Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie

Dieses Papier präsentiert einen hochauflösenden Mikroskopie-Workflow zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus sowie mitochondrialem Membranpotential und Morphologie - gemeinsam als mitochondriale Morphofunktion bezeichnet - in lebenden adhärenten Zellen unter Verwendung der zellpermeablen fluoreszierenden Reportermoleküle 5- (und- 6) -chlormethyl-2 ', 7'-dichlordihydrofluoresceindiacetat, Acetylester (CM-H ₂ DCFDA) und Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM).

Das übergeordnete Ziel dieser auf High-Content-Mikroskopie basierenden Methode ist es, gleichzeitig die mitochondriale Morphofunktion und den zellulären Spiegel reaktiver Sauerstoffspezies zu quantifizieren, um einen robusten Redox-Fingerabdruck für Zelllinien zu erstellen, die verschiedenen experimentellen Störungen ausgesetzt sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Redoxbiologie zu beantworten, z. B. ob pathogene Zustände oder Wirkstoffbehandlungen oxidativen Stress auslösen und inwieweit die Form und Funktion der Mitochondrien beeinflusst wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass alle Parameter gleichzeitig innerhalb derselben Zelle gemessen werden können.

Um das Verfahren zu starten, säen Sie acht bis 10.000 humane dermale Fibroblasten in 60 innere Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte mit einem dünnen, durchgehenden Polystyrol- oder Glasboden. Wenn Sie unterschiedliche Bedingungen, Behandlungen oder Zelllinien verwenden, verteilen Sie ihre Aussaatpositionen homogen auf der Platte, um die Platteneffekte zu minimieren. Säen Sie dann weitere acht bis 10.000 Zellen in Vertiefung B01, die für die Fokuseinstellung verwendet werden.

Füllen Sie anschließend die leeren äußeren Vertiefungen mit Medium, um die Gradienten zwischen den Vertiefungen und der Umgebung zu minimieren. Klopfen Sie dreimal vorsichtig auf die Platte, bevor Sie sie wieder in den Inkubator legen, um zu verhindern, dass die Zellen in Flecken wachsen. Kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden lang oder bis sie eine Konfluenz von 70 % erreichen.

Speichern Sie anschließend die Behandlungsinformationen für das Experiment in einer Tabelle mit dem Namen setup. Um das Mikroskop einzurichten, kalibrieren Sie zunächst den XY-Tisch mit der Software. Erstellen Sie als Nächstes ein Bildgebungsprotokoll für eine Multi-Well-Platte mit der Erfassungssoftware.

Dieses Protokoll ermöglicht die automatische Erfassung von Sollpositionen und ausgewählten Wells einer 96-Well-Platte. Wählen Sie nun den richtigen Typ der Multi-Well-Platte aus einer Liste verfügbarer Platten aus, die in der Software bereitgestellt werden. Alternativ können Sie das Format der Multi-Well-Platte anhand der Platten- und Well-Abmessungen definieren.

Richten Sie dann die Well-Platte aus, indem Sie zwei Ecken der vier äußeren Eck-Wells definieren. Wählen Sie anschließend die Vertiefungen aus, die erfasst werden müssen, und definieren Sie ein Erfassungsprotokoll, das aus einer sequentiellen Wellenlängenerfassung besteht. Stellen Sie sicher, dass der GFP-Kanal zuerst eingestellt ist.

Definieren Sie dann eine Well-Plattenschleife, um vier Bilder in regelmäßigen Abständen ohne Überlappung aufzunehmen, die unter Verwendung des definierten Erfassungsprotokolls um die Mitte jedes ausgewählten Wells herum positioniert sind. Bereiten Sie in diesem Schritt die Färbelösung für 60 Vertiefungen vor, indem Sie CM-H2DCFDA und TMRM-Stammlösung zum HBSS HEPES-Puffer hinzufügen. Entsorgen Sie als Nächstes das Kulturmedium von den Zellen, indem Sie die Platte in einer einzigen fließenden Bewegung auf den Kopf stellen.

Waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit HH-Puffer. Vergessen Sie nicht gut A01 mit den Zellen, die für die Fokuseinstellung verwendet werden. Entsorgen Sie den HH-Puffer zwischen den Waschschritten.

Beladen Sie dann die Zellen mit CM-H2DCFDA und TMRM, indem Sie 100 Mikroliter der Färbelösung in jede Vertiefung geben. Nochmals, vergessen Sie nicht gut A01. Inkubieren Sie die Zellen 25 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Zellen nach 25 Minuten zweimal mit 100 Mikrolitern HH-Puffer und geben Sie 100 Mikroliter HH-Puffer in alle 60 inneren Vertiefungen. Um die eigentliche Messung durchzuführen, installieren Sie die Platte am Mikroskop. Schalten Sie dann das hardwarebasierte Autofokussystem ein und passen Sie den Autofokus-Offset mit Vertiefung B01 und dem TMRM-Kanal an, bis Sie ein scharfes Bild erhalten.

Führen Sie anschließend das Imaging-Protokoll aus. Der resultierende Bilddatensatz wird Informationen über die basalen ROS-Werte, das mitochondriale Membranpotenzial und die mitochondriale Morphologie liefern. Um die induzierten ROS-Spiegel zu messen, nehmen Sie die 96-Well-Platte vorsichtig aus dem Mikroskop.

Geben Sie 100 Mikroliter TBHP-Lösung in einer Dosierung von 40 Mikromolaren in jede Vertiefung und warten Sie mindestens drei Minuten, bis die vollständige Reaktion des TBHP mit dem CM-H2DCFDA möglich ist. Während dieser Zeit werden 100 Mikroliter der Antikörper-Arbeitslösung in die Vertiefung A01 gegeben. Montieren Sie nun die Platte wieder auf das Mikroskop und überprüfen Sie den Fokus erneut mit der Vertiefung B01.

Erfassen Sie dann die gleichen Positionen wie in der ersten Bildgebungsrunde mit demselben Bildgebungsprotokoll. Der resultierende Bilddatensatz wird Aufschluss über die induzierten ROS-Niveaus geben. Nehmen Sie als Nächstes Flat-Field-Bilder in Vertiefung A01 auf.

Stellen Sie sicher, dass die Signale innerhalb des Dynamikbereichs liegen. Indem Sie die Aufnahmeeinstellungen anpassen. Exportieren Sie anschließend die erfassten Datensätze in einem einzigen Ordner als einzelne TIFF-Dateien unter Verwendung einer standardisierten Nomenklatur

Dazu gehört auch der Verweis auf die Platte, die Vor- oder Nach-TBHP-Behandlung, das Bohrloch, das Feld und den Kanal, die durch Unterstriche getrennt sind. Speichern Sie außerdem die Flatfield-Bilder im selben Ordner wie einzelne TIFF-Dateien unter Verwendung der standardisierten Nomenklatur. Öffnen Sie in diesem Schritt die Bildverarbeitungssoftware und installieren Sie das Makroset für Redoxmetriken.

Öffnen Sie dann die Setup-Oberfläche, um die Analyseeinstellungen festzulegen, indem Sie auf die Schaltfläche S klicken. Wählen Sie den Bildtyp, die Anzahl der Kanäle und das Well aus, das für die Erfassung der Flatfield-Bilder verwendet wurde. Geben Sie danach an, welcher Kanal Zellen oder Mitochondrien enthält.

Aktivieren Sie die Kontrollkästchen "Hintergrund" und "Verbessern", um die Hintergrundsubtraktion bzw. die kontrastbegrenzte adaptive Histogramm-Entzerrung durchzuführen. Definieren Sie als Nächstes ein Sigma für Gauß und Unschärfe der Zellen und Laplace-Verstärkung der Mitochondrien. Wählen Sie einen automatischen Schwellenwertalgorithmus aus und geben Sie die Größenausschlussgrenzen ein.

Testen Sie dann die Segmentierungseinstellungen an einigen ausgewählten Bildern der erfassten Datensätze, indem Sie sie öffnen und auf die Schaltflächen C oder M im Menü für die Zell- bzw. Mitochondriensegmentierung klicken. Klicken Sie anschließend bei der Stapelanalyse auf den gewünschten Ordner, indem Sie auf die Rautenschaltfläche klicken und den Ordner mit den Bildern auswählen. Überprüfen Sie die Einstellungen und drücken Sie auf OK.

Überprüfen Sie nach der Batch-Analyse visuell die Segmentierungsleistung auf einem Verifizierungsstack, indem Sie auf die Schaltfläche V klicken und den Ordner mit den Bildern auswählen. Gehen Sie den Verifizierungsstapel durch, um zu bestätigen, ob die Segmentierung erfolgreich war. Die erste Analyse der extrahierten Daten erfolgt automatisch mit einer kostenlosen Shiny-Anwendung.

Dies ermöglicht eine schnelle Interpretation der Ergebnisse. Öffnen Sie zunächst die Anwendung in R Studio. Wählen Sie aus, ob Sie es in einem externen Browser ausführen möchten.

Wählen Sie auf der Eingabeseite das Verzeichnis aus, in dem sich die Ergebnisdateien befinden. Stellen Sie sicher, dass die Setup-Datei auch in diesem Verzeichnis vorhanden ist. Die Ergebnisdateien und Setup-Informationen werden automatisch importiert, kompiliert und visualisiert.

Auf der Seite mit dem Versuchsaufbau wird das Layout des Experiments angezeigt. Auf der nächsten Seite werden die ROS-Spiegel sowie mehrere mitochondriale Parameter für jede Platte separat angezeigt. Wählen Sie die Platte, die Sie visualisieren möchten, über das Dropdown-Menü aus.

Die Daten werden in einem Multi-Well-Plattenformat sowie in Boxplots mit Ausreißern angezeigt, die mit Well- und Bildnummer beschriftet sind. Die Seite mit dem gesamten Experiment zeigt die normierten Ergebnisse aller Platten zusammen, zusammen mit einer grundlegenden statistischen Analyse. Wenn eine Drop-Datei über die Eingabeseite bereitgestellt wird, werden die angegebenen Datenpunkte ausgeschlossen.

Auf der Cluster-Analyseseite wird ein empfindliches Redoxprofil aus einer Hauptkomponente und einer Analyse von Daten aus fünf Parametern erstellt. Schließlich ermöglicht die Download-Datenseite das Speichern der verarbeiteten und neu angeordneten Daten für die weitere Verwendung. Hier sind die Ergebnisse eines Experiments dargestellt, in dem humane dermale Fibroblasten mit dem HIV-Proteasehemmer Saquinavir behandelt wurden.

Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls wurde ein signifikanter Anstieg sowohl der basalen als auch der induzierten ROS-Spiegel festgestellt. Im Vergleich zu den Kontrollzellen, die mit DMSO behandelt wurden. Saquinavir beeinflusste auch signifikant die mitochondriale Morphofunktion.

Das mitochondriale Membranpotential, gemessen als durchschnittliches TMRM-Signal pro mitochondrialem Pixel, stieg signifikant an. Darüber hinaus nahmen die Mitochondrien ein stark fragmentiertes Muster an, was quantitativ durch eine höhere Zirkularität und eine geringere durchschnittliche Größe der einzelnen Mitochondrien angezeigt wird. Bei der Kombination der oben genannten Parameter mittels prinzipieller Komponentenanalyse konnten sowohl die Kontroll- als auch die Saquinavir-Bedingung durch ihre Redox-Fingerabdrücke klar voneinander getrennt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Beleuchtung selbst oxidierten Stress verursacht. Daher sollten die Expositionsbedingungen minimiert und während des gesamten Experiments konstant gehalten werden. Einmal gemeistert, können bis zu 20 96-Well-Platten an einem Tag gefärbt und aufgenommen werden.

Nach der zweiten Bildgebungsrunde können die Zellen fixiert und für eine nachgeschaltete Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden. Dies erhöht die Anzahl der gemessenen Parameter an exakt denselben Zellen und ermöglicht die Beantwortung zusätzlicher Fragen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, die kombinierten Messungen von ROS und mitochondrialer Morphofunktion in adhärenten Zellkulturen mit Hilfe der High-Content-Mikroskopie durchzuführen.