammergröße: 15 & fach; 15 & mal; 0,3 mm</td></tr><tr><td>Microman E</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td><td>Pipette für viskose Flüssigkeit. Wir haben flüssiges Paraffin mit diesem gemessen.</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Olympus Co.</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Spiegeleinheit</td><td>Olympus Co.</td><td>U-FBNA</td><td>Anregungsfilter: 470 - 495 nm Emissionsfilter: 510 - 550 nm</td></tr><tr><td>Spiegeleinheit</td><td>Olympus Co.</td><td>U-FMCHE</td><td>Anregungsfilter: 565 - 585 nm Emissionsfilter: 600 - 690 nm</td></tr></tbody></table>

herstellung von riesenvesikeln encapsulating microspheres durch zentrifugation einer wasser-in-Öl-emulsion

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Die konstruktive Biologie und der synthetischen Biologie Ansatz künstliches Leben zu schaffen beinhalten die Bottom-up-Montage von biologischen oder nicht-biologische Materialien. Solche Ansätze haben erhebliche Aufmerksamkeit in der Forschung an der Grenze zwischen lebenden und nicht lebenden Materie erhalten und verwendet wurden, künstliche Zellen in den letzten zwei Jahrzehnten zu konstruieren. Insbesondere Riesenvesikeln (GVS) wurden oft als künstliche Zellmembranen verwendet worden. In diesem Papier beschreiben wir die Herstellung von GVS hoch gepackt Mikrokügelchen als ein Modell der Zellen Einkapseln hochkondensierter Biomoleküle enthalten. Die GVs wurden mittels eines einfachen Wasser-in-Öl-Emulsion Zentrifugationsverfahren hergestellt. Insbesondere wurde ein Homogenisator verwendet, um eine wässrige Lösung zu emulgieren, die Materialien enthält, eingekapselt werden, und ein Öl gelöst Phospholipide enthält, und die resultierende Emulsion wurde vorsichtig auf die Oberfläche einer anderen wässrigen Lösung geschichtet. Das Schichtsystem wurde dann t zentrifugierto erzeugen die GVs. Diese leistungsstarke Methode wurde verwendet, Materialien zum Einkapseln von kleinen Molekülen zu Mikrokügelchen reichen.

Die w / o - Emulsion Zentrifugationsverfahren wird photographisch und schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Das schematische Bild in Abbildung 1 zeigt , dass der wichtigste Faktor für den Erfolg dieses Verfahrens ist , daß das spezifische Gewicht der inneren wässrigen Lösung größer sein muß als die der äußeren wässrigen Lösung, so dass die während der Zentrifugation GVs ausfällt. Darüber hinaus erfordert die Bildung einer Lipid-Monoschicht an der W / O-Schnittstelle, dass das System für 10 Minuten abgekühlt werden, nachdem die Emulsion auf der äußeren wässrigen Lösung geschichtet ist. Weil die GVs Form durch Übertragung von Emulsionströpfchen über die w / o-Schnittstelle, die den osmotischen Druck in den inneren und äußeren wässerigen Schichten gleich sein müssen. Als Kontrollexperiment wir auch GVs hergestellt keine Mikrokugeln mittels des Verfahrens , das 1 und 1,3 in gezeigten Schritt, mit der Ausnahme , dass die innere wässrige Lösunghergestellt ohne Mikrokügelchen. Sammeln der ausgefällten GVs nach Zentrifugation wird in Abbildung 2 dargestellt. Zusätzlich zu der halbdurchlässigen Phasen ganz am Boden des Mikroröhrchens, beobachteten wir auch eine weiße, trübe Zwischenphase in der äußeren wässrigen Lösung (Abbildung 2a). Diese Zwischenphase war reich an Aggregationen von Mikrokugeln und Öl, während die untere Phase die GVs enthalten. Deshalb wird nach mit einer Reißzwecke (2b) , um den Boden des Mikroröhrchens piercing sammelten wir nur den ersten Tropfen (Abbildung 2c), die große Mengen an GVs enthalten. Es ist darauf zu achten, dass nicht mehr als zwei Tropfen gesammelt werden; zusätzliche Tropfen können Aggregationen von Mikrokügelchen und Lipide enthalten, die in einer geringeren Dichte von GVs führen wird. Die erhaltene Vesikeldispersion oft außerhalb der GVs eingekapselten Materialien enthalten, weil die GVs often Bruch während der Zentrifugation. Nur GVs, ein Sortierverfahren wie Dialyse, Gelfiltration oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung erhalten sollte gewählt werden, aufgrund der Größe der Einkapselungsmaterialien. Sofern es für den Zweck, für den die ausgefällten GVs verwendet werden sollen, können sie mit der äußeren wässrigen Lösung verdünnt werden. In einigen Fällen erstreckte sich die Zwischenphase auf den Boden des Röhrchens, was darauf hindeutet, dass alle Vesikel, die durch das Öl zusammengehalten gebildet wurden. Wir erhalten Differentialinterferenzmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie Bilder der GVs ohne Mikrokugeln (3a, 3b) und mit Mikrokugeln (Abbildung 3c -3 f). In Übereinstimmung mit früheren Berichten 23, 37, GVs mit niedrigen Lamellarität wurden von unserem Protokoll gebildet. Lipids, konjugiert mit Texas Red DHPE, die rot fluores emittiertzenz, verwendet, so daß die Vesikelbildung unmittelbar durch Visualisierung der dünnen Membran bestätigt werden. Von den 160 GVs, die wir erhalten, 55 gekapselten Mikrokügelchen und 105 waren leer, ein Verhältnis von Einkapselung von 34% ergibt. Wir bestimmten den Volumenanteil (φ, vol%) der Mikrokugeln in den GVs mittels des folgenden Verfahrens. Da jedes GV Dutzende bis zu einigen hundert Mikrokugeln enthält, werden alle Mikrokugeln unter einem optischen Mikroskop zu zählen ist eine Herausforderung. Daher vermischt wir die nichtfluoreszierenden 1,0 um Mikrokügelchen mit einer geringen Menge an fluoreszierender Mikrosphären, die manuell unter dem Fluoreszenzmikroskop gezählt wurden. Die Gesamtzahl (N) von verkapselten Mikrokügelchen durch Multiplikation der Anzahl (n) von Hand gezählt fluoreszierenden Mikrokügelchen durch 20 (bezogen auf die ursprünglichen 95: 5 [v / v] Verhältnis von nichtfluoreszierenden fluoreszierende Mikrosphären) wurde berechnet. Der Wert von66; wurde dann als Nv 100 / V geschätzt wird , wobei V das Volumen der Mikrokugeln ist und V das Volumen des einzelnen GV ist. Beachten Sie, dass Schätzung von N von n Anlass zu Zählfehler gibt, und diese Fehler müssen berücksichtigt werden , wenn φ berechnet wird . Der Wert von φ wurde aus N geschätzt, die direkt als 20 N, und dies wiederum berechnet die Wahrscheinlichkeit geführt , die &amp; phiv; genau repräsentiert den wahren Wert &lt;50% beträgt. Tatsächlich schwankt N zu einem gewissen Grad um die 20 n, so müssen wir es als 20 zu betrachten (± i n), wobei i der Fehler in n ist. Wir schätzten , i , damit eine Wahrscheinlichkeit von n ± i auf der Basis einer Poisson - Verteilung erhalten mehr als 50% sein könnte. Wir schätzten , i, was wiederum erlaubt uns 20 zu berechnen (n ± i) und Werte der66; dass Fehler enthalten für GVs mit Durchmessern von 10 und 15 um (Tabelle 1) zu zählen. Nach diesem Verfahren wurde der Volumenanteil der Mikrokugeln in der GV in 3c gezeigt geschätzte 11 ± 3 Vol% liegt . Die Genauigkeit der berechneten Volumenanteil betrug 10-30%. Unsere Ergebnisse zeigen, dass wir erfolgreich 1 &amp; mgr; m Mikrosphären in einem hohen Volumenanteil in GVs eingekapselt. Wir waren auch andere Materialien in 100 Mol-% DOPC GVs unter Verwendung der gleichen äußeren wässrigen Lösung und das gleiche Protokoll (Abbildung 4) zu verkapseln können. Insbesondere GVs enthaltend 0,1 &amp; mgr; m Mikrosphären wurden aus einer Tris-gepufferten Lösung, die 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 0,15 M Saccharose und 0,5 Vol% fluoreszierenden Mikrokügelchen mit Hilfe des Protokolls für GVs beschriebenen 1,0-um-Mikrokugeln ( Figur 4a). Nach dem beschriebenen Protokoll above, DOPC GVs enthaltend GFP (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M Saccharose und 100 ug / ml GFP; 4b) und GVs enthält Uranin (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M Saccharose, und 30 uM Uranin, Figur 4c) wurden ebenfalls hergestellt. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> n </td><td> N </td><td> φ (10 &amp; mgr; m Durchmesser) </td><td> φ (15 &amp; mgr; m Durchmesser) </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 60 ± 20 </td><td> 6,0 ± 2,0 </td><td> 1,8 ± 0,6 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 80 ± 20 </td><td> 8,0 ± 2,0 </td><td> 2,4 ± 0,6 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 100 ± 20 </td><td> 10 ± 2 </td><td> 3,0 ± 0,6 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 120 ± 30 </td><td> 12 ± 4 </td><td> 3,6 ± 1,2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 ± 32 </td><td> 20 ± 3 </td><td> 5.9 ± 0,9 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 400 ± 45 </td><td> 40 ± 5 </td><td> 12 ± 2 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 600 ± 55 </td><td> - </td><td> 18 ± 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> ein Fehler wurden im Text beschrieben , bestimmt; n = Anzahl der manuell gezählten Mikrokugeln; N = Gesamtzahl der verkapselten Mikrokügelchen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zahlen und Volumenanteile (φ, vol%) von Microspheres ein. ein Fehler wurden im Text beschrieben , bestimmt; n = Anzahl der manuell gezählten Mikrokugeln; N = Gesamtzahl der verkapselten Mikrokügelchen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig1.jpg" /> Abbildung 1: Fluss Ch<html> Kunst und schematische Darstellung von W / O-Emulsion Zentrifugationstest. (A) Öllösung , bestehend aus DOPC und Texas Red DHPE (100: 0,3 Molverhältnis) in flüssigem Paraffin. (B) innere wässrige Dispersion , bestehend aus Sucrose und Mikrokugeln in Tris-HCl - Puffer. (C) Außen wässrige Lösung , bestehend aus Glucose in Tris-HCl - Puffer. (D) Gemisch aus 1 ml der Öllösung und 300 &amp; mgr; l der inneren wässrigen Dispersion. (E) Emulgierung mit einem Homogenisator (10000 Upm, 2 min). (F) Die W / O - Emulsion. (G) Überlagerung von 300 &amp; mgr; l der Emulsion auf 1 ml der äußeren wässrigen Lösung. (H) Gefällte GVs nur nach dem Zentrifugieren. (I) Schematische Darstellung des Prinzips der w / o - Emulsion Zentrifugationsverfahren. Der schwarze Pfeil zeigt die Richtung der Zentrifugalbeschleunigung..jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" /> Abbildung 2: Piercing des Reaktionscup. (A) Die ausgefällten GVs unmittelbar nach der Zentrifugation (auch in Figur 1h dargestellt). Die rote Ellipse zeigt die Tröpfchen der Fällungs GV Dispersion. (B) Piercing des Mikroröhrchens mit einem Reißzwecke. Das Pellet der GVs enthält, wurde durch Durchstechen der Mikroröhre in der Nähe der Unterseite mit einem Druckstift und Sammeln Tröpfchen aus dem Loch erhalten. (C) Tröpfchen der ausgefällten GVs (angedeutet durch den gelben Pfeil) -Dispersion mit der äußeren wässrigen Lösung verdünnt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 3: Mikroskopische Bilder von GVs. (A) Differential - Interferenz - Kontrastmikroskopie Bild einer GV ohne Mikrokügelchen. Der Durchmesser des GV betrug etwa 10 um. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. (B) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines GV ohne Mikrokügelchen. Die rote Fluoreszenz wurde von Texas Red DHPE emittiert. (C) Differential - Interferenz - Kontrastmikroskopie Bild einer GV Mikrosphären. (D) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von 1,0 um Mikrokugeln (YG Carboxylat Mikrokügelchen) innerhalb eines GV. Die Anzahl der gezählten Fluoreszenzmikrokugeln (n) betrug 6. Wir die Fehler geschätzt (i = 2) , basierend auf Poisson - Verteilung. Dann schätzten wir Gesamtzahl der inneren Mikrokugeln (N = 20 (n i &amp; plusmn ; )) betrug 120 ± 40. Es wurde berechnet, dass dieGV enthielt 1,0 &amp; mgr; m Mikrosphären in einem Volumenanteil (φ = Nv 100 / V) von etwa 11 ± 3 Vol%, wobei v das Volumen der Mikrokugeln ist und V das Volumen der GVs. (E) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme einer GV - Membran. Die rote Fluoreszenz wurde von Texas Red DHPE emittiert. (F) zusammengefügte Bild der Bilder in Platten d und e. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig4.jpg" /> Abbildung 4: Differentielle Interferenzkontrast und Fluoreszenzmikroskopie Bilder von GVs mit verschiedenen eingekapselten Materialien. Differentialinterferenzkontrastmikroskopie (oben) und Fluoreszenzmikroskopie (unten) Bilder vonGVs enthaltend (a) 0,1 &amp; mgr; m - Mikrokugeln, (b) GFP und (c) Uranin. Maßstabsbalken = 10 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Riesenvesikel mit hochgepackten mikrometergroßen Komponenten sind nützliche Zellmodelle. Das Wasser-in-Öl-Emulsionszentrifugationsverfahren ist ein einfaches, leistungsstarkes Werkzeug zur Herstellung von riesigen Vesikeln mit verkapselten Materialien.

Herstellung von Riesenvesikeln Encapsulating Microspheres durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Das übergeordnete Ziel dieser Zentrifugationsmethode für Wasser-in-Öl-Emulsionen besteht darin, einfach eine dünne Schicht aus riesigen Vesikeln herzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der synthetischen Biologie zu beantworten, beispielsweise die Erzeugung einer künstlichen Zelle auf Basis riesiger Vesikel. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine 25 Millimolar-Stammlösung von DOPC und eine 0,2 Millimolar-Stammlösung von Texas Red DHPE in Chloroform herstellen.Bilden Sie anschließend einen Lipidfilm auf der Innenfläche eines fünf Milliliter fassenden Glasfläschchens, indem Sie eine Mischung der DOPC- und Texas Red DHPE-Stammlösungen unter fließendem Stickstoffgas verdampfen lassen. Nach einer Inkubation des Films über Nacht unter vermindertem Druck geben Sie einen Milliliter flüssiges Paraffin zum Fläschchen hinzu. Wickeln Sie das Fläschchen in Aluminiumfolie ein und inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei 80 Grad Celsius.In einem 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit Deckel 237,5 Mikroliter 1-Mikrometer-Nonfluoreszenz-Mikrokugeln und 12,5 Mikroliter 1-Mikrometer-Fluoreszenz-Mikrokugeln mischen. Geben Sie nun 64 Milligramm Saccharose, gefolgt von 125 Mikrolitern einer einmolaren Tris-Pufferlösung und 875 Mikrolitern entionisiertem Wasser, zu dem Mikroröhrchen hinzu. Vortexen Sie die Mischung 30 Sekunden lang und führen Sie anschließend eine 10-minütige Beschallung durch.Nach der Herstellung von 10 Milliliter einer Tris-pufferierten Lösung ein Milliliter in ein verschließbares 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen geben. Sobald die Lösung verwirbelt und sonifiziert wurde, einen Milliliter der Öllösung mit 300 Mikroliter der inneren wässrigen Lösung in einem 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen vermischen. Die beiden Komponenten im Mikroröhrchen durch Emulgieren mit einem mechanischen Homogenisator bei 10.000 U/min für zwei Minuten bei Raumtemperatur homogenisieren.Anschließend vorsichtig 300 Mikroliter der Wasser-in-Öl-Emulsion auf der oberen Oberfläche von einem Milliliter der äußeren wässrigen Lösung bei vier Grad Celsius in einem 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit Deckel schichten. Unmittelbar nach dem Kühlen des Mikroröhrchens für 10 Minuten das Gemisch bei 18.000 × g für 30 Minuten zentrifugieren. Danach die präzipitierten Riesenvesikel oder GVs erhalten, indem man den Boden des Mikroröhrchens mit einer Drucknadel durchsticht und einen Tropfen in einem sterilisierten 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen auffängt.Platzieren Sie eine adhesive Inkubationskammer für NC zwei Polymerase-Kettenreaktion und Hybridisierung auf einem mikroskopischen Deckglas. Geben Sie mithilfe einer Mikropipette 25 Mikroliter der verdünnten präzipitierten GV in den Probeneinsatzbereich und setzen Sie unmittelbar danach ein 0,15 mm dickes Deckglas auf die Inkubationskammer. Nach der Aufnahme von Mikroskopiebildern der Vesikel führen Sie die Fluoreszenzmikroskopie durch, indem Sie zunächst die Fluoreszenzspiegel-Einheiten UFBNA und UFMCHE in das Mikroskop einsetzen.Danach die Einheiten mit Anregungs- und Emissionsfiltern für die Analyse ausstatten. Der wichtigste Faktor für den Erfolg der Wasser-in-Öl-Methode ist, dass die Dichte der inneren wässrigen Lösung größer sein muss als die der äußeren wässrigen Lösung, damit die GV während der Zentrifugation ausfallen. Die differentielle Interferenzkontrastmikroskopie und die Fluoreszenzmikroskopie der GV ohne und mit Mikrokügelchen bestätigten, dass GV mit geringer Lamellarität gebildet wurden.Von den 160 erhaltenen GV wurden 55 Mikrosphären eingeschlossen und 105 blieben leer, was einem Einschlussverhältnis von 34 % entspricht. Der Volumenanteil der Mikrosphären in den GV wurde auf etwa 11 ± 3 Volumenprozent geschätzt, und die Genauigkeit des berechneten Volumenanteils lag zwischen 10 und 30 %. Die Einschließung anderer Materialien in GVs mit 100 Molprozent DOPC unter Verwendung derselben äußeren wässrigen Lösung und desselben Protokolls war erfolgreich, wie durch differentielle Interferenzmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie gezeigt wurde. Anschließend können andere Methoden wie die Durchflusszytometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Aufklärung der modellierten Zelle.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man riesige Vesikel mit eingeschlossenen Materialien herstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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