Name: Mikroskopie-basierten Methoden für die Beurteilung der Epithelzelle Migration bei der In-vitro- Wundheilung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Erfahren Sie mikroskopiebasierte Methoden zur Bewertung der Epithelzellmigration bei der In-vitro-Wundheilung. Diese Technik ermöglicht quantitative und qualitative Analysen für die frühe Arzneimittelprüfung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir wollen durch ältere Mitglieder des Labors geben, die helfen, verbessern und verfeinern Sie diese Techniken in den tatsächlichen Zustand: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada und Dr. Antonia Alcaraz-García. Wir sind verpflichtet, das Hospital Clínico Universitario Virgen De La Arrixaca für unterstützt nachdrücklich die Entwicklung dieser Techniken. Auch das Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Planen Sie Estatal ich + D + I und Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento De La Investigación (Grant-Nr.: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una Manera de Hacer Europa". Wir danken auch Universidad de Murcia, IMIB Arrixaca und FFI für administrative Unterstützung und Hilfe. Schließlich wollen wir einen besonderen Dank an Dr. Isabel Martínez-Argudo und die Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico De La Fábrica de Armas, Universidad Castilla La Mancha Toledo für ihre freundliche Unterstützung in bereitwillig Abtretung geben die Biomedizin und Biotechnologie-Labor den gefilmten Teil dieses Papiers zu ermöglichen.

1. künstliche Wunde kratzen Assay für Quantitative Studien
<ol>
	<li>Zelle Monolage Vorbereitung
	<ol>
		<li>Arbeiten unter sterilen Bedingungen, Samen und Mv1Lu oder HaCaT Epithelzellen in Kulturflaschen mit Serum ergänzt Medium wachsen. Aktualisieren Sie Medium einmal alle 24-48 h. Nachdem Zellen Zusammenfluss von 80 % erreichen, lösen Sie Zellen unter Verwendung einer geeigneten Methode, d.h., Trypsinization9. Hinweis: Mv1Lu und HaCaT epithelialen Zelllinien mit EMEM und DEMEM Nährmedium kultiviert werden, mit 2 mM L-Glutamin ergänzt bzw. bei 37 ° C mit 5 % CO2kontrollierter Atmosphäre inkubiert. Jede Zelllinie muss gründlich untersucht werden, um festzustellen, Zellkonzentration und Timing erforderlich, um volle Konfluenz zu erreichen. In der Regel für Mv1Lu oder HaCaT-Zellen, 2-4 x 104 oder 4-6 x 104 Zellen/Brunnen, bzw. sind entkernt in einem 175 cm2 Kultur Kolben und bei 80 % Zusammenfluss ergibt bis zu 35 x 106 Mv1Lu oder 1 x 107 HaCaT-Zellen.</li>
		<li>Samen Sie in entweder einer Kultur 12-Well oder 24-Well-Platte in jede Vertiefung 2 mL der Zellen. Medium zu aktualisieren, sobald alle 24-48 h. sicher Zellzahlen sind hoch genug, um 100 % Zusammenfluss nach 2 oder 3 Tagen erreichen.</li>
		<li>Nachdem die Zellen Zusammenfluss erreicht haben, entfernen Sie das Serum ergänzt Medium zu und waschen Sie zweimal mit frischem serumfreien Medium. Halten Sie Zellen in serumfreien Medium für 24 h vor dem Verkratzen. Hinweis: Mv1Lu oder HaCaT-Zellen haben keine speziellen Substrat Anforderungen; jedoch sollte vor Beschichtung der Kultur Plattenoberfläche mit einer Poly-L-Lysin-Lösung für Zell-Linien trennen spontan in serumfreien Bedingungen anfällig,10gelten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monolage kratzen
	<ol>
		<li>Arbeiten in einer sterilen Umgebung, kratzen Sie die Monolayer Kultur durch das schmale Ende 20 µL und 200 µL steriler Mikropipette Tipp, abhängig von der gewünschten Breite Kratzer fest ziehen. Halten Sie die Spitze senkrecht zur Oberfläche Kultur Lücke Homogenität zu maximieren.<ol>
			<li>Platzieren Sie die Kultur-Platten über eine dunkle Oberfläche deutlich die Zelle Monolage überwachen. Bei Bedarf führen Sie zwei senkrecht Kratzer (kreuzförmige) auf jedem Bohrloch bis zu 4 Migration Bereiche zu studieren.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Waschen Sie freistehende Zellen durch sanft entfernen, Kultur und sanft hinzufügen frischen serumfreien Medium. Zwei Mal wiederholen, oder bis die meisten ungebundene Zellen entfernt worden sind.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Experimentelle Verfahren und Datenerhebung
	<ol>
		<li>Nehmen Sie bis zu 4 Vorbehandlung Referenzbilder zentriert auf die Kratzer Lücke von jeder gut mit einem invertierten Phasenkontrast-Mikroskop mit einer CCD-Kamera. Wählen Sie Interesse Bereiche ausrichten Mikroskop Feldrand bis zur angrenzenden Kreuzung von Kratzern. Hinweis: In der Regel sind Bilder aufgenommen mit einer 10-fach Vergrößerung und eine Bildgröße von 1.280 x 1.024 Pixel. Auswahl der Interessengebiete wie oben hilft für einfache Lokalisierung und Validierung von bis zu 4 Messungen pro Bohrloch beschrieben.</li>
		<li>Sobald alle Bilder gesammelt sind, benennen Sie Behandlung Brunnen; tauschen Sie das Medium in den Brunnen mit frischem Medium, das ausgewählte Behandlungen enthält. Hinweis: Alternativ können für Chemikalien oder Verbindungen, die nicht Kulturmedium Homogenität stören, Behandlungen direkt in das Kulturmedium geimpft werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie zerkratzte Platte (37 ° C mit kontrollierter Atmosphäre mit 5 % CO2), bis die Bedingungen, unter Beobachtung erreichen 90 % Scratch Lückenschluss. Vermeiden Sie Vollsperrung. Hinweis: Insgesamt Lückenschluss hebt Nachbehandlung Bildersammlung Referenzflächen sind nicht nachweisbar und der Zeitbezug zum Schließen der Lücke kann nicht hergestellt werden. Im Falle von Mv1Lu oder HaCaT-Zellen sind 16-19 h verpflichtet, 90 % Zusammenfluss zu erreichen.</li>
		<li>Stoppen Sie die Zellwanderung durch die Fixierung der Zellen; ersetzen Sie sanft die experimentelle Kulturmedium mit 1 mL 4 % Formalin in PBS. 15 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen der Zellen, um überschüssige Formalin zu entfernen; ersetzen Sie sanft die Lösung in den Vertiefungen mit frischen PBS. Wiederholen Sie mindestens zwei Mal. Hinweis: In diesem Stadium können nach dem Abdichten, Platten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.</li>
		<li>Die ursprüngliche Referenzflächen gefangen genommen, nachdem kratzen entnehmen Sie Nachbehandlung Referenzbilder von jedem Bohrloch. Verwenden Sie die gleiche Ausstattung (umgekehrte optische Phasenkontrast-Mikroskop mit einer CCD-Kamera) und passenden Bildeinstellungen (Vergrößerung und digitaler Auflösung/Dichte). Hinweis: Zellen, die einzeln zu migrieren und die Lücke unabhängig von der Bildung einer einheitlichen Front (z.B. MDA-MB-231 menschlichen Brustkrebszellen), können die Zeitverlauf Bilder die Berechnung der einzelnen Zelle Migration Geschwindigkeiten ermöglichen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bildanalyse und Quantifizierung der migration
	<ol>
		<li>Mittels Bildverarbeitungs-Software (z. B.ImageJ), definieren Sie Scratch Lücke Grenzen und bestimmen Sie die Lücke Oberfläche für bis zu vier Messungen in Vorbehandlung Bilder. Notieren Sie die Daten als "Vorbehandlung Lücke Oberfläche" (PREGAP). Wiederholen Sie den Vorgang für die Nachbehandlung Bilder. Notieren Sie die Daten als "Nachbehandlung Lücke Oberfläche" (POSTGAP).<ol>
			<li>Öffnen Sie das aufgezeichnete Bild mit ImageJ. Legen Sie im Menü "Bild" Bildtyp auf 8 Bit. Im Menü "Vorgang" zum Untermenü "Filter" und "Varianz" Filter anwenden.</li>
			<li>Im Menü "Bild" geben Sie "anpassen", Untermenü und Schwelle in schwarz und weiß (B &#38; W), stellen Sie sicher, "Dark Background" ist nicht aktiviert. Im Menü "Vorgang" zur "binär" Untermenü, und wählen Sie "Löcher füllen".</li>
			<li>Wählen Sie im Menü "analysieren" "Messungen" und aktivieren Sie "Raum" zu. Ziehen Sie den messbaren Bereich nach der Migration von Rand Kontur zur Abgrenzung somit der Lückenschluss.</li>
			<li>Wählen Sie im Menü "analysieren" "analysieren Partikel" und zeichnen Sie "Fläche" Werte für die gezeichnete Fläche Oberfläche.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PREGAP und POSTGAP Gesamtfläche Werte in einem Arbeitsblatt zu quantifizieren, absolute Migration für jeden Satz von Einzelproben als Differenz der Lücke Oberflächenmessungen vorstellen: PREGAP − POSTGAP [beliebige Einheiten]. Darüber hinaus absolute Migrationsdaten jeder Bedingung zu Kontrollproben zu normalisieren: (Probe / Kontrolle) * 100 [%]. Hinweis: Für Zellen, die einzeln zu migrieren und die Lücke unabhängig von der Bildung einer einheitlichen Front, (z.B., MDA-MB-231 menschlichen Brustkrebszellen), die absolute Migration kann berechnet werden durch zählen von Zellen in einer zentralen Streifen entweder in das Steuerelement oder die behandelten Proben.</li>
		<li>Plot-Quantifizierung Ausgänge (siehe Abbildung 1). Durchführen Sie statistische Analyse, wenn nötig.</li></ol></li></ol>Berücksichtigen Sie Studenten t-Test beim Vergleich von zwei Bedingungen oder Varianzanalyse Test für größere Anzahl von Bedingungen.
	
	

2. künstliche Migration vorderen Assay für topographische Studien
<ol>
	<li>Zelle Monolage Vorbereitung
	<ol>
		<li>Legen Sie unter sterilen Bedingungen arbeiten, eine Schicht aus sterilisierten Runde Deckgläsern in leere Kultur Platten bis die Plattenoberfläche vollständig bedeckt ist. Hinweis: Passen bis zu 12 und 33 Deckgläsern auf 5 cm und 10 cm Durchmesser Teller, beziehungsweise.</li>
		<li>Samen Sie auf dem Kultur-Teller sanft eine angemessene Lautstärke von Zellen in einer Konzentration, die 100 % Zusammenfluss nach 2 oder 3 Tagen erlaubt. Sicherstellen Sie, dass keine Deckglas benachbarten Deckgläsern überlappt und verhindern Sie, dass Deckgläsern schweben durch sanften Druck mit einer sterilen Mikropipette Spitze. Aktualisieren Sie dem Medium alle 24-48 h. Hinweis: Jede Zelllinie muss gründlich untersucht werden, ermitteln Zellkonzentration und Timing erforderlich, um volle Konfluenz zu erreichen. In der Regel sind für Mv1Lu oder HaCaT-Zellen, 2-3 x 106 oder 2,5-4 x 106 Zellen/10 cm-Durchmesser Teller, bzw. ausgesät. Für kleinere Platten müssen Zellzahlen verkleinert werden.</li>
		<li>Nachdem die Zellen Zusammenfluss erreicht haben, das Serum ergänzt Medium zu entfernen und ersetzen mit frischen serumfreien Medium. Halten Sie die Zellen in serumfreien Medium für 24 h, bevor die künstliche Wunde durchgeführt wird. Hinweis: Mv1Lu oder HaCaT-Zellen haben keine speziellen Substrat Anforderungen; jedoch sollte vor Beschichtung der Kultur Oberfläche mit einer Poly-L-Lysin-Lösung für Zell-Linien des Abnehmens spontan in serumfreien Bedingungen anfällig,10gelten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monolage Verwundung
	<ol>
		<li>Bewegen Sie mit sterilen Pinzette sanft ein Deckglas auf einen sauberen 10 cm Teller mit frischen serumfreien Medium. Beschädigung der Monolage halten das Deckglas an der Peripherie mit einer Pinzette zu vermeiden. Vermeiden Sie übermäßigen Druck auf der Deckglas Bruch führen könnten.</li>
		<li>Erstellen Sie künstliche Wunden durch Ziehen einer sterilisierten Rasierklinge in einer Querlinie mittig auf den Deckgläsern. Ziehen Sie ca. 3-4 mm hin und her, um den zentralen Monolage Streifen vollständig zu entfernen. Sicherstellen Sie, dass keine Zellenrückstand der Verwundeten Kanten verbunden bleibt. Hinweis: bei einem Durchmesser von 12 mm Runde Deckglas, erfolgt der Schnitt in der Mitte von dem Deckglas. Stellen Sie sicher, einen Streifen von Zellen gegenüber der Hauptfront groß genug (mindestens 2 mm breit) um zu vermeiden, Kippen des Deckglases in den folgenden Schritten zu verlassen.</li>
		<li>Verwundete Deckgläsern mit Zellen nach oben, um eine saubere 6-Well-Platte mit mindestens 2 mL frisches serumfreien Medium zu übertragen. Passen Sie bis zu 4 verwundete Deckgläsern/gut.</li>
		<li>Vorsichtig waschen, zwei Mal mit frischen serumfreien Medium, freistehende Zellen zu entfernen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Versuchsdurchführung und Probenahme
	<ol>
		<li>Tauschen Sie sanft das Medium in den Brunnen mit frischem Medium, das ausgewählte Behandlungen enthält. Hinweis: Alternativ können für Chemikalien oder Verbindungen, die nicht Kulturmedium Homogenität stören, Behandlungen direkt in das Kulturmedium geimpft werden. Gehen Sie mit Vorsicht, jede mögliche Zelle Loslösung zu vermeiden.</li>
		<li>Halten Sie die Platte in eine Zelle Brutmaschine (37 ° C, 5 % CO2) für das gewünschte experimentelle Timing.</li>
		<li>Stoppen Sie die Zellwanderung durch die Fixierung der Zellen; ersetzen Sie sanft die experimentelle Kulturmedium mit 1 mL 4 % Formalin in PBS. 15 min bei RT inkubieren Hinweis: Mal Kurs Experimente, entfernen Sie die Proben aus der Kultur-Platte und befestigen Sie sie in einer separaten Platte, Formalin-Dämpfe, die Auswirkungen auf die anderen, laufenden experimentellen Bedingungen zu vermeiden.</li>
		<li>Waschen der Zellen, um überschüssige Formalin zu entfernen; ersetzen Sie sanft die Lösung in den Vertiefungen mit frischen PBS. Wiederholen Sie mindestens zwei Mal. Hinweis: In diesem Stadium können nach dem Abdichten, Platten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunfluoreszenz (IF) und topologische Analyse
	<ol>
		<li>Führen Sie IF Färbung und Bildgebung auf einzelnen Deckgläsern als an anderer Stelle beschrieben,3,4,11.<ol>
			<li>Permeabilize für 10 min durch Eintauchen Deckgläsern in einer 0,3 % Triton x-100 Lösung mit PBS-Puffer.</li>
			<li>Block für 30 min mit der folgenden blockierende Lösung: 0,3 % Rinderserumalbumin; 10 % fötalen Rinderserum; 5 % Magermilch; 0,3 % Triton x-100 Lösung mit PBS-Puffer. Hinweis: Blockiert Lösung ohne Milch im Voraus vorbereitet und gespeichert werden kann bei-20 ° C.</li>
			<li>Inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer mit Primärantikörper in milchfreie blockierende Lösung verdünnt. Legen Sie die Deckgläsern kopfüber in die 15 µL Antikörper-Lösung für korrekte Verteilung zu gewährleisten. Hinweis: Die Antikörper arbeiten Verdünnung ist variabel und hängt von der Antikörper im Einsatz. Beispielsweise erfordert der Kaninchen-Anti-c-Jun-Antikörper eine Verdünnung von 1/100.</li>
			<li>Waschen Sie dreimal durch Eintauchen der Deckgläsern in einer in 0,1 % Triton x-100 Lösung in PBS.</li>
			<li>Inkubieren Sie die Deckgläsern in Sekundärantikörper verdünnt in milchfreie blockierende Puffer für 30 min. Hinweis: Die Antikörper arbeiten Verdünnung ist variabel und hängt von der Antikörper im Einsatz. Die Ziege-Anti-Kaninchen (488) benötigt beispielsweise eine Verdünnung von 1/400 für optimale Auflösung. Andere Kennzeichnung Reagenzien wie Phalloidin und Hoechst 33258 können in dieser Phase der Inkubation Puffer hinzugefügt.</li>
			<li>Waschen Sie dreimal durch Eintauchen der Deckgläsern in 0,1 % Triton x-100 Lösung in PBS.</li>
			<li>Montieren Sie die Deckgläsern kopfüber in ein 10 µL Montage Medien Tropfen (z.B.Vectashield) auf einen Objektträger gelegt. Verlassen Sie die Folien im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht für die Montage mittlerer Verhärtung. Danach, bei 4 ° C im Dunkeln auf unbestimmte Zeit zu speichern.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Erhalten Sie entweder Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie Bilder von strukturellen Veränderungen bei der Migration von Vorderkante. Hinweis: Topologische Studien können durch Fliesen Bilder von Migration von vorne auf die innere Monolage durchgeführt werden. Semi-quantitativen Studien sind möglich durch Software-basierte Analyse auf lokalen Fluoreszenz-Intensitäten.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Singer, A. J., Clark, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10471461">Cutaneous wound healing.</a> N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).</li>
<li>Davidson, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9710378">Animal models for wound repair.</a> Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).</li>
<li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+Membrane+Modifies+the+Genetic+Program+Induced+by+TGFss%2C+Stimulating+Keratinocyte+Proliferation+and+Migration+in+Chronic+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds.</a> PLoS One. 10 (8), e0135324(2015).</li>
<li>Ruiz-Canada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+stimulates+cell+migration+by+modulating+Transforming+Growth+Factor-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2017).</li>
<li>Schmierer, B., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta-SMAD+signal+transduction%3A+molecular+specificity+and+functional+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).</li>
<li>Hu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK+and+paxillin+dynamics+at+focal+adhesions+in+the+protrusions+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells.</a> Sci Rep. 4, 6024(2014).</li>
<li>Martinez-Mora, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroin+and+sericin+from+Bombyx+mori+silk+stimulate+cell+migration+through+upregulation+and+phosphorylation+of+c-Jun%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun.</a> PloS one. 7 (7), e42271(2012).</li>
<li>Bernabe-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleanolic+acid+induces+migration+in+Mv1Lu+and+MDA-MB-231+epithelial+cells+involving+EGF+receptor+and+MAP+kinases+activation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation.</a> PLoS One. 12 (2), e0172574(2017).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J Biomed Sci. 17, 36(2010).</li>
<li>Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+tissue+culture+coating+substrates+on+prostate+cancer+cell+adherence%2C+morphology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior.</a> PLoS One. 9 (11), e112122(2014).</li>
<li>Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta-independent+shuttling+of+Smad4+between+the+cytoplasm+and+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus.</a> Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).</li>
<li>Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+and+cytokines+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+repair+and+regeneration%3A+official+publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Growth factors and cytokines in wound healing.</a> Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).</li>
<li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+wound+repair%3A+Are+they+cutting+it%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of wound repair: Are they cutting it?</a> Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="https://search.proquest.com/openview/50d2937ff21b6f438b4d7d0ce03f4186/1?pq-origsite=gscholar&cbl=40569">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li>
<li>Insausti, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+induces+epithelialization+in+massive+posttraumatic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds.</a> Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+in+G0%2FG1+phase+by+contact+inhibition+and+TGF-beta+1+in+mink+Mv1Lu+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells.</a> Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).</li>
<li>Boukamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li>
<li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarshall%2C+J+%22Cell+Migration%3A+Developmental+Methods+and+Protocols%22">Cell Migration: Developmental Methods and Protocols</a>. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).</li>
<li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2214030116300074">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li>
<li>Szybalski, W., Iyer, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinking+of+DNA+by+Enzymatically+or+Chemically+Activated+Mitomycins+and+Porfiromycins%2C+Bifunctionally+%22Alkylating%22+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics.</a> Fed Proc. 23, 946-957 (1964).</li>
<li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C%3A+small%2C+fast+and+deadly+%28but+very+selective%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).</li>
<li>Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+using+silicone+elastomer+masks+for+quantitative+analysis+of+cell+migration+without+cellular+damage+or+substrate+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption.</a> Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).</li>
<li>Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phospholipase+in+generating+lipid+second+messengers+in+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction.</a> FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).</li>
<li>Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+into+a+wounded+area+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration into a wounded area in vitro.</a> Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Auf Haut oder Schleimhaut-Störungen wird die Barrierefunktion durch die Aktionen der zahlreichen Zelltypen, einschließlich Fibroblasten oder epithelialen und immune Zellen wiederhergestellt. Gemeinsam, diese Zellen durchlaufen einen komplexen Prozess mit Apoptose, Proliferation, Differenzierung und allem, Fibroblasten und epithelialen Zell-Migration, die die ultimative Mechanismus für die Wiederherstellung des gestörten Gewebes verantwortlich ist und die Schließung der oberflächlichen Epithelzellen Lücke<sup class="xref"...

Zellmigration ist erforderlich für die Wundheilung, da es für die endgültige Schließung der epithelialen Lücke und Wiederherstellung der gestörten Oberfläche1verantwortlich ist. Durchführung von künstlichen Wunden in Tiermodellen ermöglicht für die Replikation von diesem komplexen Prozess in in der Nähe von physiologischen Bedingungen2. Dieser Ansatz führt jedoch oft kostspieligen und komplizierten experimentellen Verfahren, die Präzision für die Untersuchung von unterschiedliche Prozesse, aufgrund der komplizierten Natur der Wundheilung Prozess möglicherweise fehlt.
In-vitro- Kultur von epithelialen Zelllinien bietet eine hilfreiche Alternative zu Tiermodelle zur Erforschung der Rolle von diesen Zellen in Wundheilung und die Auswirkungen der Behandlung auf Zelle Wanderungsverhalten. Die Physiologie der Epithelzellen wird oft von molekularen Techniken mit nicht-Zusammenfluss Kulturen3,4,5,6untersucht; die Störung der Epithel Integrität wird jedoch in der Regel durch feine mechanische Ritzlinien erreicht. In der Zellkultur impliziert dies, dass die Wunde Lücke zu vernachlässigende Zahl von Zellen ausgesetzt sein kann, und sie eine zu kleine Probe für molekularbiologische Techniken stellen. Jedoch können diese Läsionen auf der mikroskopischen Skala, unter Ausnutzung der angeborenen wandernden Eigenschaften einige epithelialen Zell-Linien wie die Mink Lunge Epithelzelle (Mv1Lu) oder die Zelle spontan verewigt menschlichen Keratinozyten (HaCaT) untersucht werden Linien.
Hier haben wir eine Methode für die Mikroskopie, die geeignet ist, quantitative Daten über die Migration von Epithelzellen im Rahmen der Wundheilung3,4,7,8. Darüber hinaus präsentieren wir weitere Methoden, die hilfreich sind, qualitativ molekulare und morphologische Veränderungen auf epithelialen Monolagen während der Migration zu studieren. Insgesamt bieten diese Methoden einen Rahmen um die Dynamik und die morphologischen Veränderungen Epithelzelle Verhalten und Reaktion auf Behandlungen mit einbezogen bei der Wundheilung zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, Frankreich</td><td>L0102-500</td><td>Optionaler Zuschlag von 10 % FBS</td></tr><tr><td>Eagles' s Minimum Essential Medium (EMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12 -662F</td><td>Optionales 10 % FBS-Supplement</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Anwendung bei 2 mM</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA</td><td>DE17603A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>T4049</td> Nach <td>Bedarf verdünnen</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (10x)</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>14200-067</td><td>Verdünnung auf 1x</td></tr><tr><td>24-Well-Kulturplatten</td><td>BD FALCON//SARSTED</td><td>734-0020</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatten</td><td>SARSTEDT</td><td>83-3920</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>E9644</td><td>Gebraucht 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Rundes Deckglas</td><td>MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>MENZCB00120RA020</td><td>KURZE SCHÄRFENTIEFE</td></tr><tr><td>Verstärkte Rasierklinge Nr. 743</td><td>Martor (durch VWR)</td><td>MARO743.50</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l sterile Aerosol-Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>732-0541</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; l sterile Aerosol-Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>732-0528</td><td></td></tr><tr><td>Digitalkamera gekoppeltes Phasenkontrastmikroskop</td><td>Motic Spain</td><td>Moticam Kamera 2300 3,0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>ZEISS Microimaging, Deutschland</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Kulturschale</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen polyklonaler Anti-c-Jun-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-1694</td><td>Gebraucht 1:100</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen IgG (polyklonale Ziege) AF 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Gebraucht 1:400</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>14530</td><td>Verwendet 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin (in Methanol) (rot)</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>Verwendet 1:100</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>SC-2323</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Magermilch</td><td>BD DIFCO</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>Release 1.50i</td><td></td></tr><tr><td>Zen LSM 510 Bildverarbeitungssoftware</td><td>ZEISS Microimaging, Deutschland</td><td>Release 5.0 SP 1.1</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopie-basierten methoden für die beurteilung der epithelzelle migration bei der in-vitro- wundheilung

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Zellmigration ist obligatorisch für die Wundheilung. Erstellen von künstlichen Wunden an Tiermodellen Forschung führt oft zu teure und komplizierte experimentelle Verfahren, während möglicherweise fehlt in der Präzision. In-vitro- Kultur von epithelialen Zelllinien bietet eine geeignete Plattform für die Erforschung der Zelle Wanderungsverhalten der Wundheilung und die Auswirkungen der Behandlungen auf diese Zellen. Die Physiologie der Epithelzellen ist oft in nicht-Zusammenfluss Bedingungen untersucht; jedoch kann dieser Ansatz nicht natürliche Wundheilung Bedingungen ähneln. Stören die Epithel-Integrität mit mechanischen Mitteln erzeugt ein realistisches Modell, aber die Anwendung molekularer Verfahren behindern kann. Infolgedessen Mikroskopiertechniken basierend sind optimal für das Studium Epithelzelle Migration in-vitro-. Hier zeigen wir zwei spezifische Methoden, die künstliche Wunde kratzen Assay und der künstlichen Migration vorderen Assay, die quantitative und qualitative Daten über die wandernden Leistung von Epithelzellen bzw. erhalten können.

Künstliche Wunde kratzen Assay für Quantitative Studien: Bewertung der epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) Förderung der Migration:
EGF ist ein bekannter Induktor von epithelialen Zellen Proliferation und Migration und damit eine Positivkontrolle zur Quantifizierung der Migration Förderung. Mv1Lu und HaCaT Zelle Monolagen dienten in der Wunde kratzen Assays und Vorbehandlung Bilder stammen. Nach der Inokulation mit 10 ng/mL EGF wurde...

Dieses Manuskript wird beschrieben, wie Schnitt-ähnliche Läsionen am kultivierten Epithelzelle Monolagen günstig Modell Heilung in-vitro-, so dass für die Bildgebung durch konfokale gewickelt oder laser-scanning-Mikroskopie, und die bieten qualitativ hochwertige quantitative und qualitative Daten für das Studium Zelle Verhalten und die Mechanismen, die bei der Migration.

Mikroskopie-basierten Methoden für die Beurteilung der Epithelzelle Migration bei der In-vitro- Wundheilung

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren zur künstlichen Verwundung von Epithelzellkulturen ist es, die Zellmigration sowohl aus quantitativer als auch aus qualitativer Perspektive zu untersuchen, um die Auswirkungen spezifischer Behandlungen auf die Wundheilung beurteilen zu können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Wundheilung zu beantworten, da sie eine genaue Charakterisierung der Rolle spezifischer Migrationsprozesse während der Epithelstörung ermöglicht. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er die Korrelation von Zellmigrationsmessungen mit Veränderungen im Verhalten relevanter molekularer Marker ermöglicht.Die Implikation dieser Techniken erstreckt sich auch auf die Therapie klinischer Wunden, da sie ein bequemes Setup für frühe Medikamententests und für den Wundverschluss bietet. Im Allgemeinen wird mit dieser Methode begonnen, da es schwierig ist, eine konsistente Reproduzierbarkeit in den Wunden mit einer Generation zu erreichen. Für einen künstlichen Wundkratztest beginnen Sie damit, jede Vertiefung einer Kulturplatte mit zwei Millilitern Epithelzellen von Interesse in vollständigem Medium zu bepflanzen.Kultivieren Sie die Zellen be

microscopy-based-methods-for-assessment-epithelial-cell-migration

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Häufig verwendet werden, sind sehr zugänglich Methoden zur Untersuchung der Zellmigration und Invasion in vitro beschrieben. Das erste Verfahren ist die Zelle Wundverschluss Assay misst die Zellbeweglichkeit. Die zweite Methode ist die Transwell-Migration und Invasion Assay, der die chemotaktische und invasive Kapazität der Zellen beurteilt.

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Die Zellmigration ist ein biologisches Phänomen, das in einer Vielzahl von physiologischen beteiligt ist, wie der Wundheilung und Immunreaktionen und pathophysiologischen Prozessen, wie Krebs. Die 3D-Kollagen-Matrix Migrationstest ist ein vielseitiges Werkzeug, um die Migrationseigenschaften der verschiedenen Zelltypen innerhalb in einer 3D-physiologischen Umgebung wie zu analysieren.

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

Die Untersuchung der frühen Migration von Endothelzellen (EEC) ist wichtig, um die Pathophysiologie bestimmter Krankheiten zu verstehen und möglicherweise neue Strategien für therapeutische Interventionen zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt Techniken zur Beurteilung der Zellmigration, die für die Untersuchung von EEC angepasst wurden.

Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Pro und anti migratory Faktoren auf Zellwanderung innerhalb einer dreidimensionalen Fibrin-Matrix bewerten.

Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Hier präsentieren wir Ihnen die Echtzeit-Überwachung der Zellwanderung in einem Wundheilung Assay mit TIP60-abgereicherte MCF10A Brust Epithelzellen. Die Umsetzung des live-Zelle bildgebender Verfahren in unserem Protokoll erlaubt uns, Analyse und Visualisierung von einzelligen Bewegung in Echtzeit und über die Zeit.

Live-Darstellung der Brust Epithelzelle Migration nach der vorübergehenden Erschöpfung der TIP60

Diese Studie berichtet zwei verschiedene Methoden für die Analyse der Zelle Invasion und Migration: Boyden Kammer Assay und der in-vitro- video Mikroskop-basierte Wundheilung Assay. Die Protokolle für diese zwei Experimente werden beschrieben und ihre Vorteile und Nachteile gegenüber.

Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bewertung der Wirkung der Peptide auf die Migration von bronchialen Epithelzellen. Diese Methode ermöglicht die schnelle und hoch reproduzierbare Einholung der quantitativen Daten über die Geschwindigkeit der Zelle Migration und Wunde Schließung.

Eine neuartige In-vitro- Wunde heilende Assay Zellwanderung bewerten

Hier beschreiben wir eine Prozedur, um die Zelle Migration in Vitro mit einer automatisierten optischen Kamera Mikroskop zu testen. Der Scratch-Test hat verbreitet wo die Schließung von Grund auf für einen bestimmten Zeitraum gefolgt ist. Das optische Mikroskop ermöglicht eine zuverlässige und preiswerte Erfassung von Zellmigration.

Scratch-Test für die In-vitro- Prüfung der Zellwanderung mit einer automatisierten optischen Kamera optimiert

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine integrierte Methode untersucht Krebs Zelle Migration und Invasion auf einer einzigen Plattform in Echtzeit und bietet eine leicht reproduzierbare und zeitsparende Option Zelle Mobilität und Morphologie.

Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

Hier stellen wir ein Protokoll für einen In-vitro-Scratch-Assay mit primären Fibroblasten und für einen in vivo Hautwundheilungstest bei Mäusen vor. Beide Assays sind einfache Methoden zur Beurteilung der In-vitro- und In-vivo-Wundheilung.

Scratch Migration Assay und Dorsal Skinfold Kammer für In Vitro und In Vivo Analyse der Wundheilung

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Erzeugung von Wunden im Epithel einer lebenden Clytia hemisphaerica medusa und zur Abbildung der Wundheilung mit hoher Auflösung in vivo. Darüber hinaus wird eine Technik vorgestellt, mit der Farbstoffe und Medikamente eingesetzt werden können, um Signalprozesse in den Epithelzellen und der extrazellulären Matrix während der Wundheilung zu stören.

Charakterisierung der epithelialen Wundheilung in vivo am Nesseltier-Modellorganismus Clytia hemisphaerica

Erfahren Sie mikroskopiebasierte Methoden zur Bewertung der Epithelzellmigration bei der In-vitro-Wundheilung. Diese Technik ermöglicht quantitative und qualitative Analysen für die frühe Arzneimittelprüfung.

Mikroskopie-basierten Methoden für die Beurteilung der Epithelzelle Migration bei der In-vitro- Wundheilung

Weitere Videos entdecken