Eine Vorrichtung zur Durchführung Zellmigration / Wundheilung in einer 96-Well-Platte

Das übergeordnete Ziel dieses mechanischen Achtkanal-Zellwicklers ist es, die Wirkung der Behandlung auf die Zellmigration mit dem Wundheilungsassay schnell und mit halbhohem Durchsatz zu quantifizieren, ohne den Einsatz teurer und komplizierter Geräte. Die Zellmigration ist ein wichtiger zellulärer Prozess unter verschiedenen physiologischen und starken physiologischen Bedingungen. In-vitro-Wundheilungsassays werden in verschiedenen Studien eingesetzt, darunter Krebs-, Reskulär- und dermatologische Studien.

Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass die Wirkung auf die Zellmigration auf einer 96-Schiene-Seite überwacht werden kann, so dass verschiedene Behandlungsbedingungen gleichzeitig beobachtet werden können. Das Verfahren wird von Ka Chun Ng, einem Doktoranden aus unserem Labor, vorgeführt. Bereiten Sie zu Beginn des Experiments den Stifthalter vor, indem Sie die Wickelstifte in gleichen Abständen befestigen.

Halten Sie die Pipettenspitzen fest und bewegen Sie die verstellbaren Aufwickelstifte auf und ab, um die Spitzenhöhe einzustellen. Montieren Sie als Nächstes die verstellbare Führungsschiene an verschiedenen Marken auf 96-Well-Kulturplatten und stellen Sie sicher, dass sich der Wundbereich in einer festen Position befindet. Befestigen Sie den verstellbaren Wickelstift, indem Sie die Sechskantschraube festziehen.

Fixieren Sie die Führungsschiene, indem Sie die Innensechskant-Kopfkappen an beiden Enden festziehen. Verwenden Sie einen M5-Inbusschlüssel, um die Innensechskant-Kopfkappen zu lösen. Setzen Sie eine geeignete Anzahl von Einstellringen auf beiden Seiten des Stifthalters ein, so dass die Führungsschienen perfekt auf die Breite der 96-Well-Kulturplatte passen.

Ziehen Sie dann die Innensechskant-Kopfkappen fest, um die Führungsschiene zu fixieren. Beginnen Sie mit der Einstellung der Führungsschienen, indem Sie die Aufwickelstifte mit sterilen 10-Mikroliter-Pipettenspitzen aus Kunststoff versehen. Lösen Sie anschließend die Innensechskant-Kopfkappen mit dem M5-Inbusschlüssel.

Halten Sie den Wickel fest und tauchen Sie die Wundstifte in eine Säule einer 96-Well-Kulturplatte. Passen Sie dann die Höhe der Führungsschienen an, bis alle Spitzen den Boden der Vertiefungen kaum berühren. Ziehen Sie die Innensechskant-Kopfkappen fest.

Stellen Sie sicher, dass der Wickeler nun perfekt auf die Kulturplatte passt und dass die Stifte gut in der Mitte der Vertiefungen positioniert sind. Halten Sie die Wickelmaschine senkrecht zu einer flachen, sterilen Oberfläche, z. B. einer Petrischale, und lösen Sie alle Sechskantschrauben mit dem M3-Inbusschlüssel. Klopfen Sie auf die Wicklung, bis alle Spitzen gleichmäßig die Oberfläche berühren.

Nachdem die Spitzen die Oberfläche gleichmäßig berührt haben, ziehen Sie die Sechskantschrauben erneut fest, um die Stifte in Position zu halten. Überprüfen Sie dann die Gleichmäßigkeit jeder Spitze, indem Sie mit dem Wickel vorsichtig auf die flache, sterile Oberfläche klopfen. Säen Sie humane vaskuläre Endothelzellen der Nabelschnur auf einer mit 0,1 %iger Gelatine beschichteten 96-Well-Zellkulturplatte.

Kulturzellen in Medium 199, ergänzt mit 20 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,09 Gramm Heparin pro Liter. Halten Sie die Zellen über Nacht in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius, bevor Sie sie verwenden. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 100 % erhalten haben, platzieren Sie die Verwundungsspitzen an der äußersten linken Seite jeder Vertiefung in derselben Spalte der Kulturplatte.

Schiebe den Wickel auf die andere Seite der Vertiefung. Stellen Sie sicher, dass die Wunden den Boden der Vertiefung berühren. Um sicherzustellen, dass die Wunde in jeder Vertiefung des Zellmolinars zentriert und in derselben Welle ist, schwingen Sie die Wunde über die Vertiefung zum anderen Ende.

Wiederholen Sie das Kratzen für alle Spalten. Entsorgen Sie das Medium nach dem Verwunden in jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch frisches Medium, das Testverbindungen enthält. Gehen Sie dann zur Datenerfassung und Bildanalyse über.

Repräsentative Bilder einer Reihe und einer Säule von Vertiefungen unmittelbar nach dem Kratzen ermöglichen eine quantitative Analyse der Breite jeder Wunde. Wundbilder wurden von menschlichen Endothelzellen der Nabelschnurvene und humanen Hautfaserblasten erhalten. Die gestrichelte Linie zeigt den gewundenen Bereich und die durchgezogene Linie den Zellmigrationsbereich an.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dieses Gerät verwenden, um einen Wundheilungsassay auf einer 96-Well-Seite mit halbhohem Durchsatz durchzuführen und sicherzustellen, dass jede Well vom Wunde zerkratzt wird.