Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieser mikroskopiebasierten Methode mit hohem Informationsgehalt besteht darin, die mitochondriale Morphofunktion und die zellulären Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies gleichzeitig zu quantifizieren, um so einen robusten Redox-Fingerabdruck für Zelllinien zu etablieren, die unterschiedlichen experimentellen Einflüssen ausgesetzt wurden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Redoxbiologie zu beantworten, beispielsweise, ob pathogene Bedingungen oder Behandlungen mit Wirkstoffen oxidativen Stress hervorrufen und inwieweit die mitochondriale Form und Funktion beeinträchtigt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass alle Parameter innerhalb derselben Zelle gleichzeitig gemessen werden können.

Um das Verfahren zu beginnen, säen Sie acht bis 10.000 humane dermale Fibroblasten in 60 innere Vertiefungen einer schwarzen 96-Loch-Platte mit einem dünnen, durchgängigen Boden aus Polystyrol oder Glas aus. Wenn verschiedene Bedingungen, Behandlungen oder Zelllinien verwendet werden, verteilen Sie die Aussaatstellen homogen auf der Platte, um Platten-Effekte zu minimieren. Säen Sie anschließend weitere acht bis 10.000 Zellen in Vertiefung B01 aus, die zur Fokusjustierung verwendet wird.

Füllen Sie anschließend die leeren äußeren Vertiefungen mit Medium, um die Gradienten zwischen den Vertiefungen und der Umgebung zu minimieren. Klopfen Sie vorsichtig dreimal auf die Platte, bevor Sie sie wieder in den Inkubator stellen, um ein Wachstum der Zellen in Flecken zu vermeiden. Kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden oder bis sie eine Konfluenz von 70 % erreichen.

Anschließend speichern Sie die Behandlungsinformationen für das Experiment in einer Tabellenkalkulation mit dem Namen Setup. Um das Mikroskop einzurichten, kalibrieren Sie zuerst den XY-Stage mithilfe der Software. Erstellen Sie danach ein Bildaufnahmeprotokoll für eine Mehrfach-Well-Platte unter Verwendung der Aufnahmesoftware.

Dieses Protokoll ermöglicht die automatische Erfassung festgelegter Positionen und ausgewählter Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Wählen Sie nun den korrekten Typ der Mehrfach-Loch-Platte aus einer Liste verfügbarer Platten aus, die in der Software bereitgestellt wird. Alternativ definieren Sie das Format der Mehrfach-Loch-Platte anhand der Platten- und Vertiefungsabmessungen.

Danach richten Sie die Mikrotiterplatte aus, indem Sie zwei Ecken der vier äußeren Eck-Wellen definieren. Anschließend wählen Sie die Wellen aus, die aufgenommen werden sollen, und definieren ein Aufnahmeprotokoll, das aus einer sequenziellen Wellenlängenaufnahme besteht. Stellen Sie sicher, dass der GFP-Kanal zuerst eingestellt ist.

Definieren Sie anschließend eine Mehrfachbrunnenplatte-Schleife, um vier gleichmäßig verteilte, sich nicht überlappende Bilder zu erfassen, die um das Zentrum jedes ausgewählten Wells positioniert sind, unter Verwendung des definierten Erfassungsprotokolls. Bereiten Sie in diesem Schritt die Färbelösung für 60 Wells vor, indem Sie die CM-H2DCFDA- und TMRM-Stammlösung zum HBSS-HEPES-Puffer hinzufügen. Entsorgen Sie danach das Kulturmedium der Zellen, indem Sie die Platte in einer einzigen fließenden Bewegung umdrehen.

Waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit HH-Puffer. Vergessen Sie dabei nicht die Vertiefung A01 mit den Zellen, die zur Fokuseinstellung verwendet wurden. Entsorgen Sie den HH-Puffer zwischen den Waschschritten.

Beladen Sie dann die Zellen mit CM-H2DCFDA und TMRM, indem Sie 100 Mikroliter der Färbelösung in jedes Loch geben. Vergessen Sie erneut nicht das Loch A01. Inkubieren Sie die Zellen 25 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Nach 25 Minuten die Zellen zweimal mit je 100 Mikrolitern HH-Puffer waschen und 100 Mikrolitern HH-Puffer zu allen 60 inneren Vertiefungen hinzufügen. Um die eigentliche Messung durchzuführen, die Platte am Mikroskop installieren. Anschließend das hardwarebasierte Autofokussystem einschalten und den Autofokus-Offset unter Verwendung der Vertiefung B01 und des TMRM-Kanals so justieren, bis ein scharfes Bild vorliegt.

Im Anschluss das Bildgebungsprotokoll durchführen. Der resultierende Bilddatensatz liefert Informationen über die basalen ROS-Spiegel, das mitochondriale Membranpotenzial und die mitochondriale Morphologie. Danach, um die induzierten ROS-Spiegel zu messen, die 96-Loch-Platte vorsichtig vom Mikroskop entfernen.

Fügen Sie 100 Mikroliter TBHP-Lösung mit einer Konzentration von 40 Mikromolar zu jedem Loch hinzu und warten Sie mindestens drei Minuten, um die vollständige Reaktion von TBHP mit CM-H2DCFDA zu ermöglichen. Fügen Sie währenddessen 100 Mikroliter der Antikörper-Arbeitslösung zu Loch A01 hinzu. Bringen Sie nun die Platte erneut am Mikroskop an und überprüfen Sie den Fokus erneut mithilfe von Loch B01.

Erwerben Sie anschließend dieselben Positionen wie in der ersten Bildaufnahmerunde unter Verwendung desselben Bildaufnahmeprotokolls. Der resultierende Bilddatensatz liefert Informationen über die induzierten ROS-Spiegel. Danach erwerben Sie Flachfeldbilder in der Vertiefung A01.

Stellen Sie sicher, dass die Signale gut innerhalb des dynamischen Bereichs liegen, indem Sie die Aufnahmeeinstellungen anpassen. Exportieren Sie anschließend die erfassten Datensätze in einem einzelnen Ordner als separate TIFF-Dateien unter Verwendung einer standardisierten Nomenklatur.

Das beinhaltet die Angabe der Platte, vor oder nach TBHP-Behandlung, der Vertiefung, des Bildfelds und des Kanals, getrennt durch Unterstriche. Speichern Sie die Flat-Field-Bilder außerdem im selben Ordner als einzelne TIFF-Dateien unter Verwendung der standardisierten Nomenklatur. Öffnen Sie in diesem Schritt die Bildverarbeitungssoftware und installieren Sie das Makroset für Redox-Metrik.

Öffnen Sie dann die Einrichtungsoberfläche, um die Analyseneinstellungen festzulegen, indem Sie auf die Schaltfläche S klicken. Wählen Sie den Bildtyp, die Anzahl der Kanäle und die Vertiefung aus, die zur Aufnahme der Flachfeldbilder verwendet wurde. Danach geben Sie an, in welchem Kanal sich die Zellen oder Mitochondrien befinden.

Wählen Sie die Kontrollkästchen „Hintergrund überprüfen“ und „Verbesserung“ aus, um jeweils die Hintergrundsubtraktion und die kontrastbegrenzte adaptive Histogramm-Equalisierung durchzuführen. Definieren Sie anschließend eine Sigma-Werte für die Gaußsche Glättung der Zellen und die Laplace-Verbesserung der Mitochondrien. Wählen Sie einen automatischen Schwellwertalgorithmus aus und geben Sie die Größen-Ausschlussgrenzen an.

Testen Sie anschließend die Segmentierungseinstellungen anhand von wenigen ausgewählten Bildern der erfassten Datensätze, indem Sie diese öffnen und im Menü jeweils den C- oder M-Knopf für die Zell- bzw. Mitochondrien-Segmentierung anklicken. Danach führen Sie die Batch-Analyse für den gewünschten Ordner durch, indem Sie auf den Raute-Knopf klicken und den Ordner mit den Bildern auswählen. Überprüfen Sie die Einstellungen und bestätigen Sie mit OK.

Nach der Batch-Analyse die Segmentierungsleistung durch Klicken auf die Schaltfläche V und Auswahl des Ordners mit den Bildern anhand eines Überprüfungsstacks visuell verifizieren. Den Überprüfungsstack durchgehen, um zu bestätigen, ob die Segmentierung erfolgreich war. Die erste Analyse der extrahierten Daten erfolgt automatisch mit einer beiliegenden Shiny-Anwendung.

Dies ermöglicht eine schnelle Interpretation der Ergebnisse. Öffnen Sie zunächst die Anwendung in R Studio und wählen Sie, dass sie in einem externen Browser ausgeführt werden soll.

Auf der Eingabeseite wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem sich die Ergebnisdateien befinden. Stellen Sie sicher, dass sich die Setup-Datei ebenfalls in diesem Verzeichnis befindet. Die Ergebnisdateien und die Setup-Informationen werden automatisch importiert, zusammengestellt und visualisiert.

Die Seite mit dem Versuchsaufbau zeigt den Versuchsablauf. Auf der nächsten Seite werden ROS-Spiegel sowie mehrere mitochondriale Parameter für jede Platte einzeln dargestellt. Wählen Sie mithilfe des Dropdown-Menüs die Platte aus, die Sie visualisieren möchten.

Die Daten werden im Format einer Mehrfach-Well-Platte sowie in Box-Plots mit Ausreißern dargestellt, die mit der Well- und Bildnummer gekennzeichnet sind. Die Ergebnis-Seite des gesamten Experiments zeigt die normalisierten Ergebnisse aller kombinierten Platten zusammen mit einer grundlegenden statistischen Analyse. Falls eine Drop-Datei über die Eingabeseite bereitgestellt wird, werden die angegebenen Datenpunkte ausgeschlossen.

Auf der Seite zur Clusteranalyse wird ein empfindliches Redoxprofil unter Verwendung einer Hauptkomponentenanalyse anhand von Daten aus fünf Parametern erstellt. Schließlich ermöglicht die Seite zum Herunterladen der Daten, die verarbeiteten und neu geordneten Daten für weitere Anwendungen zu speichern. Gezeigt sind hier die Ergebnisse eines Experiments, bei dem humane dermale Fibroblasten mit dem HIV-Proteaseinhibitor Saquinavir behandelt wurden.

Mit dem beschriebenen Protokoll wurde ein signifikanter Anstieg sowohl der basalen als auch der induzierten ROS-Spiegel nachgewiesen. Im Vergleich zu den mit DMSO behandelten Kontrollzellen beeinflusste Saquinavir auch signifikant die mitochondriale Morphofunktion.

Das mitochondriale Membranpotential, gemessen als durchschnittliches TMRM-Signal pro mitochondrialem Pixel, nahm signifikant zu. Zusätzlich entwickelten die Mitochondrien ein stark fragmentiertes Muster, was quantitativ durch eine höhere Rundheit und eine kleinere durchschnittliche Größe einzelner Mitochondrien angezeigt wurde. Bei Kombination der oben genannten Parameter mittels Hauptkomponentenanalyse konnten sowohl die Kontroll- als auch die Saquinavir-Bedingungen anhand ihrer Redox-Fingerabdrücke klar voneinander getrennt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Beleuchtung selbst oxidativen Stress verursacht. Daher sollten die Belichtungsbedingungen minimiert und im gesamten Experiment konstant gehalten werden. Wenn das Verfahren einmal beherrscht ist, können bis zu 20 96-Well-Platten an einem Tag gefärbt und ausgewertet werden.

Nach der zweiten Bildaufnahme können die Zellen fixiert und für eine nachgeschaltete immunfluoreszente Färbung verwendet werden. Dies erhöht die Anzahl der gemessenen Parameter an exakt denselben Zellen und ermöglicht die Beantwortung zusätzlicher Fragestellungen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie in der Lage sein, kombinierte Messungen von ROS und der mitochondrialen Morphofunktion in adhärenten Zellkulturen mittels Hochdurchsatz-Mikroskopie durchzuführen.