Mikroskopie-basierten Methoden für die Beurteilung der Epithelzelle Migration bei der In-vitro- Wundheilung

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren zur künstlichen Verwundung von Epithelzellkulturen ist es, die Zellmigration sowohl aus quantitativer als auch aus qualitativer Perspektive zu untersuchen, um die Auswirkungen spezifischer Behandlungen auf die Wundheilung beurteilen zu können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Wundheilung zu beantworten, da sie eine genaue Charakterisierung der Rolle spezifischer Migrationsprozesse während der Epithelstörung ermöglicht. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er die Korrelation von Zellmigrationsmessungen mit Veränderungen im Verhalten relevanter molekularer Marker ermöglicht.

Die Implikation dieser Techniken erstreckt sich auch auf die Therapie klinischer Wunden, da sie ein bequemes Setup für frühe Medikamententests und für den Wundverschluss bietet. Im Allgemeinen wird mit dieser Methode begonnen, da es schwierig ist, eine konsistente Reproduzierbarkeit in den Wunden mit einer Generation zu erreichen. Für einen künstlichen Wundkratztest beginnen Sie damit, jede Vertiefung einer Kulturplatte mit zwei Millilitern Epithelzellen von Interesse in vollständigem Medium zu bepflanzen.

Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid für zwei bis drei Tage, bis eine Konfluenz von 100 % erreicht ist. Wenn die Zellen fertig sind, waschen Sie die Zellen zweimal mit frischem serumfreiem Medium, gefolgt von 24 Stunden Kultur in frischem serumfreiem Medium. Stellen Sie die Platte am nächsten Tag in einen sterilen Arbeitsbereich und ziehen Sie das schmale Ende einer sterilen Mikropipettenspitze zweimal über den Boden jeder Vertiefung, um eine kreuzförmige Wunde zu erzeugen.

Ein gleichmäßiger Wundspalt wird erreicht, indem konstanter, fester Druck ausgeübt wird, während die Spitze sanft entlang der Epitheloberfläche bewegt wird. Übermäßiger Druck verformt die Spitze und führt zu einem unregelmäßigen Wundradius. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, um die abgelösten Zellen zu entsorgen, und geben Sie vorsichtig frisches, serumfreies Medium in die Vertiefungen.

Richten Sie bei Verwendung eines inversen Phasenkontrastmikroskops, das an eine ladungsgekoppelte Gerätekamera angeschlossen ist, den Rand des Mikroskopfelds mit dem angrenzenden Schnittpunkt der Kratzer aus, um bis zu vier Referenzbilder des Kratzspalts in jeder Vertiefung vor der Behandlung zu erhalten. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, ersetzen Sie das Medium in den dafür vorgesehenen Behandlungsvertiefungen durch frisches Medium, ergänzt mit ausgewählten Behandlungen von Interesse, und legen Sie die Platten wieder in den Zellkultur-Inkubator zurück. Wenn mindestens eine Bedingung einen Kratzlückenschluss von etwa 90 % erreicht, ersetzen Sie den Überstand vorsichtig durch einen Milliliter vier Prozent Formalin in PBS für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.

Waschen Sie dann die Zellen mindestens dreimal vorsichtig mit PBS, um überschüssiges Formalin zu entfernen, und bilden Sie die Vertiefungen wie gerade gezeigt ab, wobei dieselben Bildgebungsparameter in den ursprünglichen Referenzbereichen verwendet werden, die nach dem Kratzen aufgenommen wurden. Um die Bilder mit der entsprechenden Bildverarbeitungssoftware zu analysieren, öffnen Sie das aufgenommene Bild vor der Behandlung und stellen Sie im Menü Bild den Bildtyp auf 8-Bit ein. Wählen Sie im Menü Prozess das Untermenü Filter aus und wenden Sie die Varianzfilterung an.

Öffnen Sie im Menü Bild das Untermenü Anpassen und stellen Sie den Schwellenwert auf Schwarzweiß ein. Wählen Sie im Menü Prozess das Untermenü Binär und wenden Sie Löcher füllen an. Wählen Sie im Menü Analysieren die Option Messungen festlegen und aktivieren Sie Bereich.

Zeichnen Sie dann den messbaren Bereich, indem Sie der wandernden Kantenkontur folgen, um den Spalt zu begrenzen. Wählen Sie im Menü Analysieren die Option Partikel analysieren aus, und notieren Sie die Gesamtflächenwerte für die Oberfläche des gezeichneten Bereichs. Um die absolute Migration für jeden Satz einzelner Proben als Differenz zwischen den Messungen der Spaltoberfläche zu quantifizieren, exportieren Sie die Werte der Gesamtspaltoberfläche vor und nach der Behandlung in eine Tabelle und stellen Sie die Quantifizierungsausgaben grafisch dar.

Für einen künstlichen Migrationsfront-Assay wird unter sterilen Bedingungen eine Schicht von bis zu 33 sterilisierten runden Deckgläsern in leere 10-Zentimeter-Kulturplatten gegeben. Wenn die Plattenoberfläche vollständig bedeckt ist, säen Sie die interessierenden Epithelzellen vorsichtig in einer Konzentration aus, die nach zwei oder drei Tagen Kultur eine 100%ige Konfluenz ermöglicht. Drücken Sie die Deckel bei Bedarf vorsichtig mit einer sterilen Mikropipettenspitze ein, um ein Schweben zu verhindern.

Wenn die Zellen die Konfluenz erreichen, ersetzen Sie den Überstand für weitere 24 Stunden durch serumfreies Medium. Verwenden Sie dann eine sterile Pinzette, um ein Deckglas vorsichtig in eine neue 10 Zentimeter dicke Platte mit frischem serumfreiem Medium zu übertragen, und achten Sie darauf, das Deckglas an seiner Peripherie zu halten. Um die künstlichen Wunden zu erzeugen, ziehen Sie eine sterilisierte Rasierklinge über jedes Deckglas hin und her, um eine drei bis vier Millimeter breite Querlinie über die Mitte jeder Zellkultur zu ziehen, um den zentralen Monolayer-Streifen vollständig zu entfernen.

Achten Sie darauf, die Klingenkante beim Anfertigen der Wunde stark über die Deckglasoberfläche zu legen, um sie vor einer unregelmäßigen Kantenform und der Entstehung von herabhängenden Epithelanteilen zu schützen. Übertragen Sie bis zu vier Wunddeckgläser mit der Zellseite nach oben in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte, die mindestens zwei Milliliter serumfreies Medium enthält, und waschen Sie jede Vertiefung vorsichtig zweimal mit frischem serumfreiem Medium, um abgelöste Zellen zu entfernen. Wenn alle abgelösten Zellen verworfen wurden, ersetzen Sie das Waschmedium vorsichtig durch frisches Medium, das mit den gewünschten Behandlungen ergänzt wurde, und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator.

Am Ende des entsprechenden Versuchszeitraums fixieren Sie die Zellen mit vier Prozent Formalin in PBS, wie gerade gezeigt, und färben Sie die Zellen mit den entsprechenden fluoreszierenden konjugierten Antikörpern von Interesse. Anschließend werden die strukturellen Veränderungen, die an der wandernden Vorderkante auftreten, durch Fluoreszenzmikroskopie gemäß den interessierenden experimentellen Parametern abgebildet. In diesem Experiment wurden die Wundlücken vor und nach der Behandlung mit dem epidermalen Wachstumsfaktor, einem bekannten Induktor der Proliferation und Migration von Epithelzellen, gemessen.

Die absolute Migration wurde dann als Differenz zwischen den Spaltflächen vor und nach der Behandlung berechnet. Die Behandlung mit dem epidermalen Wachstumsfaktor potenziert die Dynamik des Zellzytoskeletts, wie in diesen Laserscanning-Mikroskopiebildern der F-Aktin-Färbung von Kontroll- und Wachstumsfaktor-stimulierten Zellen zu sehen ist. Darüber hinaus wird eine c-Jun-Überexpression mit einer erhöhten Expression des Proteins in den Zellen beobachtet, die an die Migrationsfront angrenzen.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Integrität der Wundränder auf das Vorhandensein von Epithelzelllappen zu überprüfen, die die Quantifizierung der Migration stören können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Zugverhalten der