Name: Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Erfahren Sie die hochauflösende Mikroskopie zur simultanen Quantifizierung von ROS-Spiegeln und mitochondrialer Morphofunktion in lebenden Zellen. Diese Methode etabliert robuste Redox-Fingerabdrücke für zellbiologische Studien.

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Diese Forschung wurde unterstützt von der Universität Antwerpen (TTBOF/29267, TTBOF/30112), dem Sonderforschungsfonds der Universität Gent (Projekt BOF/11267/09), NB-Photonics (Projektcode 01-MR0110) und der CSBR (Centers for Systems Biology Research) Initiative der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO; Nr.: CSBR09/013V). Teile dieses Manuskripts wurden mit Genehmigung von Springer aus einer anderen Publikation übernommen1. Die Autoren danken Geert Meesen für seine Hilfe beim Weitfeldmikroskop.

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<li>Sieprath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+accumulation+of+prelamin+A+and+depletion+of+lamin+A%2FC+both+cause+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+but+induce+different+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates.</a> Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).</li>
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<li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren geben an, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte gibt. Der entsprechende Autor sorgt auch dafür, dass alle Autoren aufgefordert wurden, alle Interessenkonflikte zu offenbaren.

Dieses Papier beschreibt eine hochauflösende Mikroskopie-Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus und mitochondrialer Morphofunktion in NHDF. Seine Leistung wurde mit einer Fallstudie über SQV-behandelten NHDF nachgewiesen. Die Ergebnisse unterstützen frühere Hinweise aus der Literatur, bei denen nach der Behandlung mit HIV-Protease-Inhibitoren des Typs 1 erhöhte ROS-Spiegel oder mitochondriale Dysfunktion beobachtet wurden, wenn auch in separaten Experimenten 19...

<html> Die Konzentration des intrazellulären ROS wird durch ein dynamisches Zusammenspiel zwischen ROS-produzierenden und ROS-Entschärfungssystemen akribisch reguliert. Ungleichgewicht zwischen den beiden provoziert einen Zustand des oxidativen Stresses. Unter den Hauptquellen der ROS sind Mitochondrien 1 . Angesichts ihrer Rolle bei der Zellatmung sind sie verantwortlich für den Großteil der intrazellulären Superoxid (O 2 • - ) - Moleküle 2 . Dies ergibt sich meist aus Elektronenleckage zu O 2 am Komplex 1 der Elektronentransportkette unter Bedingungen eines starken negativen inneren mitochondrialen Membranpotentials (Δψ m ), dh mitochondrialer Hyperpolarisation. Auf der anderen Seite wurde auch die mitochondriale Depolarisation mit einer erhöhten ROS-Produktion korreliert, die auf mehrere Wirkmechanismen 3 , 4 , 5 ,&gt; 6 , 7 , 8 Darüber hinaus wird durch Redox-Modifikationen in Proteinen der Spalt-Fusions-Maschinerie ROS die mitochondriale Morphologie 9 regulieren. Beispielsweise ist die Fragmentierung mit einer erhöhten ROS-Produktion und Apoptose 10 , 11 korreliert, während filamentöse Mitochondrien mit Nährstoffverhungern und Schutz verbunden sind Mitophagie 12 Angesichts der komplizierten Beziehung zwischen zellulärem ROS und mitochondrialer Morphofunktion sollten beide idealerweise gleichzeitig in lebenden Zellen quantifiziert werden. Um dies genau zu tun, wurde ein hochauflösender Bildgebungsassay auf der Grundlage einer automatisierten Breitfeldmikroskopie und einer Bildanalyse von adhärenten Zellkulturen entwickelt, die mit den Fluoreszenzsonden CM-H 2 DCFDA (ROS) und TMRM (mitochondrialem Δψ m und Morphologie) gefärbt wurden. High-Content-Imaging bezieht sich auf die Extraktion von spAtiotemporell reiche ( dh große Anzahl von beschreibenden Merkmalen) Informationen über zelluläre Phänotypen mit mehreren komplementären Markern und automatisierten Bildanalysen. In Kombination mit automatisierter Mikroskopie können viele Proben parallel ( dh Hochdurchsatz) abgeschirmt werden, wodurch die statistische Kraft des Assays erhöht wird. In der Tat ist ein Hauptbestandteil des Protokolls, dass es die gleichzeitige Quantifizierung von mehreren Parametern in der gleichen Zelle ermöglicht, und dies für eine große Anzahl von Zellen und Bedingungen. Das Protokoll wird in 8 Teile aufgeteilt (im Detail beschrieben im Protokoll): 1) Seeding-Zellen in einer 96-Well-Platte; 2) Vorbereitung von Stammlösungen, Arbeitslösungen und Bildgebungspuffer; 3) Aufstellung des Mikroskops; 4) Beladen der Zellen mit CM-H 2 DCFDA und TMRM; 5) Erste Live-Imaging-Runde zur Messung der basalen ROS-Werte und der mitochondrialen Morphofunktion; 6) Zweite Live-Bildgebung nach Zugabe von tert. -ButylPeroxid (TBHP) zur Messung induzierter ROS-Werte; 7) Automatisierte Bildanalyse; 8) Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Visualisierung. Der Assay wurde ursprünglich für normale menschliche dermale Fibroblasten (NHDF) entwickelt. Da diese Zellen groß und flach sind, eignen sie sich gut zur Beurteilung der mitochondrialen Morphologie in 2D-Weitfeldbildern 13 , 14 . Bei kleineren Modifikationen ist diese Methode jedoch auf andere adhärente Zelltypen anwendbar. Darüber hinaus entspricht neben der Kombination von CM-H 2 DCFDA und TMRM der Workflow einer Vielzahl von fluoreszierenden Farbstoffpaaren mit unterschiedlichen molekularen Spezifitäten 1 , 15 .

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin, Methylester, Perchlorat (TMRM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA (Allgemeiner Indikator für oxidativen Stress)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C6827</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma)Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>MatriPlate 96-Well MicroWell Platte mit Glasboden 630 & micro; L-Schwarz 0,17 mm Low Glass Lidded</td><td>Brooks Life-Science-Systeme</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS ohne Phenolrot 500 mL</td><td>Lonza</td><td>BE10-527F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt mit L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat Bufered Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca und Mg</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 500 mL</td><td>Lonza</td><td>17-737F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versen (EDTA) Lösung</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-166-152</td><td>Antikörper zur Aufnahme von Flat-Field-Bildern</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-546-152</td><td>Antikörper zur Aufnahme von Flat-Field-Bildern</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Unternehmen</td><td><>Katalognummer</strong<></td>strong<td>>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti Eclipse Weitfeldmikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfect Focus System (PFS)</td><td>Nikon</td><td></td><td>hardwarebasiert Autofokus System</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 20X Objektiv</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 mit JOBS Modul</td><td>Nikon</td><td></td><td>Diese Software dient zur Steuerung des Mikroskops und zur Programmierung/Durchführung der automatischen Bildaufnahme Protokoll</td></tr><tr><td>ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RStudio Version 1.0.44</td><td>Rstudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Version 3.3.2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cellular redox profiling mit hochauflösender mikroskopie

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) regulieren essentielle zelluläre Prozesse einschließlich Genexpression, Migration, Differenzierung und Proliferation. Allerdings induzieren übermäßige ROS-Spiegel einen Zustand von oxidativem Stress, der von irreversiblen oxidativen Schäden an DNA, Lipiden und Proteinen begleitet wird. Somit liefert die Quantifizierung von ROS einen direkten Proxy für den zellulären Gesundheitszustand. Da Mitochondrien zu den wichtigsten zellulären Quellen und Zielen von ROS gehören, ist die gemeinsame Analyse der mitochondrialen Funktion und der ROS-Produktion in denselben Zellen entscheidend für ein besseres Verständnis der Zusammenschaltung in pathophysiologischen Bedingungen. Daher wurde für die gleichzeitige Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus, mitochondrialem Membranpotential (ΔΨ m ) und mitochondrialer Morphologie eine hochgradige mikroskopiebasierte Strategie entwickelt. Es basiert auf automatisierte Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse von lebenden adhärenten Zellen, die in Multi-Well-Platten gewachsen sind, und staineD mit den zellpermeablen fluoreszierenden Reportermolekülen CM-H 2 DCFDA (ROS) und TMRM (ΔΨ m und mitochondrialer Morphologie). Im Gegensatz zur Fluorimetrie oder Durchflusszytometrie erlaubt diese Strategie die Quantifizierung von subzellulären Parametern auf der Ebene der einzelnen Zelle mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung, sowohl vor als auch nach der experimentellen Stimulation. Wichtig ist, dass die bildbasierte Natur des Verfahrens die Extraktion von morphologischen Parametern zusätzlich zu den Signalintensitäten ermöglicht. Der kombinierte Feature-Set wird für die explorative und statistische multivariate Datenanalyse verwendet, um Unterschiede zwischen Subpopulationen, Zelltypen und / oder Behandlungen zu erkennen. Hier wird eine detaillierte Beschreibung des Assays gegeben, zusammen mit einem Beispielversuch, das sein Potenzial für eine eindeutige Diskriminierung zwischen zellulären Zuständen nach chemischer Störung beweist.

Der Assay wurde mit mehreren Kontrollversuchen benchmarkiert, deren Ergebnisse in Sieprath et al. 1 In kurzer Zeit wurde die Fluoreszenzantwort von CM-H 2 DCFDA und TMRM auf fremd induzierte Veränderungen in intrazellulärem ROS und Δψ m quantifiziert, um den dynamischen Bereich zu bestimmen. Für CM-H 2 DCFDA zeigte NHDF eine lineare Erhöhung des Fluoreszenzsignals bei der Behandlung mit steigenden Konzentrationen von TBHP ...

Dieses Papier präsentiert einen hochauflösenden Mikroskopie-Workflow zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus sowie mitochondrialem Membranpotential und Morphologie - gemeinsam als mitochondriale Morphofunktion bezeichnet - in lebenden adhärenten Zellen unter Verwendung der zellpermeablen fluoreszierenden Reportermoleküle 5- (und- 6) -chlormethyl-2 &#39;, 7&#39;-dichlordihydrofluoresceindiacetat, Acetylester (CM-H 2 DCFDA) und Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM).

Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Das übergeordnete Ziel dieser mikroskopiebasierten Methode mit hohem Informationsgehalt besteht darin, die mitochondriale Morphofunktion und die zellulären Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies gleichzeitig zu quantifizieren, um so einen robusten Redox-Fingerabdruck für Zelllinien zu etablieren, die unterschiedlichen experimentellen Einflüssen ausgesetzt wurden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Redoxbiologie zu beantworten, beispielsweise, ob pathogene Bedingungen oder Behandlungen mit Wirkstoffen oxidativen Stress hervorrufen und inwieweit die mitochondriale Form und Funktion beeinträchtigt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass alle Parameter innerhalb derselben Zelle gleichzeitig gemessen werden können.Um das Verfahren zu beginnen, säen Sie acht bis 10.000 humane dermale Fibroblasten in 60 innere Vertiefungen einer schwarzen 96-Loch-Platte mit einem dünnen, durchgängigen Boden aus Polystyrol oder Glas aus. Wenn verschiedene Bedingungen, Behandlungen oder Zelllinien verwendet werden, verteilen Sie die Aussaatstellen homogen auf der Platte, um Platten-Effekte zu minimieren. Säen Sie anschließend weitere acht bis 10.000 Zellen in Vertiefung B0

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Reaktive Sauerstoffspezies Niveau angehoben wird, wenn Zellen begegnen Stressbedingungen. Hier zeigen wir das Beispiel von 3'-3 'Diaminobenzidin-Färbung sowie cysTMT Kennzeichnung und Massenspektrometrie, um die Redox-Proteom im...

Profiling Thiolredox Proteome Mit Isotopen-Massenspektrometrie Tagging

Quelle: Katsalifis, A., et al. Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Bildgebung des mitochondrialen Redoxzustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Fluoreszenzindikators. Durch Anlegen von zwei Anregungswellenlängen unter einem Fluoreszenzmikroskop wird das Fluoreszenzintensitätsverhältnis gemessen, um die mitochondriale Oxidation zu...

Abbildung des mitochondrialen Redoxzustands in primären Neuronen mit Hilfe eines ratiometrischen Indikators

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von genetisch codierte Fluorogenic Reporter in einer live Cell Imaging-Anwendung für die Prüfung der Harnblase-induzierten oxidativen Stress. Diese experimentelle Ansatz bietet unvergleichliche räumlich-zeitliche Auflösung, Sensitivität und Spezifität vieler die Unzulänglichkeiten der konventionellen Methoden zur Erkennung von toxikologischen oxidativen Stress zu vermeiden.

Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der gesamten ulzellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit 2',7'--Dichlordihydrofluorescein-Diaacetat (DCFH-DA) vor. Diese Methode kann die zelluläre ROS-Lokalisierung in anhaftenden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisieren und die ROS-Intensität mit einem Fluoreszenzplattenleser quantifizieren. Dieses Protokoll ist einfach, effizient und kostengünstig.

Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies insgesamt in anhaftenden Zellen durch 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat-Färbung

Dieses Protokoll beschreibt die Bewertung des subzellulären Kompartiment-spezifischen Redoxstatus innerhalb der Zelle. Eine redoxempfindliche Fluoreszenzsonde ermöglicht eine komfortable ratiometrische Analyse in intakten Zellen.

Bewertung der zellulären Oxidation mit einem subzellulären Kompartiment-spezifischeredox-sensitivegrüne fluoreszierende Protein

Wir beschreiben Protokolle zur Messung von pH-Wert, oxidativen Ereignissen und Proteinverdauung in einzelnen Makropinosomen in lebenden Zellen. Ein Schwerpunkt liegt auf der dualen fluorophoren ratiometrischen Mikroskopie und den Vorteilen, die sie gegenüber populationsbasierten Techniken bietet.

Messung des pH-Werts, der Redoxchemie und der abbauenden Kapazität von Makropinosomen mit Hilfe der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Mikroskopie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung von Unterschieden im basalen Redoxzustand und in den Redoxreaktionen auf akute Störungen in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen unter Verwendung der konfokalen Live-Mikroskopie. Das Protokoll kann mit minimalen Modifikationen auf andere Zelltypen und Mikroskope angewendet werden.

Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators

Dieses Protokoll beschreibt die Fluoreszenzbildgebung und Analyse der endogenen metabolischen Coenzyme, des reduzierten Nicotinamidadenins (Phosphat) -Dinukleotids (NAD (P) H) und des oxidierten Flavinadenindinukleotids (FAD). Die Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD bietet eine markierungsfreie, zerstörungsfreie Methode zur Beurteilung des Zellstoffwechsels.

Autofluoreszenzbildgebung zur Beurteilung des Zellstoffwechsels

Hier schlagen wir ein systematisiertes, zugängliches und reproduzierbares Protokoll vor, um zelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung einer 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde (DCFH-DA) in Müller-Gliazellen (MGCs) nachzuweisen. Diese Methode quantifiziert die gesamten zellulären ROS-Spiegel mit einem Durchflusszytometer. Dieses Protokoll ist sehr einfach zu bedienen, geeignet und reproduzierbar.

Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde und Durchflusszytometrie in Müller-Gliazellen

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE) als Fluoreszenzfarbstoffsonde unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Screening-Ansatzes. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur quantitativen Beurteilung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den drei verschiedenen hepatozellulären Karzinomzelllinien.

Hochdurchsatz-Screening-Bewertung der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) mit Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff

Unter Verwendung einer multimodalen Plattform, die markierungsfreie optische Bildgebungsmodalitäten kombiniert, haben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik und des Stoffwechsels entwickelt. Durch Bildgebung mittels Multiphotonenfluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen und stimulierte Raman-Streumikroskopie können wir einen ganzheitlichen Überblick über die zelluläre und molekulare Umgebung erhalten.

Multimodale optische Bildgebungsplattform zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels

Erfahren Sie die hochauflösende Mikroskopie zur simultanen Quantifizierung von ROS-Spiegeln und mitochondrialer Morphofunktion in lebenden Zellen. Diese Methode etabliert robuste Redox-Fingerabdrücke für zellbiologische Studien.

Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie

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