Abbildung des mitochondrialen Redoxzustands in primären Neuronen mit Hilfe eines ratiometrischen Indikators

Nehmen Sie ein Deckglas mit genetisch veränderten Primärneuronen in eine Bildgebungskammer, die mit einem Bildgebungspuffer gefüllt ist.

Diese Zellen exprimieren einen fluoreszierenden Protein-basierten Redoxindikator in der mitochondrialen Matrix.

Positionieren Sie die Kammer unter einem Fluoreszenzmikroskop, identifizieren Sie die Zellen unter sichtbarem Licht und wechseln Sie dann zur Fluoreszenzbildgebung.

Wenden Sie zwei Anregungswellenlängen an, um den Indikator zu stimulieren und die Fluoreszenzemission zu messen.

Das Fluoreszenzintensitätsverhältnis bei diesen Wellenlängen spiegelt die mitochondriale Oxidationsstufe wider.

Führen Sie NMDA ein, um zelluläre NMDA-Rezeptoren zu aktivieren, was zu einem intrazellulären Kalziumeinstrom führt.

Der Anstieg löst die mitochondriale Kalziumaufnahme aus, induziert die ROS-Produktion und die mitochondriale

Oxidation.

Der ROS oxidiert den Indikator, verändert seine Fluoreszenz und erhöht das Signalverhältnis.

Führen Sie Oxidationsmittel ein, um den Indikator vollständig zu oxidieren und das Signalverhältnis zu maximieren.

Entfernen Sie den Puffer und führen Sie dann Reduktionsmittel ein, um den Farbstoff vollständig zu reduzieren und das Signalverhältnis zu minimieren.

Verwenden Sie das maximale und minimale Signalverhältnis, um die NMDA-induzierte mitochondriale Oxidation zu kalibrieren und zu quantifizieren.

Legen Sie für Live-Imaging das Zeitrafferintervall auf 30 Sekunden und die Dauer auf 25 Minuten fest. Montieren Sie dann die Zellen, platzieren Sie die Kammer auf dem Mikroskop und fokussieren Sie die Zellen wie zuvor gezeigt. Wechseln Sie in den Scan-Modus und verwenden Sie den 488-Nanometer-Kanal in der Live-Ansicht, um die Zellen für die Bildgebung zu fokussieren und zu lokalisieren. Um die Anzahl der aufgezeichneten Zellen pro Lauf zu erhöhen, verwenden Sie optional die Multipoint-Funktion, um zwei bis drei Sichtfelder pro Deckglas abzubilden.

Starten Sie die Zeitrafferaufnahme und nehmen Sie fünf Bilder als zweiminütige Basisaufnahme auf. Geben Sie 500 Mikroliter dreifache NMDA-Lösung in die Kammer, um die Endkonzentration von 30 Mikromolaren zu erreichen, und zeichnen Sie weitere 20 Bilder als 10-minütige NMDA-Reaktion auf. Geben Sie als Nächstes 500 Mikroliter vierfache DA-Lösung in die Kammer und nehmen Sie sechs weitere Bilder auf. Saugen Sie den Puffer aus der Bildgebungskammer an und ersetzen Sie ihn durch 1 Milliliter DVB-T-Lösung. Nachdem Sie 10 weitere Bilder aufgenommen haben, beenden Sie die Aufnahme und speichern Sie die Bildserie.