Herstellung von Riesenvesikeln Encapsulating Microspheres durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion

Das übergeordnete Ziel dieser Wasser-in-Öl-Emulsionszentrifugationsmethode ist es, auf einfache Weise ein Dünnschicht-Riesenvesikel herzustellen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der synthetischen Biologie zu beantworten, wie z. B. die Schaffung einer künstlichen Zelle auf der Grundlage eines riesigen Vesikels. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine 25 Millimolare Stammlösung von DOPC und eine Nullkomma zwei Millimolare Stammlösung von Texas Red DHPE in Chloroform vor.

Als nächstes bilden Sie einen Lipidfilm auf der Innenfläche eines Fünf-Milliliter-Glasfläschchens, indem Sie eine Mischung aus DOPC und Texas Red DHPE-Stammlösungen unter strömendem Stickstoffgas verdampfen. Nachdem Sie den Film über Nacht unter reduziertem Druck inkubiert haben, geben Sie einen Milliliter flüssiges Paraffin in das Fläschchen. Wickeln Sie das Fläschchen in Alufolie ein und inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei 80 Grad Celsius.

In einem Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Mikroröhrchen mit Deckel mischen Sie 237 Komma fünf Mikroliter von einem Mikrometer nicht-fluoreszierenden Mikrosphären und 12 Komma fünf Mikroliter von einem Mikrometer fluoreszierenden Mikrosphären. Geben Sie nun 64 Milligramm Saccharose, gefolgt von 125 Mikrolitern einer molaren Tris-gepufferten Lösung und 875 Mikrolitern deionisiertem Wasser in das Mikroröhrchen. Die Mischung 30 Sekunden lang vortexen und dann 10 Minuten lang beschallen.

Nach der Zubereitung von 10 Millilitern einer gepufferten Tris-Lösung geben Sie einen Milliliter in ein Mikroröhrchen mit einem Deckel von fünf Millilitern. Sobald die Lösung vortext und beschallt wurde, mischen Sie einen Milliliter der Öllösung mit 300 Mikrolitern der inneren wässrigen Lösung in einem Ein-Punkt-Mikroröhrchen von fünf Millilitern. Emulgieren Sie die beiden Komponenten im Mikroröhrchen mit einem mechanischen Homoginizator, der zwei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 10.000 U/min betrieben wird.

Als nächstes schichten Sie vorsichtig 300 Mikroliter der Wasser-in-Öl-Emulsion auf die Oberseite eines Milliliters der äußeren wässrigen Lösung bei vier Grad Celsius in einem Mikroröhrchen mit einem Deckel von einem Punkt und fünf Millilitern. Unmittelbar nach dem Abkühlen des Mikroröhrchens für 10 Minuten zentrifugieren Sie die Mischung bei 18.000 mal G für 30 Minuten. Wenn Sie fertig sind, erhalten Sie die ausgefällten Riesenvesikel oder GVs, indem Sie den Boden des Mikroröhrchens mit einer Stecknadel durchstechen und ein Tröpfchen in einem sterilisierten Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Mikroröhrchen sammeln.

Platzieren Sie eine adhäsive Inkubationskammer für NC, zwei Polymerase, Kettenreaktion und Hybridisierung auf einem Mikroskop-Deckglas. Mit einer Mikropipette werden 25 Mikroliter der verdünnten gefällten GVs auf die Probenfläche aufgetragen und sofort ein fünf Millimeter dickes Deckglas mit einer Nullkommastärke auf die Inkubationskammer gelegt. Nachdem Sie Mikroskopiebilder der Vesikel aufgenommen haben, führen Sie die Fluoreszenzmikroskopie durch, indem Sie zuerst UFBNA- und UFMCHE-Fluoreszenzspiegeleinheiten in das Mikroskop einsetzen.

Anschließend werden die Geräte mit Anregungsfiltern und Emissionsfiltern für die Analyse ausgestattet. Die wichtigste Determinante für den Erfolg der Wasser-in-Öl-Methode besteht darin, dass das spezifische Gewicht der inneren wässrigen Lösung größer sein muss als das der äußeren wässrigen Lösung, damit die GVs während der Zentrifugation ausfällt. Differentielle Interferenzmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie der GVs ohne Mikrosphären und mit Mikrosphären bestätigten, dass GVs mit geringer Lamellarität gebildet wurden.

Von den 160 erhaltenen GVs waren 55 verkapselte Mikrosphären und 105 leer, was einem Verkapselungsverhältnis von 34 % entspricht. Der Volumenanteil der Mikrosphären in den GVs wurde auf etwa 11 plus oder minus drei Volumenprozent geschätzt, und die Genauigkeit des berechneten Volumenanteils betrug 10 bis 30 %. Die Verkapselung anderer Materialien in 100 Molprozent DOPC-GVs unter Verwendung derselben äußeren wässrigen Lösung und des gleichen Protokolls war erfolgreich, wie die Differenzialinterferenzmikroskopie und die Fluoreszenzmikroskopie zeigten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Durchflusszytometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Aufklärung der modellierten Zelle zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man riesige Vesikel mit verkapselten Materialien vorbereitet.