Кинетика синтеза Отставание-нити ДНК In Vitro С помощью бактериофага Т7 белков репликации

Общая цель этой процедуры заключается в изучении кинетики синтеза праймера и запаздывающей цепи ДНК. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репликации ДНК, например, как праймеры образуются ДНК-праймазой, переносятся и используются ДНК-полимеразой. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет идентифицировать ключевые этапы синтеза фрагментов Оказаки.

Поскольку в данном эксперименте используются радиоактивные материалы, необходимо соблюдать все институциональные нормы, касающиеся безопасного использования и захоронения радиоактивных материалов. Начните с выделения двух микролитров буфера формамидного красителя в восемь полипропиленовых пробирок объемом 1,5 миллилитра, что равно количеству анализируемых временных точек. Затем приготовьте смесь объемом 20 микролитров, состоящую из буфера, АТФ, CTP, CTP, меченных по альфа-фосфатной группе P32, одноцепочечной матрицы ДНК и белка гена четыре, или геликазы четырех примаз GP.

Выдерживайте смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. Через пять минут с помощью пипетки удалите два микролитра смеси, и смешайте ее с двумя микролитрами буфера формамида на красителе в одной из 1,5 миллилитров подготовленных ранее. Это контроль отсутствия реакции.

Добавьте в реакционную смесь два микролитра 0,1 моляра хлорида магния и сразу запустите таймер. С интервалом в 10 секунд вручную извлеките два микролитра реакционной смеси и смешайте с формамидным красителем в пробирках объемом 1,5 миллилитра. После того, как все временные точки будут собраны, нагрейте образцы в термоблоке при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Загрузите аликвоты образцов на денатурирующий гель для электрофореза. Начните эту процедуру с приготовления реакционных смесей. Приготовьте 400 микролитров раствора А, содержащего буфер, GP четыре гексамера, одноцепочечную матрицу ДНК, DNTP, ATP, CTP и CTP, меченные по альфа-фосфатной группе P32.

Приготовьте 400 микролитров раствора В, содержащего один Х буфер и 20 миллимоляров хлорида магния. Затем настройте инструмент для быстрой закалки. Включите прибор, а после появления главного меню наберите на клавиатуре прибора цифру семь, чтобы перевести драйвер шприца в исходное положение.

Откройте буферный шприц для загрузки. Наполните шприц С раствором гашения, затем с помощью шприца объемом 10 мл заполните буферные емкости прибора А и В буфером. Удалите пузырьки воздуха, нажимая на поршни внутрь и наружу.

Измените положение ручки в положение выстрела. Введите два, чтобы отрегулировать положение стержня драйвера шприца. Нажмите кнопку регулировки вниз, чтобы опустить шприц до тех пор, пока буфер не выйдет из выходного контура.

Введите escape, чтобы вернуться в главное меню. Чтобы промыть трубку, подсоедините выходную линию к вакууму. Установите ручки образца на заподлицо.

Установите ручки в горизонтальное положение, чтобы закрыть буферный шприц. Включите пылесос, опустите две петли смыва в воду на 10 секунд, а затем опустите в метанол на 10 секунд. Высушите петли, всасывая воздух в течение примерно 15 секунд, или до полного высыхания.

Чтобы загрузить сэмплы, измените положение ручки сэмплов на загрузку. Поместите раствор А в одномиллилитровый шприц, вставьте шприц в одно из отверстий для загрузки проб, таким же образом поместите раствор Б в противоположное отверстие для загрузки проб. Начните сбор временных точек, введя один из них в главном меню для выполнения потока гашения.

Введите время реакции и нажмите Enter. Отобразится номер используемого цикла реакции. Переключитесь на нужный контур реакции.

После промывки пробирки, как показано ранее, поверните ручки образца в положение загрузки. Загрузите реакционные смеси в петли для образцов до тех пор, пока они не окажутся за пределами центрального смесительного отделения. Поверните все ручки в положение огня и убедитесь, что все ручки находятся в правильном положении.

Поместите трубку объемом 1,5 миллилитра на конец выходной петли. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы запустить реакцию. После повторения процедуры промывки трубки перезагрузите буферные шприцы A и B до тех пор, пока они не попадут в драйвер буферного шприца.

Повторяйте шаги по запуску реакции для каждого нужного момента времени, за одним исключением, не загружайте раствор Б при гашении управления нулевой точкой времени. Когда сбор образцов будет завершен, нажмите escape, чтобы вернуться в главное меню. Нажмите семь, чтобы вернуть драйвер буферного шприца в исходное положение.

Начните зачистку прибора, сняв шприцы с реакционной смесью, поверните ручку загрузки образца в положение загрузки. Под вакуумом промойте каждый контур образца по 10 миллилитров гидроксида натрия, фосфорной кислоты и метанола. Нажмите на все три поршня шприца, чтобы восстановить реакцию и погасить буферы.

Промойте шприцы пятью миллилитрами воды не менее двух раз. Снова наполните шприцы пятью миллилитрами воды, поверните ручки в положение огня, включите пылесос и опустите драйвер с помощью команды клавиатуры для удаления воды. Промойте трубку, как показано ранее.

Наконец, выключите прибор для быстрой тушения. Затем образцы анализируются в соответствии с текстовым протоколом. Эти результаты были получены путем ручного отбора проб реакции синтеза праймера, катализируемой GP 4, в условиях многократного оборота.

Меченый предшественник CTP демонстрирует наибольшую подвижность и мигрирует к дну геля, за ним следуют более медленно мигрирующие вещества, соответствующие красителю и тетрарибонуклеотидам, синтезированным GP 4. В зависимости от продолжительности инкубации и контекста матрицы последовательности могут наблюдаться дополнительные меченые продукты, соответствующие более высоким олигомерам. Когда прибор для быстрого гашения используется для изучения реакции, катализируемой GP 4 во временных масштабах в диапазоне от секунд до нескольких мс, становится очевидным, что накопление праймера не является линейным, а демонстрирует двухфазный профиль, обозначенный сплошной линией.

Это говорит о том, что образование продукта происходит быстро, а высвобождение ограничивает скорость в установившемся состоянии. Пунктирная линия представляет собой гипотетическую кривую прогресса, которая была бы получена, если бы образование праймера на четвертом GP не происходило с предустановившимся взрывом. Эксперимент по синтезу праймера с одним оборотом позволяет получить информацию об образовании и распаде промежуточных веществ в процессе превращения субстрата в продукт.

Временной ход образования тетрамера показан на изображении геля. На графике показано соотношение промежуточного формирования ко времени. После освоения этой техники ее можно выполнить за 90 минут, если она выполнена правильно.

Не забывайте, что работа с радиоактивными реагентами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как надлежащее экранирование.