Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die beiden Assays, die zur Untersuchung der Zellinvasion und -migration verwendet werden, den Boyden-Kammer-Assay und einen optimierten In-vitro-Videomikroskop-basierten Kratzwunden-Assay, zu berichten und zu vergleichen. Diese Experimente können helfen, Schlüsselfragen im Untersuchungsfeld von Invasion und Migration zu beantworten, wie z.B. die Wahl der relevantesten Methode. Der Hauptvorteil dieses optimierten in vitro Videomikroskopie-basierten Scratch-Wund-Assays besteht darin, dass er einen reproduzierbaren und präzisen Vergleich zwischen den Behandlungsbedingungen ermöglicht.

Obwohl diese Methode die Zellmigration und -invasion beurteilen kann, kann sie auch auf andere Studienbereiche wie Heilung oder Geweberegeneration angewendet werden. Bereiten Sie SQ20B-Zellen 72 Stunden vor dem ersten Tag des Assays vor, indem Sie zweimal 10 auf die 1/6-Zellen in 25 Millilitern Kulturmedium in einem 175-Quadratzentimeter-Kolben aussäen. Lassen Sie die Zellen auf 80% Zellkonfluenz bei 37 Grad Celsius wachsen.

Am ersten Tag nach der Trypsinisierung und Zellzählung säen Sie die Zellen in einem 25-Quadratzentimeter-Kolben mit einer Zelldichte von sechs mal 10 auf die 1/5 Zellen in drei Millilitern Kulturmedium für jede zu bewertende Bedingung. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag werden die Zellen ausgehungert, indem das Medium in jedem Kolben durch drei Milliliter Rinderserummedium mit niedrigem Gehalt ersetzt wird.

Lassen Sie die Zellen im 37 Grad Celsius heißen Inkubator 24 Stunden lang hungern. Für den Invasionsassay bereiten Sie die beschichteten Boyden-Kammern 12 Stunden nach Beginn des Zellhungers vor. Platzieren Sie jede Boyden-Kammer in der Begleitplatte.

Geben Sie 500 Mikroliter Hungerzellmedium in jede beschichtete Kammer. Verwenden Sie am nächsten Tag, dem dritten Tag, die Begleitplatte, um den Chemolockstoff vorzubereiten. Füllen Sie jede Vertiefung der 24-Well-Begleitplatte mit 750 Mikrolitern Komplettmedium mit 10 % FBS, Hydrocortison, Penicillin und Streptomycin.

Übertragen Sie die obere Kammer in die vorgefüllte Begleitplatte, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen. Für den Invasionsassay entfernen Sie vorsichtig 450 Mikroliter Kulturmedium aus jeder Boyden-Kammer. Nach der Trypsinisierung und Zählung der ausgehungerten SQ20B-Zellen dreimal 10 auf die 1/4 Zellen in 500 Mikroliter 0,1% BSA-Medium aussäen, was eine abschließende Verdünnung von sechsmal 10 auf die 1/4 Zellen pro Milliliter ergibt.

Stellen Sie die Boyden-Kammer für 24 Stunden in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Entfernen Sie am vierten Tag jeden Einsatz von der Begleitplatte und entfernen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Wattestäbchen aus der oberen Kammer. Anschließend fixieren und färben Sie jede Einlage einzeln, um eine May-Grunwald Giemsa-Färbung mit einem Färbeset gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erhalten.

Führen Sie am fünften Tag eine mikroskopische Analyse durch. Setzen Sie die Begleitplatte mit den Einsätzen in ein 20-faches Phasenkontrastmikroskop ein und zählen Sie jede migrierte Zelle im unteren Teil der Membran. 72 Stunden vor dem Tag wird eine der Assays zweimal 10 zu 1/6 SQ20B-Zellen in 25 Milliliter Kulturmedium in einen 175 Quadratzentimeter großen Kolben gesät und die Zellen auf 80% Zellkonfluenz wachsen lassen.

Am ersten Tag nach der Trypsinisierung und Zellzählung wird eine vorverdünnte Probe der SQ20B-Zellen mit einer Dichte von viermal 10 bis 1/5 Zellen pro Milliliter erzeugt. Geben Sie 100 Mikroliter der Zelllösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, um den 1/4 Zellen pro 100 Mikroliter in jeder Vertiefung eine endgültige Dichte von viermal 10 zu geben. Legen Sie die Platte in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator und lassen Sie die Zellen 12 bis 16 Stunden lang an der Platte haften.

Am nächsten Tag bringen Sie die Platte zur Haube, um sie mit einem handelsüblichen Aufwickelgerät zu verwunden. Entfernen Sie die Oberseite des Wundmachers und legen Sie ihn in die Waschbootlösung. Setzen Sie die Platte in den Grundplattenhalter ein und entfernen Sie die Plattenabdeckung.

Tauschen Sie den Stiftblock aus, indem Sie die hinteren Dübel des Stiftblocks in die hinteren Löcher der Grundplatte führen. Halten Sie den schwarzen Hebel gedrückt und heben Sie den Stiftblock an, während Sie den schwarzen Hebel weiterhin gedrückt halten. Entfernen Sie mit einer Pipette mit einer angepassten konischen Spitze sofort das Medium aus jeder Vertiefung und achten Sie darauf, die Wunde nicht zu berühren.

Waschen Sie die Zellen, indem Sie in jede Vertiefung 100 Mikroliter auf 37 Grad Celsius erwärmtes Zellmedium geben. Nach dem zweiten Waschen verwenden Sie eine Pipette mit einer angepassten konischen Spitze, um das Zellmedium abzusaugen. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Medium, das für jede Behandlungsbedingung spezifisch ist, in jede Vertiefung und achten Sie darauf, dass keine Blasen in den Vertiefungen entstehen.

Setzen Sie die 96-Well-Platte in das dafür vorgesehene Rack des Videomikroskops ein. Mit der Videomikroskop-Software können Sie den Zeitplan für Scans bei einem Bild pro Vertiefung programmieren. Für ein Migrationsinvasionsexperiment ist ein Intervall von maximal zwei Stunden erforderlich.

Wenn das Ziel des Experiments darin besteht, ein Video zu produzieren, wird ein Intervall von maximal 30 Minuten bevorzugt. Überwachen und überprüfen Sie die Zellmigration für mindestens 24 Stunden und bis zu fünf Tage mit einer geeigneten, für jeden Zelltyp angepassten Zellmaske, um die Zellmigration zu analysieren. Um eine Zellmaske zu erhalten, die für jede Zelllinie angepasst ist, generieren Sie eine Zellverarbeitungsdefinition aus der Software unter Verwendung einer bestimmten Zellbildsammlung.

Verfolgen Sie die Kurven und exportieren Sie die Daten in eine Tabelle, die zum Analysieren und Vergleichen der Ergebnisse verwendet werden kann. Zur Vorbereitung des Zellinvasionsassays säen Sie SQ20B-Zellen auf die gleiche Weise wie für den Zellmigrationsassay gezeigt und inkubieren Sie die 96-Well-Platte im Inkubator. Am zweiten Tag des Assays bereiten Sie die extrazelluläre Matrix vor.

Tauen Sie die Matrix vor Gebrauch mindestens 12 Stunden lang bei vier Grad Celsius auf und stellen Sie sicher, dass keine Zuschlagstoffe sichtbar sind. Kühlen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen fünf Minuten lang auf Eis. Verdünnen Sie die Matrix mit auf vier Grad Celsius vorgekühlten konischen Spitzen in den vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen mit auf vier Grad Celsius abgekühltem Zellmedium, um eine Endkonzentration von 300 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten.

Bewahren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit vorverdünnter Matrix bei vier Grad Celsius im Kühlschrank auf. Nehmen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator. Unter der Haube die Wunde mit der handelsüblichen Aufwickelvorrichtung gemäß dem Protokoll des Herstellers herstellen, wie bereits gezeigt.

Verwenden Sie eine Pipette mit einer angepassten konischen Spitze, um das Medium sofort aus jeder Vertiefung zu entfernen, und achten Sie darauf, die Wunde nicht zu berühren. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 100 Mikrolitern Zellmedium, das auf 37 Grad Celsius erwärmt ist. Legen Sie die Platte nach dem zweiten Waschgang fünf Minuten lang auf Eis, um die Temperatur auszugleichen.

Entfernen Sie das kalte Medium aus jeder Vertiefung und achten Sie darauf, vorsichtig vom Rand aus zu pipettieren und die Wunde nicht zu berühren. Mit konischen Spitzen, die bei vier Grad Celsius vorgekühlt sind, 50 Mikroliter vorverdünnte Matrix in jede Vertiefung geben. Stellen Sie die Platte für 30 Minuten in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Nach 30 Minuten geben Sie 100 Mikroliter des angepassten Zellmediums in jede Vertiefung, wie für jede Behandlungsbedingung angegeben. Legen Sie die Platte in das dafür vorgesehene Gestell im Videomikroskop. Programmieren Sie anschließend die Scans und führen Sie eine videomikroskopische Analyse durch, wie sie für den Zellmigrationsassay gezeigt wird.

Repräsentative Ergebnisse einer Boyden-Membran nach Zellfixierung sind dargestellt. Die suboptimale Membran hat Zellcluster auf der Oberseite der Membran und uninterpretierbare Ergebnisse. Im Gegensatz dazu hat die optimale Membran zählbare Zellen im unteren Teil der Membran, die blau gefärbt sind.

Ein optimales Ergebnis des Scratch-Wund-Assays wird durch diese Bilder der Wundheilung zur Stunde Null, 15 Stunden und 30 Stunden veranschaulicht. Die Kriterien für ein Qualitätsexperiment sind eine lineare Wunde, keine Zellfragmente in der Wunde und eine optimale Zellkonfluenz. 90%Konfluenz ist die optimale Zelldichte für den Wundheilungsassay, wie in Panel A gezeigt. Panel C zeigt ein Beispiel für eine niedrige Zelldichte und Panel B zeigt Zellcluster, die durch unzureichendes Waschen des Zellpellets verursacht werden.

Diese grafische Darstellung der Wundheilung, die mit der Videomikroskop-Software erhalten wurde, zeigt die Quantifizierung der Parameter der Wundzellkonfluenz in Abhängigkeit von der Zeit für vier Behandlungsbedingungen. Es wurde beobachtet, dass die Kombinationsbehandlung die Zellmigration signifikant verringert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Zellmigration und den Invasionsprozess bewertet.